Роль внутриклеточных протеолитических систем в развитии и прогнозе рака эндометрия

На правах рукописи

КОВАЛЬ ВАЛЕРИЯ ДЕНИСОВНА

РОЛЬ ВНУТРИКЛЕТОЧНЫХ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИХ СИСТЕМ В

РАЗВИТИИ И ПРОГНОЗЕ РАКА ЭНДОМЕТРИЯ

14.01.12 – онкология

14.03.03 – патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Томск – 2013

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт онкологии» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук

Научные руководители: доктор медицинских наук, профессор

доктор медицинских наук, профессор

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, ведущий научный сотрудник торакоабдоминального отделения ФГБУ «НИИ онкологии» СО РАМН

доктор медицинских наук, профессор кафедры биохимии и молекулярной биологии ГБОУ ВПО СибГМУ Минздрава России

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Российский онкологический научный центр им. » Российской академии медицинских наук, г. Москва

Защита состоится «__»_____________________ 2013г. в _______часов на заседании диссертационного совета Д001.032.01 при ФГБУ «Научно-исследовательский институт онкологии» СО РАМН ( г. Томск, пер. Кооперативный, 5).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «НИИ онкологии» СО РАМН.

Автореферат разослан «___»______________________2013г.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

доктор медицинских наук, профессор

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Рак эндометрия (РЭ) является наиболее распространенным видом онкогинекологической патологии как в России, так и за рубежом. В России в структуре заболеваемости злокачественными новообразованиями суммарно по всем возрастам РЭ занимает 4-5 место, при этом отмечается увеличение доли заболевших женщин репродуктивного возраста [, 2011].

Большинство исследователей признает клиническую, морфологическую и прогностическую гетерогенность контингента больных РЭ даже в пределах одной стадии и подстадии, что определяет целесообразность выделения при раке тела матки дополнительных факторов неблагоприятного прогноза. Непредсказуемость биологического поведения опухоли даже среди больных с одинаковой распространенностью процесса во многом обусловлено вовлечением в канцерогенез различных молекулярных механизмов. В этой связи в последнее время большое значение придается молекулярным маркерам для прогноза клинического течения новообразований и их исхода. В ряде исследований получены доказательства того, что некоторые иммуногистохимические маркеры являются независимыми прогностическими показателями, в том числе при онкогинекологической патологии. Однако согласованного мнения о прогностической роли иммуногистохимических маркеров при РЭ в литературе нет [, 2010], поэтому проблема поиска новых молекулярных критериев прогноза рака эндометрия требует дальнейшего изучения.

В связи с тем, что социальная значимость РЭ в настоящее время велика, актуальной является также проблема выявления в популяции женщин с высоким онкологическим риском по РЭ, что в конечном итоге представляется адекватным направлением в снижении заболеваемости и смертности от этого заболевания. В первую очередь к этой категории относятся пациентки, страдающие гиперпластическими процессами эндометрия (ГЭ). Несмотря на то, что механизм малигнизации ГЭ на сегодняшний день остается неясным, показано, что вероятность развития РЭ велика у пациенток с атипической гиперплазией (до 40%), в то время как для пациенток с типической гиперплазией такой риск значительно ниже, но все же существует (до 10%) [Lacey J. V., 2008].

Объективных и надежных критериев, позволяющих оценить степень онкологического риска у женщин с ГЭ, существует крайне мало. Большинство из них опираются на клинические данные, и описано крайне мало подходов, основанных на молекулярных и биохимических особенностях ткани [, 2003; , 2010; Burbos N., 2010; Habeeb О., 2010]. Тем не менее, эти подходы имеют ограниченную область применения и широкого применения в практике они не нашли.

Выделение критериев для оценки степени онкологического риска могло бы позволить оптимизировать выбор индивидуальной лечебной тактики и значительно улучшить качество и продолжительность жизни у женщин с ГЭ за счет снижения частоты и объемов хирургического лечения у женщин в постменопаузальном возрасте, уточнения необходимости проведения аблации эндометрия в позднем менопаузальном периоде, а также выявления пациенток с высоким риском развития РЭ и своевременного выполнения им соответствующего лечения.

Теоретической основой разработки критериев для оценки степени онкологического риска и для прогноза течения РЭ может послужить изучение молекулярных механизмов развития гиперпластических процессов и РЭ. В этой связи перспективным является изучение специфических внутриклеточных протеиназ, поскольку известно, что процессы деградации во многом определяют эффективную регуляцию количества и функций многих белков, в том числе ростовых и транскрипционных факторов, участвуют в повышении пролиферативной активности, ингибировании апоптоза, стимуляции неоангиогенеза, функционировании иммунной системы и индукции лекарственной резистентности [, 2008; Edwards D., 2009].

Наиболее значимыми системами специфического внутриклеточного протеолиза являются убиквитин-протеасомная и кальпаиновая, и обе они вовлечены в развитие и прогрессирование опухоли. Показана важная роль убиквитин-протеасомной системы в развитии опухолей различных локализаций [Kitagawa K., 2009].

К субстратам протеасомной и кальпаиновой систем можно отнести и локомоторные белки, в частности актинсвязывающие белки и β-катенин. Изменение их экспрессионного профиля вносит значительный вклад в приобретение клетками способности к движению, определяя инвазивный и метастатический потенциал трансформированной клетки [Van Troys M., 2008]. Протеолитическая регуляция экспрессии этих белков изучена недостаточно. Единичные литературные данные свидетельствуют о том, что некоторые из этих белков являются субстратами для кальпаинов, другие — для протеасом [Heuzé M. L., 2008; Ni X. G., 2008]. Таким образом, экспрессия актинсвязывающих белков и β-катенина и, соответственно, процессы клеточной локомоции могут быть тесно связаны с протеасомной и кальпаиновой активностью.

Учитывая важную роль внутриклеточных протеиназ и локомоторных белков в канцерогенезе и их вероятное участие в прогрессии РЭ, изучение состояния протеасомной и кальпаиновой систем и экспрессии актинсвязывающих белков и β-катенина представляется актуальным и может послужить основой для разработки маркеров, позволяющих прогнозировать течение РЭ и объективно оценивать риск развития РЭ у пациенток, страдающих ГЭ.

Цель исследования: изучение роли внутриклеточных протеолитических систем в развитии и прогнозе рака эндометрия.

Задачи исследования

1.  Изучить активность протеасом, их пулов и субъединичный состав в тканях малигнизированного, неизмененного и гиперплазированного эндометрия.

2.  Определить активность кальпаинов в малигнизированном, неизмененном и гиперплазированном эндометрии.

3.  Изучить экспрессию актинсвязывающих белков (кофилина-1, гельзолина, тимозина ß4, p45-Ser-ß-катенина, Arp3) в ткани рака эндометрия и в гиперплазированном эндометрии.

4.  Оценить связь активности протеасом и кальпаинов с экспрессией актинсвязывающих белков в малигнизированном и гиперплазированном эндометрии.

5.  Проанализировать взаимосвязь исследуемых показателей с клинико-морфологическими параметрами рака эндометрия.

6.  Оценить значимость исследуемых показателей для прогноза течения рака эндометрия.

7.  Создать математическую модель для оценки степени онкологического риска у пациенток с гиперплазией эндометрия на основе определения активности внутриклеточных протеиназ.

Научная новизна

Впервые исследованы активность протеасом и их пулов, а также их субъединичный состав в ткани РЭ и в гиперплазированном эндометрии. Показано усиление протеасом-зависимого протеолиза при РЭ по сравнению с ГЭ с повышением тотальной активности и активности 20S пула. Установлено изменение субъединичного состава протеасом в ткани РЭ как по сравнению с неизмененной тканью, так и по сравнению с гиперплазированным эндометрием. В злокачественной ткани отмечено увеличение количества всех изучаемых субъединиц относительно ГЭ. Получены новые данные о связи активности протеасом с глубиной инвазии опухоли в миометрий.

Приоритетными являются полученные данные о значительном повышении активности кальпаинов при РЭ по сравнению с ГЭ, отмечаемой уже при РЭ Iа стадии, с последующим ростом при увеличении глубины инвазии опухоли в миометрий, что указывает на важную роль кальпаинов в развитии РЭ.

Впервые проанализирована взаимосвязь активности протеасом - и кальпаин-зависимого протеолиза с экспрессией локомоторных белков при РЭ и ГЭ. Показано, что и протеасомы, и кальпаины, вероятно, регулируют содержание ряда актинсвязывающих белков и фракций β-катенина, влияя тем самым на клеточную подвижность.

Впервые изучена прогностическая роль активности внутриклеточных протеиназ в ткани эндометрия для оценки степени онкологического риска у больных с ГЭ и для прогноза течения РЭ.

Теоретическая и практическая значимость

Полученные результаты позволяют расширить представления об особенностях функционирования внутриклеточных протеолитических систем при РЭ и обосновать их патогенетическую значимость в развитии этой патологии.

Представленные в работе данные о выраженных различиях в активности кальпаинов при ГЭ и РЭ, а также о взаимосвязи данного показателя с экспрессией локомоторных белков свидетельствуют об участии кальпаинов в процессах, как происходящих в клетке на ранних этапах возникновения злокачественной опухоли эндометрия, так и при развитии заболевания.

Выявленное изменение активности и субъединичного состава протеасом, установленный факт регуляции ими содержания локомоторных белков углубляют представления о возможных механизмах участия убиквитин-протеасомной системы в развитии РЭ.

Результаты исследования могут быть использованы для предсказания риска возникновения РЭ у женщин с ГЭ, для индивидуализации и оптимизации их лечения, а также послужить дополнительными критериями прогноза течения РЭ. Показано, что тотальная активность протеасом является значимым фактором в отношении 3-летней безрецидивной выживаемости больных РЭ, а экспрессия иммунной субъединицы протеасом LMP2 – 3-летней общей выживаемости. Создана математическая модель для оценки степени онкологического риска у пациенток, страдающих ГЭ, включающая активность кальпаинов, активность тотального пула протеасом, возраст пациентки и активность 26S пула протеасом. Чувствительность разработанной модели составила 77%, специфичность – 100%.

Положения, выносимые на защиту

1. Состояние протеасомной и кальпаиновой систем не одинаково в малигнизированном и гиперплазированном эндометрии. Активность протеасом в злокачественно измененном эндометрии выше, чем в прилегающей неизмененной ткани и в гиперплазированном эндометрии. Изменения активности сопровождаются изменением субъединичного состава протеасом. Активность кальпаинов значительно выше в тканях рака эндометрия, чем в гиперплазированном эндометрии.

2. Корреляционные связи активностей протеасом и кальпаинов с экспрессией актинсвязывающих белков и β-катенина в ткани гиперплазированного и малигнизированного эндометрия дают основание предположить наличие протеолитической регуляции кофилина-1 протеасомами, тимозина β4 и β-катенина протеасомами и кальпаинами.

3. Определение активности протеасом и кальпаинов в ткани гиперплазированного эндометрия дает возможность прогнозирования риска развития рака эндометрия.

Апробация работы

Основные результаты работы доложены на VI-VIII Региональной конференции молодых ученых-онкологов, посвященной памяти академика РАМН «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии» (Томск, ), на XI Всероссийской конференции молодых ученых «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии» (Москва, 2011), на Всероссийской научно-практической конференции «Начальный рак эндометрия» (Москва, 2011), на VI Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Уфа, 2013).

Работа выполнена при поддержке Федеральной целевой прораммы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России на годы» (государственный контракт П320), Российского фонда фундаментальных исследований (№ ).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 16 печатных работ, отражающих основные положения, в том числе 8 статей в рецензируемых отечественных и зарубежных журналах, 7 из которых в изданиях, рекомендованных ВАК.

Личный вклад автора

Анализ литературы по теме диссертации, планирование исследования, определение цели и задач, выбор методов исследования, проведение экспериментального блока настоящей работы, статистический анализ результатов и написание диссертации выполнены лично автором.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, трех глав, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 150 страницах машинописного текста, содержит 15 таблиц и иллюстрирована 16 рисунками. Бибилография включает 214 литературных источников, из которых 24 отечественных и 190 иностранных.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В исследование было включено 153 больных с гиперпластическими процессами и РЭ, обратившихся на консультативный прием и находившихся на стационарном лечении в отделении онкогинекологии с группой профилактики ФГБУ «НИИ онкологии» СО РАМН с 2010 по 2012. В соответствии с международной классификацией FIGO (1988) и классификацией Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) (2003) были сформированы две клинические группы:

I группа: 90 больных РЭ I-III стадии, средний возраст 56,55±10,45 года. Объемы диагностики и лечения больных РЭ соответствовали рекомендуемым алгоритмам объемов диагностики и лечения злокачественных новообразований, утвержденных Министерством здравоохранения РФ. На первом этапе лечения выполнялась операция в различных объемах.

II группа: 63 больных с гиперпластическими процессами эндометрия, средний возраст 50,17±8,60 лет. Все больные с ГЭ получали хирургическое органосохраняющее или органоуносящее лечение. Среди больных II группы 78% имели типическую гиперплазию, 13% – атипическую гиперплазию и 9% — 5 полипы эндометрия.

Работа проведена с соблюдением принципов добровольности и конфиденциальности в соответствии с Основами законодательства РФ об охране здоровья граждан (Указ Президента РФ ), получено разрешение этического комитета института.

Материалом для исследования служили образцы опухолевой и гистологически неизмененной ткани, взятой на расстоянии не менее 1 см от границы опухоли, полученные при выполнении радикального оперативного вмешательства. Образцы гиперплазированного эндометрия получали при выполнении гистероскопии с биопсией или оперативного вмешательства. Весь полученный материал имел гистологическую верификацию. Образцы тканей замораживали и хранили при -80oС.

Для получения осветленных гомогенатов замороженные образцы ткани (100 мг) гомогенизировали в жидком азоте, затем ресуспендировали в 300 мкл 50 мМ трис-HCl буфере (pH=7,5), содержащем 2 мМ АТФ, 5 мМ хлорид магния, 1 мМ дитиотреитол, 1мМ ЭДТА и 100 мМ хлорид натрия. Гомогенат центрифугировали 60 минут при 10000g и 4оС.

Фракционирование протеасом и выделение пулов проводили по методу с соавт. [, 2006]. Фракцию, обогащенную 26S-протеасомами, получали добавлением сульфата аммония до 40% насыщения, 20S-протеасом – до 70% насыщения.

Химотрипсинподобную активность протеасом определяли в осветленных гомогенатах опухолевой, гиперплазированной и неизмененной ткани эндометрия по гидролизу флуорогенного олигопептида Suc-LLVY-AMС (Sigma). Для оценки активности примесных протеаз применяли специфический ингибитор протеасом – MG132 (Sigma).

Экспрессию тотального пула протеасом и субъединиц протеасом в тканях исследовали методом Вестерн-блоттинг с применением первичных антител к субъединицам протеасом и к β-актину, вторичными антителами goat anti-mouse IgG-horseradish peroxidase (HRP) и goat ani-rabbit IgG-HRP (Santa Cruz Biotechnology, США) в разведениях, рекомендованных производителем. Стандартизация проводилась относительно β-актина. Результаты выражали в процентах от содержания субъединиц протеасом в неизмененной ткани.

Определение активности кальпаинов проводили в осветленных гомогенатах по гидролизу Suc-LLVY-AMС с добавлением ингибитора кальпаинов ALLN (Sigma) или ингибитора кальпаина-2 Z-LLY-FMK (Calbiochem). Удельную активность кальпаинов выражали в единицах активности на 1мг белка.

Анализ уровня экспрессии актинсвязывающих белков (Аrp3, гельзолина, кофилина-1, тимозина β4) и p45-Ser-β-катенина проводился методом проточной цитометрии на цитофлюориметре FACS Canto II (Becton Dickinson (BD), США). Образцы малигнизированного и гиперплазированного эндометрия дезинтегрировали на устройстве Medimachine (BD, США) по стандартной методике. Фиксация и пермеабилизация клеток проводилась с помощью набора Cytofix/Cytoperm (BD, США). В качестве первичных антител использовались cytokeratin-18-phycoerythrin (PE), arp3, cofilin, thymosin-β4 фирм «Abcam» (Великобритания) и «Santa Cruz Biotechnology, Inc.» (США), gelsolin, p45-Ser-β-catenin-PE фирмы «BD» (США). В качестве вторичных – goat anti-mouse IgG fluorescein isothiocyanate (FITC) фирмы «BD» (США). В контроле использовались соответствующие изотипические антитела: мышиные IgG1-FITC и IgG2a-FITC, IgG1, K - PE («Santa-Cruz Biotechnology», «BD», США). Проанализированы количество клеток, экспрессирующих маркеры в процентах (%), а также медиана интенсивности флюоресценции (MFI) в условных единицах (у. е.).

Для исследования противоопухолевого действия ингибиторов протеасом и кальпаинов на клеточные культуры РЭ, полученные от больных, был проведен ингибиторный анализ. Суспензию клеток РЭ получали на дезагрегирующем устройстве и инкубировали в течение 20 ч в вентилируемых чашках Петри при 37ºС, 5% СО2 в присутствии 50 мкМ MG132 (Sigma), 0,5 мкМ бортезомиба (Велкейд, Ben Venue Laboratories Inc., США), 10 мкМ ингибитора кальпаинов ALLN (Sigma), 0,01% DMSO или без добавок. По окончании инкубации клетки с поверхности чашки Петри снимали раствором трипсина-версена (0,05%, Invitrogen), отмывали PBS и оценивали жизнеспособность клеток.

При статистической обработке полученных результатов использовались методы описательной статистики, критерии Шапиро-Уилка, Манна-Уитни, Краскала-Уоллиса, рассчитывался коэффициент ранговой корреляции Спирмена. Прогностическая значимость признаков в отношении общей и безрецидивной выживаемости у больных РЭ оценена с помощью программы Survival Analysis, Statistica 6.0; кривые кумулятивной выживаемости строились по методу Каплана-Майера; для сравнения показателей выживаемости был использован обобщенный критерий Гехана-Вилкоксона. Для создания модели оценки онкологического риска у пациенток с ГЭ использовался дискриминантный анализ. Обсуждаются результаты со значимостью различий при p<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Исследование тотальной химотрипсиноподобной активности протеасом, активности пулов 26S и 20S проведено у 90 больных РЭ I-III стадии и 63 больных с гиперпластическими процессами эндометрия (табл. 1). Выявлено усиление протеасом-зависимого протеолиза в злокачественной ткани эндометрия по сравнению как с соответствующей неизмененной, так и с гиперплазированной тканью. В ткани РЭ тотальная активность протеасом и активность их пулов была выше, чем в неизмененной ткани в 1,7-1,9 раз. По сравнению с ГЭ тотальная активность в ткани РЭ была выше в 2,17 раза, активность 26S пула — в 1,36 раза, а пула 20S протеасом – в 1,77 раза. Причем повышение тотальной активности протеасом и активности 20S пула по сравнению с ГЭ отмечалось уже на Ia стадии заболевания.

Усиление активности протеасом в злокачественной ткани по сравнению с неизмененной тканью продемонстрировано и в некоторых других опухолях [, 2012]. Вероятно, повышение активности протеасом в ткани РЭ по сравнению с неизмененными тканями и ГЭ происходит вследствие возрастающей потребности клетки в обмене белков и интенсификации внутриклеточных процессов, направленных на приобретение и реализацию злокачественно трансформированной клеткой присущих ей свойств.

Таблица 1

Активность протеасом в гиперплазированном, неизмененном и злокачественном эндометрии

Вид эндометрия	n	Тотальная активность, ×103 Ед/мг	Активность пула 26S, ×103 Ед/мг	Активность пула 20S, ×103 Ед/мг
		Медиана	Q1;Q3	Медиана	Q1;Q3	Медиана	Q1;Q3
Гипер- плазированный	63	37,04* р=0,000	22,44; 60,42	27,70* р=0,009	13,33; 51,20	51,67* р=0,005	26,70; 94,44
Неизмененная ткань больных раком эндометрия	90	44,80* р=0,000	22,70; 87,30	19,98* р=0,000	10,7;38,80	53,12* р=0,000	26,70; 100,00
Рак эндометрия	90	80,42	42,0; 150,0	37,73	22,20; 51,77	91,50	51,77; 177,73

Примечание: n – число больных; Q1 и Q3 — верхний и нижний квартили; * - значимость различий по сравнению с опухолевой тканью больных раком эндометрия.

При анализе особенностей изменения химотрипсинподобной активности протеасом в ткани РЭ в зависимости от клинико-морфологических параметров заболевания выявлено увеличение активности 26S пула протеасом в 3,2 раза и 20S пула в 1,31 раза при III стадии РЭ по сравнению со II стадией. Кроме того, тотальная активность протеасом была выше в опухолях с инвазией более половины миометрия, чем в неинвазивных опухолях в 1,76 раза (р=0,02), и наблюдалась тенденция к повышению активности всех пулов протеасом при увеличении глубины инвазии опухоли в миометрий. Корреляционный анализ показал прямую связь между глубиной инвазии опухоли в миометрий и как тотальной активностью протеасом, так и активностью 26S пула (r=0,34, р=0,001 и r=0,24, р=0,03, соответственно). Полученные данные указывают на участие протеасом в прогрессии РЭ: распространении опухоли и её инвазии.

Определение экспрессии субъединиц протеасом α1α2α3α5α6α7, LMP2, LMP7, PA28β и Rpt6 методом Вестерн-блоттинг показало изменение субъединичного состава протеасом в ткани РЭ по сравнению с соответствующей неизмененной и с гиперплазированной тканью.

Наблюдалось снижение содержания тотального пула протеасом, о котором можно судить по экспрессии α1α2α3α5α6α7-субъединиц протеасом, на 23% относительно неизмененной ткани, сопровождаемое увеличением экспрессии иммунных субъединиц LMP2 и LMP7 (на 24,9% и 35,4%, соответственно). Значительное повышение количества иммунных субъединиц при снижении общего числа протеасом и повышении их активности свидетельствует об изменении функционирования протеасомной системы при РЭ по сравнению с окружающими неизмененными тканями эндометрия.

Качественное изменение протеасом в опухолевой ткани отличает также РЭ от ГЭ. По сравнению с гиперплазированным эндометрием, в злокачественной ткани отмечено увеличение количества всех изучаемых субъединиц: незначительное повышение экспрессии α1α2α3α5α6α7 (на 13%), иммунных субъединиц (LMP2 — на 18%, LMP7 — 16%) и статистически значимое повышение экспрессии PA28β (на 20%) и Rpt6 (на 39,9%).

При анализе экспрессии субъединиц протеасом в зависимости от клинико-морфологических параметров РЭ зарегистрировано повышение содержания субъединиц LMP2 (р=0,04) и PA28β (р=0,03) в группах опухолей с инвазией глубже середины миометрия по сравнению с опухолями с инвазией до середины миометрия в 1,4 и 1,23 раза, соответственно. Установлено наличие положительных корреляций между глубиной инвазии опухоли в миометрий и экспрессией LMP2 (r=0,25; р=0,04) и PA28β (r=0,25; р=0,04).

В литературе нет единого мнения о значении иммунных субъединиц LMP2 и LMP7 для канцерогенеза: некоторые клеточные линии опухолей демонстрируют высокую экспрессию этих субъединиц, другие — низкую [Hayashi T., 2002, 2011; Wehenkel М., 2012; Zhang Х., 2013]. Предполагается их участие в неиммунных процессах, в частности, в инвазии опухолей, а также известно, что LMP-содержащие иммунопротеасомы продуцируют больше пептидов, чем конститутивные, и являются более специфичными [Kesmir С., 2003; Wang H. X., 2006].

Представленные данные демонстрируют вовлечение структурной реорганизации протеасом в развитие РЭ. Результаты исследования могут представлять и практическую значимость в связи с необходимостью поиска новых ингибиторов протеасом, обладающих более узкой направленностью и позволяющим блокировать функционирование отдельных субъединиц, таким образом, избегая многочисленных побочных эффектов и успешно подавляя опухолевую прогрессию.

Была исследована активность и других важных внутриклеточных специфических протеиназ — кальпаинов — в злокачественной, визуально неизмененной и гиперплазированной ткани эндометрия (табл. 2).

Таблица 2

Активность кальпаинов в гиперплазированном, неизмененном и злокачественном эндометрии

Вид эндометрия	n	Общая кальпаиновая активность, ×103 Ед/мг	Активность кальпаина-1, ×103 Ед/мг	Активность кальпаина-2, ×103 Ед/мг
Медиана	Q1;Q3	Медиана	Q1;Q3	Медиана	Q1;Q3
Гиперплазирован-ный эндометрий	32	8,16* р=0,0000	3,99; 25,51	-	-	-	-
Неизмененная ткань эндометрия	43	38,04	19,57; 61,87	15,35	8,21; 38,08	13,73	3,18; 26,03
Малигнизирован-ный эндометрия	43	47,11	25,57; 81,43	24,54	14,18; 33,07	20,92	9,75; 45,59

Примечание: n – число больных; * - значимость различий по сравнению с опухолевой тканью больных раком эндометрия.

У больных РЭ активность кальпаинов не отличалась от этого показателя для неизмененной ткани, но была в 6 раз выше, чем при ГЭ (р=0,000). Возрастание кальпаиновой активности по сравнению с ГЭ наблюдалось уже при Ia стадии РЭ.

При анализе особенностей изменения активности кальпаинов в злокачественных опухолях эндометрия в зависимости от клинико-морфологических параметров заболевания выявлено увеличение активности кальпаина-2 при III стадии РЭ по сравнению со II стадией.

При оценке противоопухолевого действия ингибиторов протеасом и кальпаинов in vitro на культуре клеток РЭ, полученных от 4 больных РЭ I-II стадии, выявлено, что наиболее выраженным противоопухолевым эффектом обладал ингибитор кальпаинов ALLN, в то время как ингибиторы протеасом MG132 и бортезомиб оказывали меньшее влияние на выживаемость злокачественных клеток эндометрия. Полученные данные свидетельствуют о перспективности дальнейших исследований по использованию ингибиторов кальпаинов в таргетной терапии РЭ.

Таким образом, усиление специфического внутриклеточного протеолиза при РЭ происходит на начальных этапах заболевания. Считается, что протеазы функционируют взаимосвязано друг с другом и в злокачественной ткани образуют комплекс, представленный ферментами различных каталитических типов и получивший название «раковый деградом». Компоненты ракового деградома обеспечивают эффективный протеолиз в течение опухолевой прогрессии, в частности, для инвазии и метастазирования [Rothberg J. M., 2012].

Одним из механизмов реализации участия протеиназ в опухолевой прогрессии может быть регуляция ими актинсвязывающих белков, которые играют важную роль в подвижности клеток. В тканях РЭ и ГЭ была определена экспрессия некоторых белков, ассоциированных с клеточной подвижностью (Аrp3, гельзолина, кофилина-1, тимозина β4, фракции β-катенина, фосфорилированного по серину-45). В злокачественной ткани наблюдалось повышение экспрессии всех изучаемых белков по сравнению с гиперплазированной тканью: наиболее значимые отличия коснулись актинветвящего белка Аrp3 (повышение на 28%), гельзолина (повышение на 33%) и тимозина β4 (повышение на 29%) (табл. 3). Отличия обнаруживаются уже при I стадии РЭ.

При анализе содержания локомоторных белков в ткани РЭ во взаимосвязи с клинико-морфологическими параметрами заболевания выявлено увеличение экспрессии гельзолина и кофилина-1, а также снижение экспрессии тимозина β4 при увеличении глубины инвазии опухоли в миометрий. В нашем исследовании при инвазии РЭ в миометрий наиболее значительные изменения (увеличение на 61%) в экспрессии актинсвязывающих белков по сравнению с неинвазивными опухолями коснулись кофилина-1, что свидетельствует о его активном участии в прогрессии РЭ.

Таблица 3

Экспрессия белков, ассоциированных с клеточной подвижностью, в малигнизированном и гиперплазированном эндометрии.

Показатель	Гиперплазия эндометрия n=15	Рак эндометрия n=28	Значимость различий
Медиана	Q1;Q3	Медиана	Q1;Q3
p45-Ser - β-катенин	% позитивных клеток	79,0	60,0; 92,0	93,5	85,5; 98,0	p>0,05
MFI, у. е.	3789,0	2518,0; 7565,0	8497,0	6400,0; 12427,0	р=0,04
Arp3	% позитивных клеток	22,2	12,9; 31,8	28,5	24,4; 33,2	р=0,04
MFI, у. е.	2115,0	1710,0; 2606,0	2071,5	1902,0; 2666,0	p>0,05
гельзолин	% позитивных клеток	19,0	10,9; 21,2	25,25	20,4; 41,3	р=0,001
MFI, у. е.	1861,0	1401; 2055,0	2236,0	1941,0; 2834,0	р=0,004
кофилин 1	% позитивных клеток	16,0	13,4; 19,8	20,65	14,6; 27,8	p>0,05
MFI, у. е	1835,0	1599,0; 1957,0	2051,5	1790,0; 2256,0	р=0,04
тимозин β4	% позитивных клеток	15,4	6,8; 17,5	19,85	16,0; 30,1	р=0,01
MFI, у. е.	1615,0	1525,0; 1889,0	2068,0	1875,0; 2421,0	р=0,001

Вопрос о протеолитической регуляции актинсвязывающих белков на сегодняшний день остается открытым. Согласно результатам разрозненных исследований, одни и те же белки могут быть субстратами как протеасом, так и кальпаинов или каспаз. Результаты корреляционного анализа экспрессии актинсвязывающих белков и β-катенина выявили неодинаковый характер связей между активностью внутриклеточных протеиназ и уровнем экспрессии изучаемых белков в малигнизированном и гиперплазированном эндометрии. При РЭ большинство обнаруженных взаимосвязей касались протеасом, и, по-видимому, протеасомы принимают участие в деградации ряда белков. Так, наблюдалась отрицательная корреляция между активностью 26S пула протеасом и количеством тимозина β4 и β-катенина. Причем последний также находился в обратной зависимости от экспрессии субъединицы Rpt6, одной из АТФазных субъединиц 19S регуляторной частицы (PA700) 26S протеасомы. Эти данные позволяют утверждать, что в тканях РЭ β-катенин подвергается убиквитин-зависимому протеолизу протеасомами, то есть проходит по классическому пути утилизации β-катенина. Отрицательная корреляция выявлена и для экспрессии гельзолина, кофилина-1 и тимозина β4 и активности 20S пула протеасом. Стоит отметить, что снижение экспрессии кофилина-1 коррелировало с повышением экспрессии PA28β, субъединицы активатора 20S протеасом.

При ГЭ наблюдалась несколько иная картина. Так, повышение активности 26S пула протеасом сопровождалось снижением экспрессии Аrp3 и гельзолина, в то время как активность 20S протеасом коррелировала с содержанием в клетке тимозина β4. Экспрессия же β-катенина в гиперплазированном эндометрии обратно коррелировала как с активностью 20S пула протеасом, так и с кальпаиновой активностью, что указывает на возможность его альтернативной регуляции при ГЭ.

Рис. 1 Схема возможного участия протеасом в прогрессии рака эндометрия.

Выявленные особенности патогенеза гиперпластических процессов и РЭ позволили выделить дополнительные объективные прогностические критерии. С учетом этих критериев была разработана математическая модель для оценки онкологического риска у больных с ГЭ, а также обозначены дополнительные критерии прогноза течения РЭ.

Математическая модель для оценки онкологического риска у больных с ГЭ была построена с помощью дискриминантного анализа. Наиболее информативными показателями явились активность кальпаинов, возраст пациентки и активность 20S пула протеасом. Дискриминантные функции имели следующий вид:

Y1= 0,0285*X1+0,0091*X2+0,5429*X3-0,0031*X4-14,6595;

Y2=0,0517*X1+0,0239*X2+0,6568*X3-0,0072*X4-21,0753,

где X1 — активность кальпаинов, X2 — тотальная активность протеасом, X3 — возраст пациентки, X4 — активность 20S пула протеасом.

При Y1>Y2 объект относится к классу с низким риском развития РЭ (менее 5%), при Y1<Y2 объект относится ко второму классу — высокий риск развития РЭ. Чувствительность и специфичность разработанной модели составили 77% и 100%, соответственно, что позволяет планировать адекватный объем лечения этой категории пациентов в рамках вторичной профилактики РЭ.

Были проанализированы результаты общей и безрецидивной 3-летней выживаемости во взаимосвязи с параметрами протеасомной системы. Сроки наблюдения за больными составили от 2 до 38 месяцев, среднее время наблюдения – 18 месяцев. В результате установлено, что статистически значимыми факторами в отношении 3-летней безрецидивной выживаемости у больных РЭ являются стадия заболевания, степень дифференцировки опухоли и тотальная активность протеасом (рис. 2); в отношении 3-летней общей выживаемости – экспрессия субъединицы протеасом LMP2 (рис. 3).

Установлено, что высокая (более 80×103 Ед/мг) тотальная активность протеасом является неблагоприятным фактором в отношении риска развития рецидивов. По-видимому, более высокая активность протеасом свидетельствует о более активном обмене белков-субстратов протеасом, принимающих участие в критических процессах для опухолевой прогрессии.

Рис. 2. Показатели 3-летней безрецидивной выживаемости больных раком эндометрия в зависимости от тотальной активности протеасом.

Выявлено, что высокая (более 250%) экспрессия иммунной субъдиницы LMP2 в ткани РЭ по сравнению с неизмененной тканью является неблагоприятным фактором в отношении общей выживаемости. Полученные результаты согласуются с данными о повышении экспрессии этой субъединицы с увеличением глубины инвазии опухоли в миометрий. Таким образом, иммунные LMP2-содержащие протеасомы в злокачественной ткани осуществляют неиммунные функции.

Рис. 3. Показатели 3-летней общей выживаемости больных раком эндометрия в зависимости от экспрессии протеасомной субъединицы LMP2.

Заключение

В целом, представленные в работе данные свидетельствуют о том, что протеасомная и кальпаиновая системы играют важную роль в патогенезе рака эндометрия, обуславливая его инвазивный рост. По-видимому, участие протеолитических систем в процессе инвазии связано с регуляцией ими белков, ассоциированных с клеточной подвижностью. Кроме того, протеасомы и кальпаины оказывают влияние на характер течения и прогноз заболевания, что позволило выделить объективные информативные критерии прогноза общей выживаемости и рецидивирования РЭ. Разработана математическая модель для оценки риска развития РЭ у больных с гиперпластическими процессами эндометрия, что позволяет проведение мероприятий по вторичной профилактике и ранней диагностике РЭ.

ВЫВОДЫ

1.  В злокачественной ткани эндометрия выявлено повышение активности всех пулов протеасом по сравнению с гиперплазированной тканью, причем тотальная активность и активность 20S пула значимо возрастали уже при Ia стадии РЭ.

2.  Установлено изменение субъединичного состава протеасом в ткани РЭ как по сравнению с неизмененной тканью, так и по сравнению с гиперплазированным эндометрием. В злокачественной ткани отмечено увеличение количества всех изучаемых субъединиц (α1α2α3α5α6α7, LMP2, LMP7, PA28β и Rpt6) относительно их экспрессии гиперплазированном эндометрии.

3.  У больных РЭ выявлено повышение активности кальпаинов по сравнению с ГЭ, отмечаемое уже при Iа стадии. Достоверных различий между активностью кальпаинов в малигнизированной и визуально неизмененной ткани не обнаружено.

4.  При РЭ выявлено повышение активности протеасом и кальпаинов, а также экспрессии субъединиц LMP2 и PA28β с увеличением глубины инвазии опухоли в миометрий, а также повышение активности пулов 26S и 20S протеасом и активности кальпаинов в ткани РЭ III стадии по сравнению со II стадией. Отмечена тенденция к снижению активности кальпаинов при снижении степени дифференцировки опухоли и тенденция к повышению активности кальпаинов в постменопаузальном периоде.

5.  При РЭ наблюдалось повышение экспрессии локомоторных белков по сравнению с ГЭ: актинветвящего белка Аrp3 (повышение на 28%), гельзолина (повышение на 33%) и тимозина β4 (повышение на 29%). Отличия обнаруживаются уже на I стадии РЭ. Различий в экспрессионном профиле локомоторных белков при разных типах ГЭ не выявлено.

6.  Выявлены взаимосвязи между активностью внутриклеточных протеиназ и экспрессией локомоторных белков, различающиеся в тканях РЭ и ГЭ. При РЭ с активностью протеасом было связано содержание в клетках кофилина-1, тимозина β4 и β-катенина. При ГЭ выявлена корреляция между активностью протеасом и экспрессией кофилина-1, в то время как экспрессия тимозина 4β и β-катенина были связаны с активностью как протеасом, так и кальпаинов.

7.  Показатели протеасомной системы могут использоваться в качестве дополнительных критериев прогноза течения РЭ. Высокая (более 80×103 Ед/мг) тотальная активность протеасом является неблагоприятным фактором в отношении риска развития рецидивов. Высокая (более 250%) экспрессия иммунной субъединицы LMP2 в ткани РЭ по сравнению с неизмененной тканью является неблагоприятным фактором в отношении общей выживаемости.

8.  Разработана математическая модель для оценки онкологического риска у больных, страдающих ГЭ. Наиболее информативными показателями явились активность кальпаинов, возраст пациентки и активность 20S пула протеасом. Чувствительность и специфичность разработанной модели составили 77% и 100%, соответственно.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. При формировании групп повышенного риска по развитию РЭ у больных с ГЭ необходимо учитывать показатели внутриклеточного протеолиза. Оценка риска развития РЭ рассчитывается с помощью линейных дискриминантных функций:

Y1= 0,0285*X1+0,0091*X2+0,5429*X3-0,0031*X4-14,6595;

Y2=0,0517*X1+0,0239*X2+0,6568*X3-0,0072*X4-21,0753,

где X1 — активность кальпаинов, X2 — тотальная активность протеасом, X3 — возраст пациентки, X4 — активность 20S пула протеасом.

Процедуру отнесения объекта к классу необходимо проводить в два этапа. На первом этапе рассчитываются значения Y1 и Y2 с использованием значений показателей у исследуемого объекта. Далее объект (больную с ГЭ) относят к одному из классов на основании следующих неравенств: если Y1>Y2, то объект относится к первому классу (риск развития РЭ менее 5%); если Y1<Y2, то объект относится ко второму классу (высокий риск развития РЭ).

2. У больных РЭ для прогнозирования течения заболевания наряду с клинико-морфологическими факторами рекомендовано использовать определение тотальной активности протеасом в ткани опухоли и экспрессии субъединицы протеасом LMP2. Необходимо учитывать, что фактором высокого риска рецидива в течение трех лет после лечения является уровень тотальной активности протеасом выше 80×103 Ед/мг. Фактором, неблагоприятным в отношении общей выживаемости высокая (более 250%) экспрессия субъединицы LMP2 в ткани РЭ по сравнению с неизмененной тканью.

ПЕРЕЧЕНЬ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ
ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1.  Коваль протеасом и их субъединичный состав при раке и гиперпластических процессах эндометрия на фоне метаболического синдрома [Текст] / , , // Актуальные вопросы онкологии : материалы всероссийской научно-практической конференции с международным участием, посвященной 65-летию онкологической службы Красноярского края, 17 декабря 2010 г., С. 105-106.

2.  Коваль протеасом и их субъединичный состав при гиперпластических процессах и раке эндометрия [Текст] / , , // Опухоли женской репродуктивной системы. – 2011. - №4. – С. 64-67.

3.  Коваль и субъединичный состав протеасом в опухолях женской репродуктивной системы [Текст] / , , // Вопросы онкологииТ.57. - С.39.

4.  Коваль и субъединичный состав протеасом в доброкачественных и злокачественных новообразованиях эндометрия [Текст] / , , // Онкохирургия. – 2011. – Т. 3. - №4. – С. 82-83.

5.  Коваль и субъединичный состав протеасом в гиперплазированном и неоплазированном эндометрии [Текст] / , , // Сибирский онкологический журнал. – 2011. – Прил. № 1. – С. 62-63.

6.  Коваль протеасом в опухолях женской репродуктивной системы [Текст] / , , // Биоорганическая химия. 2012. Т. 38. № 1. С. 106-110.

7.  Коваль инсулиноподобных факторов роста и NF-kB протеасомной системой при раке эндометрия [Текст] / , , // Молекулярная биология. 2012. Т. 46. № 3. С. 452-460.

8.  Коваль убиквитин-протеасомной системы в развитии рака эндометрия [Текст] / , , // Вопросы онкологии. – 2012. – Т. 58. – №4. -- С. 473-480.

9.  Коваль протеасом и их субъединичный состав в ткани рака эндометрия: связь с клинико-морфологическими параметрами [Текст] / , , // Бюллютень экспериментальной биологии и медицины. – 2012. – Т. 153. – №4. – С. 491-494.

10. Коваль регуляция экспрессии ростовых факторов и HIF-1 при раке эндометрия [Текст] / , , // Сибирский онкологичсекий журнал. 2012. №2. С. 45-51.

11. Коваль протеасом и кальпаинов при новообразованиях эндометрия [Текст] / , , // Молекулярная медицина№4. - С. 45-48.

12. Koval V. D. Association of growth factors, HIF-1 and NF-κB expression with proteasomes in endometrial cancer [Текст] / L. V. Spirina, N. V. Yunusova, I. V. Kondakova, L. A. Kolomiets, V. D. Koval, A. L. Chernyshova, O. V. Shpileva // Molecular Biology Reports– 39(9). – P. 8655-62.

13. Коваль протеиназы в новообразованиях эндометрия и регуляция ими белков, ассоциированных с клеточной подвижностью [Текст] / , , // Сибирский онкологический журнал : научно-практическое изданиеПрил.№1. - Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии: седьмая региональная конференция молодых ученых-онкологов, посвященная памяти академика РАМН . - С. 81-82.

14. Коваль В-катенина и актинсвязывающих белков в доброкачественных и злокачественных новообразованиях эндометрия [Текст] / , , // Высокие технологии в онкологии : материалы Российской научно-практической конференции с международным участием 26-27 июня 2012 г. / РАМН РОНЦ им. , Алтайский филиал, Администрация Алтайского края, Главное Управление по здравоохранению и фармацевтической деятельности, Алтайский краевой онкологический диспансер, Алтайский государственный медицинский университет. - Барнаул : Азбука, 2012. - С. 70-71.

15. Коваль -связывающие белки, их регуляция и связь с инвазией и метастазированием злокачественных новообразований [Текст] / , , // VI Российский симпозиум «Белки и пептиды» : Материалы симпозиума. – Уфа : ИСЭИ УНЦ РАН, 2013. – С. 100.

16. Коваль онкологического риска у больных с гиперпластическими процессами эндометрия на основе показателей внутриклеточного протеолиза / , , // Сибирский онкологический журнал : научно-практическое изданиеПрил.№1. – VIII региональная конференция молодых ученых-онкологов, посвященная памяти академика РАМН «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии» : материалы конференции. – С. 52-53.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ГЭ — гиперпластические процессы эндометрия

РЭ — рак эндометрия

ALLN – N-ацетил-лейцин-лейцин-норлейциналь, ингибитор кальпаиновой активности

Arp 3 — actin-related protein 3, компонент актин-ветвящего комплекса Arp 2/3

EGFR — epidermal growth factor receptor, рецептор эпидермального фактора роста

LMP - low molecular mass polypeptide, иммунные субъединицы протеасом

PA28 – proteasome activator, активаторная частица протеасом

Rpt6 – regulatory particle aTpase 6, регуляторная субъединица протеасом

Suc-LLVY-AMС — N-сукцинил-лейцин-лейцин-валин-тирозин-7-амино-4-метилкумарин

Z-LLY-FMK – Z-лейцин-лейцин-тирозин-флюорометилкетон, ингибитор кальпаина-2