Цитокины в прогнозировании послеоперационных осложнений при искусственном и вспомогательном кровообращении (стр. 1 )

На правах рукописи

СУСКОВ СЕРГЕЙ ИГОРЕВИЧ

ЦИТОКИНЫ В ПРОГНОЗИРОВАНИИ ПОСЛЕОПЕРАЦИОННЫХ осложнений ПРИ ИСКУССТВЕННОМ И ВСПОМОГАТЕЛЬНОМ КРОВООБРАЩЕНИИ

14.01.24 – трансплантология и искусственные органы

14.03.09 – клиническая иммунология и аллергология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Москва – 2010

Работа выполнена в ФГУ «Федеральном научном центре трансплантологии и искусственных органов имени академика » Минздравсоцразвития РФ

Научные руководители:

Член-корреспондент РАМН,

доктор медицинских наук, профессор

Заслуженный деятель науки РФ,

доктор биологических наук, профессор

Официальные оппоненты:

Заслуженный деятель науки РФ,

доктор медицинских наук, профессор

доктор биологических наук

Ведущее учреждение:

Российский научный центр хирургии им. академика

Защита диссертации состоится “ ”………………….2010г. в………часов на заседании диссертационного совета Д 208.055.01 при ФГУ «ФНЦ трансплантологии и искусственных органов им. академика » МЗ и СР РФ, Москва, ул. Щукинская.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ «ФНЦ трансплантологии и искусственных органов им. академика » МЗ и СР РФ

Автореферат диссертации разослан «________» _________________ 2010года

Ученый секретарь Диссертационного совета Д 208.055.01

доктор медицинских наук, профессор

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы:

Внедрение искусственного и вспомогательного кровообращения в хирургическую практику сделало возможным выполнение сложных операций на сердце, включая двухэтапную трансплантацию сердца, и позволило расширить возрастные границы хирургического лечения, в том числе среди больных с сочетанной патологией сердца. [, , 2000, 2003; , 2009; Nishimura, 2000; Park et al., 2000; Pennington D. C. et al., 2001; Caruso R., 2010].

В то же время, для дальнейшего улучшения клинических результатов применения систем механической поддержки кровообращения, наряду с созданием новых и совершенствованием используемых систем вспомогательного кровообращения при двухэтапной трансплантации сердца, возникает необходимость решения ряда медико-биологических задач, связанных с дизрегуляцией адаптационно-защитных реакций, приводящих к развитию воспалительного ответа, иммунному и метаболическому дисбалансу и снижению противоинфекционной резистентности. Наличие входных ворот для инфекции через магистрали систем искусственного и вспомогательного кровообращения повышает риск бактериальной агрессии с развитием тяжелых инфекционно-воспалительных процессов и органных дисфункций [ и соавт., 2006; , 2008; и соавт., 2008; и соавт., 2009; , 2009; Smedira N. G. et al., 2001; Hotchkiss S. S., 2003 и др.], что выдвигает разработку новых информативных методов прогнозирования послеоперационных осложнений в разряд актуальных задач.

В последние годы появились новые данные о роли цитокинопосредованных механизмов в развитии хирургической инфекции и полиорганной недостаточности. Показано, что в результате повреждения и/или инфицирования тканей в организме развивается сложный многокомпонентный каскад последовательных реакций, неотъемлемым звеном которых являются цитокины иммунной системы – функциональные молекулы межклеточных взаимодействий в иммунном ответе [ и соавт., 2005; и соавт., 2008; Hancook J. T. et al., 2001; Blan K. S. et al., 2007; Cinel I. et al., 2009].

Цитокины играют ключевую роль как в развитии защитного воспалительного ответа, так и в регуляции избыточных проявлений системного воспаления. Нарушение цитокинового баланса приводит либо к развитию бактериально-токсического шока и органных дисфункций, что является причиной ранней летальности больных с гнойно-септическими осложнениями, либо к развитию глубокой иммунодепрессии и анергии, что ведет к формированию поздней полиорганной недостаточности. [ и соавт., 2005; , 2006; Casey L. С., 2000; Annane D. et al., 2003; Axelsson J. et al., 2010].

В настоящее время определение уровней цитокинов используется для оценки тяжести течения патологического процесса; эффективности проводимой терапии; прогнозирования развития тяжелых послеоперационных инфекционно-воспалительных осложнений. [ и соавт., 2003; 2007,; Bone R. S., 1997; Balk R. A., 2002; He Z., Zhao C. et al., 2005; Guani-Guerra E. еt al., 2010].

Однако применение цитокинов иммунной системы в качестве маркеров воспаления и прогнозирования осложненного послеоперационного течения в отечественной клинической практике остается ограниченным [ и соавт., 2004; , 2009; и соавт., 2009]. Остаются недостаточно изученными особенности продукции цитокинов и прогностическое их значение у больных с исходным иммунодефицитом при операциях в условиях искусственного кровообращения и вспомогательного кровообращения при двухэтапной трансплантации сердца.

Сдерживающим фактором использования цитокиновых параметров для прогнозирования послеоперационных осложнений является также отсутствие четкого алгоритма иммунологического мониторинга, включающего наряду с определением фенотипического состава клеток, оценку регуляторных межклеточных взаимодействий, осуществляемых цитокинами. Отсутствие таких данных предопределило цель настоящего исследования.

Цель исследования:

Изучить значимость цитокинов иммунной системы для прогнозирования развития и тяжести течения послеоперационных осложнений у кардиохирургических и трансплантологических больных при искусственном и вспомогательном кровообращении и повысить информативность алгоритма иммунологического мониторинга на основе включения цитокиновых параметров.

Задачи исследования:

-  Изучить особенности цитокинового статуса у больных с нарастающей сердечной недостаточностью при подготовке к операциям в условиях искусственного кровообращения.

-  Исследовать основные закономерности и выявить особенности динамики цитокинов в процессе и в ранние сроки после искусственного кровообращения.

-  Оценить уровни цитокинов и их взаимосвязь с клеточными параметрами при вспомогательном кровообращении при трансплантации сердца для определения тактики иммунологического мониторинга.

-  Выявить сопряженность между цитокинами иммунной системы и клиническим статусом кардиохирургических и трансплантологических больных для обоснования использования их при прогнозировании послеоперационных осложнений.

-  Усовершенствовать алгоритм иммунологического мониторинга путем включения цитокиновых параметров для повышения его информативности в прогнозировании развития послеоперационных осложнений.

Научная новизна:

Впервые показано, что цитокиновый дисбаланс, отражающий тяжелую форму нарушения иммунной системы, является новым самостоятельным функциональным типом вторичного иммунодефицита, способствующим развитию тяжелых инфекционно-воспалительных процессов и органных дисфункций.

Впервые установлено, что нарушение баланса цитокинов является ранним признаком иммунодефицитных состояний у больных с нарастающей сердечной недостаточностью и предпосылкой для развития иммунозависимых осложнений при хирургическом лечении.

Показана возможность использования цитокиновых параметров для раннего выявления воспалительного ответа и органных дисфункций и контроля за их разрешением на разных этапах после операций в условиях искусственного и вспомогательного кровообращения, в том числе двухэтпной трансплантации сердца.

Впервые определены типы основных вариантов цитокиновых реакций, соответствующих: 1 – благоприятному прогнозу, 2 – нарастанию органных дисфункций и риску инфекционных осложнений, 3 – нарастанию дыхательной недостаточности, 4 – неблагоприятному прогнозу после искусственного кровообращения, которые зависят от тяжести дооперационного иммунодефицита и степени выраженности сердечной недостаточности.

Выявлена сопряженность между тяжестью клинического состояния и цитокиновыми параметрами и обоснована возможность их использования для прогнозирования и индивидуального контроля за развитием послеоперационных осложнений у кардиохирургических и трансплантологических больных.

Разработан алгоритм иммунологического мониторинга при искусственном и вспомогательном кровообращении путем применения современных инновационных методов сочетанной оценки цитокиновых параметров и фенотипического состава клеток иммунной системы, позволивших повысить его прогностическую информативность.

Научно-практическая значимость работы:

Выявленные закономерности и варианты динамики цитокинов до и после операций в условиях искусственного и вспомогательного кровообращения необходимо учитывать при выборе тактики иммунологического обследования для контроля за развитием послеоперационных осложнений.

Отобраны варианты комбинаций цитокинов на основе их корреляционных взаимосвязей для использования в качестве прогностических критериев развития и тяжести течения послеоперационных осложнений у кардиохирургических и трансплантологических больных.

Обязательными компонентами иммунологического мониторинга, наряду с клеточными (апоптоз, иммунорегуляторные субпопуляции лимфоцитов) и фагоцитарными (моноциты, оксидазная активность нейтрофилов) показателями иммунитета, должны быть цитокиновые параметры (IL-2, IL-4, IFN-γ, IL-6, TNF-α), отражающие взаимосвязь между отдельными звеньями иммунной системы.

Определены информативные цитокиновые показатели (IL-6, IL-8, TNF-α) и прогностически значимые периоды для проведения иммунологического мониторинга (ранний период адаптации, лихорадка неясной этиологии, 30 сутки левожелудочкового обхода – критический срок развития эндокардита систем МПК, замена деталей системы) при вспомогательном кровообращении у больных, ожидающих трансплантацию сердца.

Внедрение результатов в практику:

Основные положения диссертационной работы внедрены в клиническую практику и повседневно используются в отделениях: анестезиологии, реанимации и интенсивной терапии; хирургии сердца и вспомогательного кровообращения; коронарной хирургии и трансплантации сердца и реконструктивной хирургии приобретенных пороков сердца ФГУ «ФНЦТиИО им. академика » Минздравсоцразвития России.

Апробация диссертации состоялась 01 июля 2010г. на заседании объединенной научной конференции клинических, экспериментальных отделений и лабораторий ФГУ «ФНЦиТИО им. академика » Минздравсоцразвития РФ.

Материалы и основные положения диссертации доложены:

На XXXI Congress ESAO, (Warshaw, Poland, 2004г.); на IX и Х Всероссийском научном форуме с международным участием «Дни иммунологии в С.-Петербурге», (2005, 2006гг.); на 11-th European Congress on Extra-Corporeal Circulation Technology, (Italy 2005г.); на 7-th Symposium of World artificial organ, immynology and Transplantation society (Waits), (Russia., St-Petersburg, 2005г.); на XII, XIII, XIV и XV Всероссийских съездах сердечно-сосудистых хирургов, (Москва, гг.); на VI Съезде иммунологов-аллергологов, Российском национальном конгрессе аллергологов и III Конференции по иммунотерапии (Москва, 2006г.); на Конференции «Клиническая трансплантация органов» РНЦХ РАМН, (Москва, 2007г.); на Объедененных иммунологических форумах, (Москва, 2007 и 2008гг.); на IV Всероссийском съезде трансплантологов им. академика , (Москва, 2008г.); на Национальной конференции «Аллергология и клиническая иммунология – междисципл. проблемы», (М., 2009г.); на VII Съезде аллергологов-иммунологов СНГ, (С.-Пб., 2009г.); на Всесоюзной конференции «Инфекции в трансплантологии», (М., 2009г.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 16 научных работ в центральной печати, в том числе 4 статьи в рецензируемых журналах, рекомендуемых ВАК и 4 публикации в зарубежных изданиях.

Диссертационная работа выполнена в рамках зарегистрированной НИОКР (2661/12 от 19.12.07г. регистрационный № 000.0800392) темы: «Диагностика и коррекция иммунных нарушений у больных при органной и клеточной трансплантации и операциях на сердце в условиях искусственного и вспомогательного кровообращения».

Проведенные исследования являются частью разрабатываемой новой стратегии терапии гнойно-септических осложнений у кардиохирургических и трансплантологических больных на основе инновационных технологий.

Объём и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, характеристики больных и методов исследования, 4 глав результатов собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций и библиографического указателя, включающего 199 источников, из них 96 отечественных и 103 зарубежных авторов. Работа представлена на 122 страницах машинописного текста, иллюстрирована 16 таблицами и 21 рисунком.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Общая характеристика клинических наблюдений

Поскольку искусственное и вспомогательное кровообращение применяется, главным образом, при операциях на сердце, в настоящее исследование включен анализ результатов обследования 130 кардиохирургических больных, в том числе ожидающих трансплантацию сердца, поступивших на плановое хирургическое лечение в ФГУ «ФНЦТиИО им. академика » МЗСР РФ с гг. (Таб.1.).

Таблица 1.

Общая характеристика больных, составивших основную группу наблюдений

Показатели	ИБС M±m (min-max)	ППС M±m (min-max)	ДКМП M±m (min-max)	Всего M±m (min-max)
Количество больных, n	75	40	15	130
Пол, n (%):	муж. жен.	58 (77,3) 17 (22,7)	17 (42,5) 23 (57,5)	10 (66,6) 5 (33,4)	85 45
Возраст, лет	54 ± 5,7 * (43-73)	56,3 ± 7,8 * (47-80)	50 ± 6,8 * (43-57)	56,1 ± 6,7 * (43-78)
- Степень сердечной недостаточности - Функциональный класс стенокардии (по NYHA)	НК 2А–2Б * ФК III–IV *	НК 2А–2Б * ФК III–IV *	НК 2А –2Б * ФК III–IV *	НК 2А–2Б * ФК III–IV *
Операция в условиях ИК, кол-во	Реваскуляризация миокарда (АКШ) n=75	Протезирование клапанов (ПК) n=40	ЛЖО n=15	130
Длительность ИК, мин.	130 ± 9 * (78-182)	123 ± 12 * (67-162)	144 ± 15 * (87-200)	132 ± 13 * (67-200)
Осложнения (СПОН, СПОД, СВР) - начало клинических проявлений п/о, сут. - степень выраженности, сумм. балл SOFA	2,1 ± 0,3 * 11,7 ± 2,1 *	2,4 ± 0,3 * 10,5 ± 0,8 *	2,0 ± 0,8 * 12,0 ±1,8 *	2,2 ± 0,4 * 12,0 ±1,6 *

Примечание: * - P > 0,05 - между больными с ИБС, ППС и ДКМП.

ППС – приобретенные пороки сердца.

Эти больные составили основную группу клинических наблюдений. 20 здоровых доноров крови составили контрольную группу, параметры иммунной системы которых были приняты в качестве нормативных показателей.

Как видно из таблицы 1., больные с разной патологией сердца достоверно по возрасту, степени сердечной недостаточности и функциональному классу стенокардии при обследовании до операции, а также по длительности ИК в раннем послеоперационном периоде не различались (p>0,05). У мужчин преобладали операции по реваскуляризации миокарда, сочетанной патологиии сердца и левожелудочкового обхода на первом этапе двухэтапной трансплантации сердца, тогда как у женщин – операции по реконструкции клапанов сердца.

Объединяющим критерием для кардиохирургических и трансплантологических больных стало развитие послеоперационных осложнений и органных дисфункций при искусственном и вспомогательном кровообращении.

В соответствии с поставленными задачами были определены следующие этапы исследования, включающие изучение:

1 - общих закономерностей и особенностей динамики цитокинов при искусственном (n=38) и/или вспомогательном (n=52) кровообращении;

2 - сопряженности динамики цитокинового статуса с клинико-иммунологической тяжестью послеоперационного течения (n=40);

3 - информативности использования цитокинов в иммунологическом мониторинге для прогнозирования послеоперационных осложнений.

Иммунологическое обследование проводили по схеме: до, в процессе, на 1 и 3 сутки после искусственного кровообращения, а также в процессе левожелудочкового обхода. Показатели иммунного статуса сравнивались с показателями контрольной группы. В ходе иммунологического обследования было проведено 530 развернутых иммунологических анализов с использованием современных стандартизированных методов исследования.

Оценку клеточного звена иммунитета проводили на проточном цитофлуориметре CYTOMICS TM FC500 фирмы Beckman Coulter (США) методом иммунофенотипирования лимфоцитов (CD3+, CD3+CD4+, CD3+CD8+, CD3+CD56+, CD16+CD56+, CD4+CD25+, CD8+DR+, HLA-DR, CD14+DR+, CD4+CD95+, CD19+, CD14+95+, CD11b, CD54+, CD45RO) с помощью дифференцировочных и активационных МКАТ, меченных FITC и фикоэритрином (Becton Coulter, Франция, , Россия) в соответствии с протоколом производителя [ и соавт., 2001].

Состояние гуморального звена иммунитета оценивали по содержанию В-лимфоцитов (CD19+кл.); концентрации иммуноглобулинов основных классов G, A, M в сыворотке крови методом радиальной иммунодиффузии в геле [Manchini G, 1965]; подклассов IgG1-4 в сыворотке крови ИФА методом («Вектор-Бест» РФ); уровню низкомолекулярных ЦИК (6% ПЭГ) с помощью спектрофотометра «Пикон» (Россия).

Фагоцитарную активность нейтрофилов крови определяли по фагоцитозу убитой взвеси Staph. аureus, подсчитывая фагоцитарный индекс и фагоцитарное число. Оксидазную и бактерицидную функцию нейтрофилов оценивали в НСТ-тесте на спектрофотометрие «Пикон» (Россия) и методом люминолзависимой хемилюминесценции с использованием хемилюминометра LUCY2 (ANTHOS, Австрия).

Цитокиновый статус (IL-1β, TNF-α, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-12, INF-γ) оценивали методом цитофлуорометрии на 2-лучевом лазерном автоматизированном анализаторе (Bio-Plex Protein Assay System, Bio-Rad, США) с использованием коммерческих тест-систем 11-Plex [ 2004] и методом ИФА («Цитокин», С-Пб.). Цитокины IL-1Ra и G-CSF определяли методом ИФА («Цитокин», С-Пб.) на спектрофотометрие «Пикон» (Россия).

Оценка тяжести клинического состояния больных.

Cистемный воспалительный ответ оценивали по числу лейкоцитов, уровню С-реактивного белка методом турбометрии в капилляре, по полуколичественному тесту на прокальцитонин («BRAHMS PCT-Q», Германия) [Aouifi A. et al., 1999]. Подсчитывали лейкоцитарную формулу и расчитывали лейкоцитарный индекс интоксикации (ЛИИ) [Кальф-, 1941].

Диагноз сепсиса и септического шока выставляли по критериям согласительной конференции American College of Chest physicians и Society of Critical Care Medicine (1992).

Диагностика органной недостаточности проводилась совместно с Отделением анестезиологии, реанимации и интенсивной терапии (Зав. д. м.н. ) по бальной шкале SOFA (The Sequential Organ Filure Assessment) [Vincent J. L., 1998], включающей оценку коэффициента оксигенации HiO2/FiO2, количества тромбоцитов, общего билирубина, креатинина, уровня артериального давления и дозы катехоламинов. Нарушение сознания оценивали по шкале Глазго. Суммарный балл выше 10 свидетельствовал о наличии СПОН, менее 10 баллов – СПОД.

Статистическая обработка результатов проводилась с использованием прикладных программ Statisticа 6 (StatSoft, США), Excel (Microsoft, США). При нормальном распределения количественных признаков подсчитывали средние значения (М), ошибки средней (m). При оценке качественных признаков подсчитывались их относительные доли (%). В качестве статистических тестов при нормальном распределении количественных признаков с равными выборочными дисперсиями использовали t-критерий Стьюдента. Отличия считали значимыми при p<0,05. Для оценки связи количественных признаков использовались методы линейной регрессии и корреляции (коэффициент корреляции Пирсена).

Результаты собственных исследований и их обсуждение

I. Основные закономерности и особенности цитокинового статуса у больных с нарастающей сердечной недостаточностью до и после операций в условиях искусственного и вспомогательного кровообращения (первый этап исследований).

Известно, что несостоятельность иммунной системы является основным фактором развития и прогрессирования послеоперационных осложнений. При этом тяжелые дисфункции иммунной системы наблюдаются чаще, чем несостоятельность других органов и систем, и сопровождаются глубокой иммунодепрессией, которая является не только ранним и надежным признаком развития опасных для жизни состояний, таких как сепсис и полиорганная недостаточность, но и во многом обеспечивает их возникновение и последующее нарастание. Это подтверждает необходимость выявления иммунных нарушений и оценки степени их тяжести уже в дооперационном периоде.

1.1.  Оценка тяжести иммунных нарушений и цитокинового дисбаланса у больных с нарастающей сердечной недостаточностью при подготовке к операции проведена у 38 больных с ИБС и приобретенными пороками сердца (ППС) с прогрессирующей сердечной недостаточностью, находящихся на медикаментозной поддержке. Степень выраженности тяжелых дисфункций иммунной системы оценивали по: 1) определению субпопуляционного дисбаланса Т-лимфоцитов; 2) количеству апоптотических лимфоцитов (CD95+кл.), экспрессирующих маркер апоптоза; 3) бактерицидной и оксидазной активности нейтрофилов и моноцитов, в том числе антигенпрезентирующей их функции; 4) лимфопении и сдвигу лейкоцитарной формулы, информативных для выявления тяжелых иммунодефицитов (таб.2.).

Как видно, независимо от диагноза, у обследованных больных с высокой частотой выявлялся повышенный уровень апоптотических лимфоцитов (CD95+кл.), экспрессирующих маркер апоптоза (у 78% больных – в 3-5 раз выше N) и повышенная продукция активных форм кислорода в НСТ-тесте (у 86% больных). При этом, у больных с ИБС более выражен апоптоз, тогда как у больных с ППС повышена оксидазная активность нейтрофилов (p<0,05).

Таблица 2.

Дисфункции иммунной системы у больных с сердечной недостаточностью при подготовке к операции (n=38)

Показатель	Доноры (n=20)	ИБС (n=20)	ППС (n=18)	%% больных
Me	Min-max	Me	Min-max	<N	N	>N
Лейкоциты ×109		5200		6790		14	72	14
Лимфоциты	%	25-40	31	28-45	29	18-37	36	64	0
×109		1639		1560		29	67	7
Нейтрофилы п/я %%	1-8	9*	4-16	10*	5-13	0	50	50
Т-лф.(CD3) %	60-75	71	53-86	59	60-81	14	57	29
ИРИ (CD4/CD8)	1,5-2,0	3,0*	0,8-3,5	2,9*	1,1-4,0	29	29	42
Моноциты %	1-7	3	1-7	3	1-3	0	86	14
Акт. HLA-DR %	8-15	14	6-21	10,5	7-26	14	57	29
Рец. к IL-2 (CD25) %	1-5	2	1-5	1,8	1-4	22	78	0
Апоптоз (CD95+кл.) %	0-10	41*	22-69	26 * **	22-52	0	22	78
НСТ-тест (у. е.)	сп.	80-99	67	80-200	157* **	98-206	0	14	86
инд.	130-256	296*	126-334	317* **	146-452	0	14	86

Примечания: *- p<0,05 достоверность различий по сравнению с группой доноров, **- p<0,05 достоверность различий между группами больных с ИБС и ППС. %% больных – частота со сниженными (↓), сохраненными (N) и повышенными (↑) параметрами.