УДК 577.3:574.152.632
АКТИВНОСТЬ ФЕРМЕНТОВ ВНУТРИКЛЕТОЧНОГО ПРОТЕОЛИЗА У СИГОВ ИЗ ВОДОЕМОВ РЕГИОНА МЕДНО-НИКЕЛЕВОГО ПРОИЗВОДСТВА
, , *
185910 1 Институт биологии Карельского научного центра РАН
* 184200 г. Апатиты Мурм. обл. ул. Ферсмана, 14 а Институт проблем промышленной экологии Севера Кольского научного центра, г. Апатиты
Исследовано влияние тяжелых металлов на активность ферментов внутриклеточного протеолиза (катепсины D и В) и содержание белка у сигов из водоемов региона медно-никелевого производства. Показано, что на фоне снижение содержания белка в ряде тканей повышена активность лизосомальных протеиназ (катепсинов B и D), обеспечивающих протекание обменных процессов тканевых белков, в том числе гидролиз макромолекул, дефектных в результате действия загрязнителей, что расценивается как проявление участия лизосом в адаптивном ответе организма на клеточном уровне.
Ключевые слова: сиги, протеиназы, тяжелые металлы
ВВЕДЕНИЕ
Одной из актуальных проблем последних лет является поиск методов оценки влияния различных токсикологических нагрузок на внутренние водоемы и, соответственно, на состояние гидробионтов, их заселяющих. К числу биохимических маркеров состояния организма относится система лизосомального протеолиза, являющегося одним из основных инструментов в механизмах клеточной защиты при влиянии токсикологических и других факторов среды [1; 2]. Протеолитические ферменты действуют на первом, ключевом этапе мобилизации белковых резервов клетки, и поэтому их роль в механизмах биохимических адаптаций невозможно переоценить. Ферментативные превращения и экскреция чужеродных соединений осуществляется протеолитической системой лизосом, на 90 % характеризуемой активностью катепсинов В и D [ 3 ].
На Кольском полуострове сконцентрированы предприятия цветной металлургии, выбросы которых включают тяжелые металлы. Они токсичны, не разлагаются и способны включаться в пищевые цепи водоемов. Ранее было показано негативное влияние отходов медно-никелевого производства на метаболизм гидробионтов [4; 5].
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
В качестве экспериментальных объектов использовали сигов, отловленных в оз. Куэтсиярви (опыт) и оз. Раякоски (контроль). Оз. Раякоски принадлежит к озерно-речной системе р. Пасвик, расположенной на территории заповедника Пасвик (Мурманская обл., на границе с Норвегией). В настоящее время озеро не подвержено загрязнению, поэтому образцы из этого озера использовали в качестве контрольных. Озеро Куэтсиярви испытывает постоянную техногенную нагрузку и характеризуется повышенными концентрациями никеля и меди, достигающими токсичного уровня (> 20 мкг/л).
Исследовались среднетычинковые сиги в возрасте 3+ лет, составляющие основную долю в уловах в указанных озерах. Биохимические показатели определяли в скелетных мышцах, печени, жабрах и гонадах рыб. Активность катепсина В оценивали по гидролизу 0,065М раствора этилового эфира бензоиларгинамида в 0,1М ацетатном буфере рН 5,0 [6], катепсина D - бычьего гемоглобина при рН 3,6 [6], соответственно. Активность ферментов выражали в условных единицах изменения оптической плотности: катепсина D –при 280нм на мг белка, катепсина В – при 525нм на мг белка. Концентрацию белка в пробах определяли по методу Брэдфорд [7].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
 |
Экспериментальные результаты об активности катепсинов в тканях сигов из разных озер Мурманской области свидетельствуют о почти полном
Рис.1 Удельная активность катепсина D у сигов, выловленных в оз. Куэтсиярви (опыт) в % к контролю (оз. Раякоски)
ингибировании активности катепсина D в печени (самцы и самки) и мышцах (самки) у сигов из оз. Куэтсиярви по сравнению с сигами из оз. Раякоски, в тоже время в жабрах и гонадах опытной группы рыб (самки, самцы) отмечен прирост активности - на 100-150% в жабрах и от300 до 600% в гонадах (рис.1). Выбор для исследований именно этих органов обусловлен тем, что печень является органом, в котором происходит детоксикация ксенобиотиков, жабры обладают барьерной функцией и первыми испытывают токсическое воздействие, а мышцы и гонады составляют основу массы тела рыб, поэтому протеолитическая активность в них является одним из критериев, характеризующих состояние гидробионта при действии внешних токсических факторов. Наблюдаемый высокий уровень активности аспартильной протеиназы в гонадах самок и самцов у сигов из оз. Куэтсиярви, возможно, отражает нарушения, происходящие в организме. Подтверждением нашим наблюдениям являются данные сотрудников Института проблем промышленной экологии Севера Кольского научного центра об отсутствии в оз. Куэтсиярви практически здоровых рыб [4]. Морфологические изменения гонад самцов проявлялись в появлении перетяжек и асинхронном созревании гонад, а у самок развитие икры зачастую наблюдалось только в одной гонаде. Кроме того, сиги из оз. Куэтсиярви достигают половозрелости в экстремально раннем возрасте. Печень исследованных рыб приобретает измененный цвет, дольчатую структуру и уменьшается в размере, при этом размер желчного пузыря увеличен. В жабрах происходит гиперемия лепестков, набухание или уплотнение, слущивание и некроз эпителиальных клеток, появляется «анемичное» кольцо.
Активность катепсина В повышена во всех изученных органах самцов и, в меньшей степени, самок сигов из опытного озера. Исключением является лишь жабры самок и гонады самцов, где прирост активности незначителен или отсутствует (рис. 2). Известно, что никель и медь относятся к жизненно необходимым металлам, которые обнаруживаются во всех тканях и входят в состав ряда ферментов [8].
Рис.2. Удельная активность катепсина В у сигов, выловленных в оз. Куэтсиярви (опыт) в % к контролю (оз. Раякоски).
Однако, при поступлении в организм в повышенных дозах они является ингибиторами некоторых ферментативных реакций, что, в конечном счете, может привести к блокированию синтеза белков в организме [9]. Кроме того, ионы меди способны блокировать SH-группы белков, в том числе ферментных. Степень бионакопления Ni в тканях сигов зависит от степени загрязнения и неодинакова в различных тканях; так, органы можно ранжировать (в порядке снижения степени аккумуляции): почка > жабры > костная > печень > мышцы. Концентрация никеля в мышцах практически одинакова у всех видов. Повышенный уровень меди в организме приводит к изменению соотношения ферментных фракций, снижению активности протеолитических ферментов [10], при этом с уменьшением рН воды действие ионов меди ослабляется. Основным органом аккумуляции меди является печень [11], а ее содержание в мышцах незначительно. Прямая зависимость накопления меди в органах от степени загрязнения водоема отсутствует (в отличие от накопления Ni), при этом известно [4], что при увеличении концентрации никеля на фоне высокого уровня меди в организме рыб происходит резкое снижение концентрации меди в печени.
В тканях рыб из загрязненных водоемов наблюдается снижение общего содержания белка (за исключением мышц), что является свидетельством угнетения внутриклеточного метаболизма белков (рис.3). Такой эффект количественной и качественной модификации белкового обмена многократно отмечался в проведенных ранее экспериментах при воздействии различных типов загрязнителей на гидробионтов.
Рис.3. Концентрация белка у сигов, выловленных в оз. Куэтсиярви (опыт) в % к контролю (оз. Раякоски).
Аналогичные результаты по влиянию токсикантов на активность внутриклеточных протеиназ также приводились в наших публикациях [12]. Изменения в активности исследуемых протеолитических ферментов влияют на функциональную активность лизосом, что может существенно сказаться на протекании иммунных и детоксикационных процессов на клеточном уровне
ВЫВОДЫ
Результаты, полученные в ходе данного исследования, подтверждают участие ферментов лизосом в развитии ответной реакции организма на действие отходов медно-никелевого производства, так как известно, что степень воздействия на организм токсикантов зависит от эффективности защитных и восстановительных клеточных механизмов, к которым можно отнести систему внутриклеточного протеолиза, можно предположить участие указанных ферментов в таких процессах, как адаптация на уровне внутриклеточного метаболизма, осуществление защитных реакций организма, определяющих направленность обменных процессов и обеспечивающих его устойчивость к изменяющимся факторам внешней среды.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Немова внутриклеточных протеолитических ферментов в тканях окуня Perca fluviatilis с различным содержанием ртути / , , // Вопр. ИхтиологииТ. 41.- № 5.- С.704-707.
2. Сидоров интегрального биохимического индекса у рыб под влиянием техногенных вод горно-обогатительного комбината / , , // Экология.- 2003.- Т.4. - С. 280-28
3 Дингл Дж. Методы исследования. М.: Мир, 1980, 344 с.
4. Кашулин пресных вод Субарктики как биоиндикаторы техногенного загрязнения. / , , П.-А Амундсен - Апатиты.-19c.
5. Немова эффекты накопления ртути у рыб / . - М: Наука.- 20с.
6. Алексеенко активности протеиназ по расщеплению белковых субстратов / // Современные методы в биохимии. М.: МедицинаТ.2.- С.112.
7. Braedford M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding / М. М.Braedford. // Analit. Biochem. 1976.- V.72.- P. 248-254.1
8. Nickel J. P. Medical and biologic effects of environmental pollutants. / J. P. Nickel. – LondonP.62-109.
9. Sorensen E. M. Metal poisoning in fish. U. S.A. / Е. М Sorensen – Texas: CRC PressР.
10. Влияние загрязнений окружающей среды на некоторые биохимические и физиологические процессы рыб /. Я. Немчок, Я. Олах, Л. Борош // Экол. Кооп. –1986.- N 2. - C.132-136.
11. Bradley R. W. Heavy metals in fish from a series of metal-contaminated lakes near Sudbury, Ontario / R. W. Bradley, J. R. Morris // Water, Air, and Soil Pollution. – 1986. - N 27. – P.341-354.
12. Немова -биохимическое тестирование водоемов по состоянию рыб / , , // Научные аспекты экологических проблем России. Т.1.- М.: НаукаС. 215-220
The activity of enzyme of intracellular proteolysis of whitefish from the waterbodies of the region of copper-nickel industry.
Krupnova M. Yu., Bondareva L. A., Kashulin N. A.*, Nemova N. N.
It was studied the influence of heavy metals on enzyme activity of intracellular proteolysis (cathepsins B and D) and protein content at whitefish from water reservoirs of copper-nickel industry region. It was showed that while the decreasing of protein content at some tissues the activity of lysosomal proteinases, which provides the occurring of metabolism process of tissue proteins, including of macromolecules hydrolysis, is increased. It could assess as demonstration of role of lysosomes in adaptive process in cell level.
Исследование выполнено при поддержке грантов РФФИ , Президента РФ НШ-4310.2006.4, ФЦНТП 2006-РИ-112.0/001/287 и Фонда поддержки отечественной науки.
Е:mail: *****@***krc. *****
Р. т. 8(1
Д. т. 8(1
