Российская Академия Медицинских Наук
Научно - Исследовательский Институт гриппа
(ГУ НИИ гриппа РАМН)
УТВЕРЖДАЮ
Директор НИИ гриппа РАМН
акад. РАМН, д. б.н.,
__________________
«__20__» __апреля_______ 2006 г.
НАУЧНЫЙ ОТЧЕТ
Оценка эффективности вирулицидного действия
дезинфицирующего средства «Клиндезин-специаль»
производства фирмы «Лизоформ Др. Ханс Роземанн ГмбХ», Германия
в отношении вируса гриппа птиц
Санкт-Петербург
2006
1. ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ
Средство «Клиндезин-специаль» («Лизоформ Др. Ханс Роземанн ГмбХ», Германия) зарегистрировано в России в 2003 г. и предназначено для дезинфекции поверхностей в помещениях, жесткой мебели, санитарно-технического оборудования, предметов ухода за больными, изделий медицинского назначения, в том числе хирургических и стоматологических инструментов, при инфекциях бактериальной (включая туберкулез) вирусной и грибковой (кандидозы, дерматофитии) этиологии в лечебно-профилактических учреждениях.
Средство «Клиндезин-специаль» представляет собой прозрачную жидкость голубого цвета. В качестве действующих веществ средство содержит 28% алкилдиметилбензиламмоний хлорида, 2,0% дидецилдиметиламмоний хлорида, 0,75% глутарового альдегида и 5% глиоксаля. Кроме того, в состав средства входит пропанол-1 (5,4%), пропанол-2 (2,7%) и др. компоненты; рН средства - 5,2. Срок годности средства - 2,5 года, рабочих растворов - 14 дней.
С учетом возникшей опасности заражения людей высокопатогенным вариантом вируса гриппа птиц H5N1, получившим широкое распространение в странах Европы и Азии начиная с июня 2005г, проведено изучение вирулицидной активности средства в отношении вируса гриппа птиц.
Вирус гриппа птиц относится к семейству Orthomyxoviridae, роду Influenza A virus. Геном вируса гриппа птиц состоит из восьми сегментов минус - смысловой РНК.
Строение. Вирус гриппа птиц относится к так называемым оболочечным вирусам. Вирусные частицы (вирионы) окружены липопротеидной оболочкой, в состав которой входят липиды, заимствованные от клеток хозяина, а также рецепторные белки гемагглютинин (ГА) и нейраминидаза (НА), посредством которых вирус прикрепляется к чувствительным клеткам и инфицирует их. Рецепторные белки удерживаются в оболочке с помощью трансмембранных гидрофобных доменов. Изнутри оболочка вирионов покрыта матриксным белком М1. В состав оболочки в небольшом количестве входит также белок М2, образующий протонный канал. Внутри частиц находятся геномные сегменты РНК в комплексе с белком NP. К каждому сегменту прикреплен полимеразный комплекс, состоящий из трех белков PA, PB1 и PB2.
Физико-химические свойства. Вирус гриппа птиц разрушается и теряет инфекционные свойства при воздействии органических растворителей, поверхностно-активных веществ, четвертичных соединений аммония, окислителей, щелочей, а также инактивируется при термическом воздействии (повышении температуры выше 70º С в течение нескольких минут).
Различные антигенные варианты (подтипы) вируса гриппа птиц (H5N1, H5N2, H7N7, H9N3 и т. д.) обладают сходными физико-химическими свойствами.
По данным многочисленных сравнительных исследований, вирус гриппа птиц менее устойчив к воздействию различных физико-химических факторов, в частности, окислителей и поверхностно-активных веществ, чем аденовирус и вирус полиомиелита.
2. ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЙ
Целью данной работы было изучение вирулицидной активности средства «Клиндезин-специаль» в отношении вируса гриппа птиц.
Для изучения механизма действия средства «Клиндезин-специаль» было проведено также электронно-микроскопическое исследование влияния указанного средства на морфологию вирусных частиц.
3. ПРОГРАММА ИССЛЕДОВАНИЙ
Программа выполненных исследований включала:
- ознакомление с представленной документацией;
- выполнение вирусологических исследований с целью оценки эффективности средства и проверки режимов его применения;
- выполнение электронно-микроскопических исследований с целью изучения механизма действия средства на вирус гриппа птиц;
- оформление отчета по результатам проведенных исследований.
Результаты исследований внесены в протокол вирусологических испытаний
№ 57 / 3 от 01.01.01 года.
Исследования проведены в рамках договора № ___35/06___с -СПб», Россия.
4. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.
4.1. Изучение дезинфицирующих свойств средства проведено в соответствии с методиками, изложенными в сборнике «Методы испытаний дезинфекционных средств для оценки их эффективности и безопасности», Москва, 1998 г., в соответствии с «Нормативными показателями безопасности и эффективности средств, подлежащих контролю при проведении обязательной сертификации» № 01-12/75-97 и «Методическими рекомендациями по определению вирулицидной активности препаратов № 000-73 от 06.09.73 г.».
4.2. Препараты. Для исследований представлено дезинфицирующее средство «Клиндезин-специаль» производства фирмы «Лизоформ Др. Ханс Роземанн ГмбХ», Германия, партия № срок годности до сентября 2008г. В соответствии с описанием средство представляет собой однородную прозрачную жидкость голубого цвета с запахом отдушки.
Рабочие растворы средства готовили ex tempore путем смешивания соответствующих количеств средства и воды. Исследованы рабочие растворы следующих концентраций: от 0,05% до 6%. Все приготовленные растворы были прозрачными и слабо окрашенными в голубой цвет.
4.3. Вирусы и клетки. В качестве тест - вируса использовали низко-патогенный вариант вируса гриппа птиц, штамм A/Duck/Potsdam (H5N2) из коллекции ГУ НИИ гриппа РАМН. Для восстановления инфекционной активности вирус прошел 4 пассажа на куриных эмбрионах. В эксперименте использовали вирус, накопленный в течение 48 часов при 36ºС в аллантоисной полости 10-12 дневных куриных эмбрионов.
В соответствии с общепринятыми методиками за титр вируса принимали величину, равную обратному десятичному логарифму наибольшего разведения вируса, способного вызвать положительную реакцию гемагглютинации и выражали в логарифмах 50% инфекционной дозы вируса (-lg ИД50). Инфекционный титр вируса, использованного в эксперименте, составлял 5,5 (-lg ИД50).
Для заражения в опытах использовали фрагменты переживающих хорионаллантоисных оболочек (ХАО) куриных эмбрионов. Исследования проводили по модифицированному методу Fazekas de St. Growts [Hyng J., 1958, C.151]. Фрагменты ХАО готовили из хорионаллантоисной оболочки 10-12 дневных куриных эмбрионов после предварительной их стерилизации этанолом и удаления эмбриона вместе с желточным мешком. Кусочки ХАО размером (20х25) мм размещали в лунки панелей из полистирола, содержащие по 0,5 мл поддерживающей среды DMEM c 2% сыворотки КРС.
4.4. Оценка вирулицидного действия.
Предварительный опыт in vitro.
Вируссодержащую аллантоисную жидкость смешивали в соотношении 1:1 с исследуемым средством в различных концентрациях и выдерживали в стерильных пластиковых пробирках в течение минут при температуре 20±2 ºС.
По истечении этого срока готовили серию десятикратных разведений исследуемых препаратов аллантоисной жидкости и добавляли к фрагментам ХАО в лунки панелей. Панели покрывали стеклом, выдерживали 48 ч при температуре 37°С, удаляли фрагменты ХАО и вносили по 0,5 мл 1%-ной суспензии куриных эритроцитов в физиологическом растворе.
Уровень репродукции вируса в лунках панели после воздействия средства и в контроле оценивали по реакции гемагглютинации (РГА) эритроцитов. Остаточную инфекционную активность вируса после воздействия средства оценивали по снижению титра вируса в опыте по сравнению с контролем.
Основной эксперимент.
При оценке вирулицидной активности средства в качестве нейтрализатора использовали 40% инактивированную сыворотку крупного рогатого скота производства фирмы «Биолот», Санкт-Петербург.
В качестве тест-объектов, контаминированных вирусом, использовали:
- различные виды поверхностей (линолеум, метлахская плитка, окрашенное масляной краской и неокрашенное дерево, кафель, металл окрашенный, пластик, стекло, винилискожа);
- предметы ухода за больными (резиновые грелки, подкладные клеенки, градусники, пластмассовые наконечники для клизм);
- игрушки (кроме мягких);
- посуду (тарелки, вилки, ножи);
- лабораторную посуду (из стекла и пластмасс);
- предметы для мытья посуды (щетки, ерши);
- тест-объекты из бязи;
- резиновые коврики;
- изделия медицинского назначения (ИМН) из металлов (корнцанги, пинцеты, ножницы, шпатели, иглы инъекционные, скальпели, щипцы), стекла (микропипетки), резин (фрагменты дренажных трубок, катетеров, зондов), пластмасс (шпатели, фрагменты канала гибкого эндоскопа, наркозно-дыхательной аппаратуры), а также стоматологические (зеркала, головки алмазные, боры твердосплавные, буравы корневые, пульпоэкстракторы, диски алмазные, оттиски из альгината и силикона, фрагменты слюноотсосов).
Способ обработки:
- поверхностей - протирание и орошение (расположение - горизонтальное, для кафеля и окрашенного дерева - вертикальное); норма расхода при однократном орошении составляла 150 мл/м2 распылителем «Квазар», при протирании - 150 мл/м2 при однократной обработке;
- предметы ухода за больными, резиновые коврики, средства личной гигиены - протирание и погружение в рабочий раствор средства;
игрушки - мелкие погружали в раствор средства, крупные - протирали и орошали;
- посуду, предметы для мытья посуды (щетки, ерши), ИМН - погружение;
- тест-объекты из бязи - замачивание.
Для имитации органического загрязнения использовали 40% сыворотку крупного рогатого скота.
Проведены исследования без белковой нагрузки и с белковой нагрузкой по следующей схеме:
1). Инфицирование объектов тест-вирусом, подсушивание.
2). Обработка зараженных объектов (без нагрузки и с нагрузкой) рабочим раствором дезинфицирующего средства.
3). Обработка объектов нейтрализатором (40% сыворотка КРС) после экспозиционной выдержки.
4). Взятие смывов стерильными салфетками, смоченными нейтрализатором, с обработанных объектов.
5). Инфицирование фрагментов ХАО смывной жидкостью.
6). Инкубация ХАО и определение остаточного инфекционного титра вируса как описано выше.
Критерий эффективности обеззараживания - не менее 100%.
Контроли:
Одновременно выполнялись следующие контроли:
а) Чистые (незараженные) фрагменты ХАО (отсутствие вируса в контроле).
б) Фрагменты ХАО, зараженные вирусом гриппа птиц в разведении 10-4 (контроль вируса).
в) Фрагменты ХАО с добавлением дезинфектанта (вместо суспензии вируса и нейтрализатора добавляется соответствующий объем среды).
г) Фрагменты ХАО с добавлением нейтрализатора (вместо суспензии вируса и дезинфектанта добавляется соответствующий объем среды).
4.5. Электронно-микроскопические исследования.
Электронно-микроскопические исследования проводили в соответствии с методиками, описанными в руководствах Almeida JD, 1980; FW. Doan, 1986.
Каплю исследуемого препарата помещали на поверхность парафильма в пластиковой чашке Петри. На каплю опускали медную сетку с углеродной подложкой. После адсорбции в течение 30-60 сек. сетку отмывали в капле дистиллированной воды 2 раза, затем препарат контрастировали 1,5% раствором калиевой соли фосфорно-вольфрамовой кислоты (рН 6,7), удаляли избыток жидкости о край фильтровальной бумаги и высушивали сетку с препаратом в течение 1-2 минут при комнатной температуре.
Просмотр препаратов производили на электронном микроскопе JEM-100S (JEOL, Япония) при инструментальном увеличении 20Исследовали не менее 20 полей зрения каждого препарата.
В электронно-микроскопических исследованиях использовали концентрат вируса гриппа птиц, полученный осаждением аллантоисной жидкости на ультраценрифуге L-8 (Beckman, USA) в режиме 100 000g, 1,5 часа. Вирусный концентрат хранили при -70ºС в аликвотах и перед исследованием размораживали и разводили буферным раствором STE (рН 7.4).
Съемку производили на листовую фотопленку ФТ-41МД, негативы сканировали на сканере Epson 4870.
5. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
5.1. Результаты исследований в предварительном опыте in vitro.
Результаты исследований в предварительном опыте in vitro приведены в таблице 1.
Как видно из данных, приведенных в таблице 1, вирус гриппа птиц полностью инактивировался in vitro 0,25%-1,0% раствором средства «Клиндезин-специаль» в течение 10 и 2 мин, соответственно. При концентрации средства выше 1% полная инактивация вируса гриппа птиц достигалась за очень короткое время (менее 2 мин).
Аллантоисная жидкость по количественному содержанию белков близка к плазме крови, поэтому дополнительных опытов in vitro с белковой нагрузкой не проводили.
Таблица 1. Остаточная инфекционная активность вируссодержащей аллантоисной жидкости после экспозиции с дезинфицирующим средством «Клиндезин-специаль»
Время экспозиции с препаратом «Клиндезин-специаль», мин | Титр вируса (lg ЭИД50) после экспозии с препаратом «Клиндезин-специаль» в концентрации (по препарату), % | ||||
0,0 (контроль вируса) | 0,25 | 1,0 | 2,0 | 3,0 | |
2 | 5,0 | 1,0 | 0,0 | 0,0 | 0,0 |
10 | 5,0 | 0,0 | 0,0 | 0,0 | 0,0 |
30 | 5,0 | 0,0 | 0,0 | 0,0 | 0,0 |
60 | 4,5 | 0,0 | 0,0 | 0,0 | 0,0 |
5.2. Результаты основного эксперимента по обеззараживанию тест-объектов.
Результаты исследований по обеззараживанию различных тест-объектов, контаминированных аллантоисной жидкостью куриных эмбрионов, содержащей вирус гриппа птиц, приведены в таблице 2.
Как следует из результатов эксперимента с белковой нагрузкой и без нее, средство «Клиндезин-специаль» обладает очень эффективным вирулицидным действием в отношении вируса гриппа птиц при использовании его в сравнительно низких концентрациях (0,5% и выше).
Результаты обеззараживания ИМН с замковыми частями (имитатором служили вложенные одна в другую металлические трубки и детали ) свидетельствуют о том, что средство «Клиндезин-специаль» обладает высокой проникающей способностью. Для полной инактивации вируса гриппа птиц на загрязненных объектах достаточно было погрузить их на 30 мин в 2% раствор средства.
Таблица 2. Вирулицидная активность растворов средства «Клиндезин-специаль»
исследованная на тест - объектах, контаминированных
вирусом гриппа птиц
Тест-объект | Концентра-ция рабочего раствора, % (по препарату) | Время обеззара- живания, (мин) | Кол-во тест- объектов / кол-во обеззара- женных | Эффектив - ность обеззара - живания, % | Способ обезза-ражива-ния |
Тест-поверхности: окрашенное и неокрашенное дерево, пластик, кафель | 0,5% | 30 60 | 10/10 12/12 | 100 100 | Протирание, орошение |
Санитарно-техническое оборудование | 0,5% | 30 | 10/10 | 100 | Двукратное протирание и орошение |
Белье незагрязненное | 2,0 1,0 | 10 30 | 15/15 10/10 | 100 100 | Замачивание |
Белье + 40% сыворотка КРС | 2,0 1,0 | 30 60 | 12/12 10/10 | 100 100 | Замачивание |
Посуда лаботарорная | 2,0 | 10 | 10/10 | 100 | Погружение |
Перевязочный материал | 2,0 | 30 | 11/11 | 100 | Замачивание, погружение |
ИМН без замковых частей | 1,0 | 10 | 11/11 | 100 | Погружение |
ИМН с замковыми частями | 2,0 3,0 | 20 30 | 10/10 11/11 | 100 100 | Погружение |
5.3. Результаты электронно-микроскопических исследований.
При электронно-микроскопическом морфологическом исследовании вирусного концентрата до и после экспозиции со средством «Клиндезин-специаль» было обнаружено, что воздействие дезинфицирующего средства проявляется в прямой деструкции вирусных частиц.
Выявлена прямая корреляция деструкции вирусных частиц с потерей вирусным препаратом инфекционных свойств.
Результаты исследований приведены на рис. 1,2.
Рис.1. Вверху: Концентрат вируса гриппа птиц A/Duck/ Potsdam (H5N2). Видны округлые вирионы, окруженные ясно выраженной «щеткой» поверхностных рецепторов.
Внизу: Тот же вирусный концентрат, экспонированный в объемном соотношении 1:1 с 1% раствором средства «Клиндезин-специаль» в течение 10 мин (конечная концентрация средства составила 0,5%). Видно полное разрушение вирионов. Темные округлые образования представляют собой капли мелкодисперсной белково-липидной эмульсии, образовавшейся в результате воздействия средства на вирусный концентрат.
Негативное контрастирование раствором натриевой соли фосфо-вольфрамовой кислоты, рН7,0. Масштабные отрезки 100нм.
Рис. 2. Концентрат вируса гриппа птиц A/Duck/ Potsdam (H5N2), экспонированный в объемном соотношении 1:1 с 0,1% раствором средства «Клиндезин-специаль» в течение 10 мин (конечная концентрация средства составила 0,05%). Полное разрушение вирионов. Стрелками отмечены многослойные липосомо - подобные образования, возникшие вследствие интенсивной экстракции липидов из оболочки вирусных частиц. Негативное контрастирование 1,5% раствором фосфо-вольфрамовой кислоты, рН7,0. Масштабный отрезок 100нм.
На рис. 2 показан результат воздействия средства «Клиндезин-специаль» в сравнительно низкой концентрации (в 10 раз меньше, чем рекомендовано по инструкции при вирусных инфекциях) на вирус гриппа птиц. Как видно из электронно-микроскопических снимков, даже при столь низкой концентрации средства происходило полное разрушение вирионов в течение сравнительно короткого времени (10 мин).
По результатам электронно-микроскопического исследования можно сделать вывод, что средство «Клиндезин-специаль» эффективно экстрагирует липиды из оболочки вируса гриппа, что приводит к полному его разрушению. Вирусные частицы под воздействием средства превращаются в мелко-дисперсную белково-липидную эмульсию с размером частиц меньше размера вирионов.
Из трех представленных на испытания препаратов («Лизоформин 3000», «Клиндезин-специаль» и «БэбиДез Ультра»), средство «Клиндезин-специаль» оказалось наиболее эффективным дезинфектантом в отношении вируса гриппа птиц.
ВЫВОДЫ:
1. Проведенное исследование показало, что дезинфицирующее средство «Клиндезин-специаль» производства фирмы «Лизоформ Др. Ханс Роземанн ГмбХ», Германия при режимах обработки и концентрациях, указанных в инструкции по применению, обладает 100% эффективной вирулицидной активностью в отношении вируса гриппа птиц.
2. При загрязнении поверхностей и изделий медицинского назначения материалом, содержащим вирус гриппа птиц, рекомендуется их обработка раствором средства «Клиндезин-специаль» в рабочей концентрации 0,5% (по препарату) и выше.
3. Электронно-микроскопические исследования показали, что средство «Клиндезин-специаль» в концентрации 0,5% и выше полностью разрушает частицы вируса гриппа птиц в течение 10 мин.
4. Механизм воздействия средства «Клиндезин-специаль» на вирус гриппа птиц обусловлен эффективной экстракцией липидов из оболочки вирионов, что приводит к полному их разрушению и превращению в мелко-дисперсную эмульсию.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Средство «Клиндезин-специал» производства фирмы «Лизоформ Др. Ханс Роземанн ГмбХ», Германия, может быть рекомендовано как высокоэффективное дезинфицирующее средство в отношении вируса гриппа птиц.
Литература.
1. Грипп птиц: происхождение инфекционных биокатастроф. Сб. под ред. акад. РАМН и акад. РАМН , Изд-во «Росток», СПб, 2005, 270с.
2. Almeida JD. Practical aspects of diagnostic electron microscopy. Yale J Biol Med 1980 Jan-Feb;53(1):5-18.
3. Doane FW, Anderson N. Electron Microscopy in Diagnostic Virology, a Guide and Atlas. Cambridge, 1986.
4. Методы испытаний дезинфекционных средств для оценки их безопасности и эффективности, М., 1998.
5. Методические рекомендации по определению вирулицидной активности препаратов № 000-73 от 06.09.73 г.
Исполнители испытаний:
Зав. лаб. молекулярных основ
химиотерапии вирусных инфекций, к. б.н.
Ст. н.с. лаб. патоморфологии и патогенеза
вирусных инфекций, к. б.н.
