│ │ │ │ │ │ │Налюдать ход │гемолиза │
├─────────┼───────────┼────────┼────────┼───────┼──────────┤гемолиза через ├─────────┤
│ 5 │ 1:2100 │ 0,5 │ 1,0 │ 0,5 │ 0,5 │ │Задержка │
│ │ │ │ │ │ │минут │гемолиза │
├─────────┼───────────┼────────┼────────┼───────┼──────────┤ ├─────────┤
│ 6 │ 1:2400 │ 0,5 │ 1,0 │ 0,5 │ 0,5 │ │Задержка │
│ │ │ │ │ │ │ │гемолиза │
├─────────┼───────────┼────────┼────────┼───────┼──────────┤ ├─────────┤
│ 7 │ 1:2700 │ 0,5 │ 1,0 │ 0,5 │ 0,5 │ │Задержка │
│ │ │ │ │ │ │ │гемолиза │
├─────────┼───────────┼────────┼────────┼───────┼──────────┤ ├─────────┤
│ 8 │ 1:3000 │ 0,5 │ 1,0 │ 0,5 │ 0,5 │ │Задержка │
│ │ │ │ │ │ │ │гемолиза │
├─────────┼───────────┼────────┼────────┼───────┼──────────┤ ├─────────┤
│ 9 │ 1:4000 │ 0,5 │ 1,0 │ 0,5 │ 0,5 │ │Задержка │
│ │ │ │ │ │ │ │гемолиза │
├─────────┴───────────┴────────┴────────┴───────┴──────────┴───────────────┴─────────┤
│ Контроли │
├─────────┬───────────┬────────┬────────┬───────┬──────────┬───────────────┬─────────┤
│ 10 │ 1:1000 │ 0,5 │ 1,5 │ - │ 0,5 │ │Задержка │
│ │ │ │ │ │ │ │гемолиза │
├─────────┼───────────┼────────┼────────┼───────┼──────────┤ ├─────────┤
│ 11 │ 1:1000 │ - │ 1,5 │ 0,5 │ 0,5 │ │Задержка │
│ │ │ │ │ │ │ │гемолиза │
├─────────┼───────────┼────────┼────────┼───────┼──────────┤ ├─────────┤
│ 12 │ 1:1000 │ - │ 2,0 │ - │ 0,5 │ │Задержка │
│ │ │ │ │ │ │ │гемолиза │
└─────────┴───────────┴────────┴────────┴───────┴──────────┴───────────────┴─────────┘
5. Эритроциты барана
Баран должен быть в возрасте от 1 до 5 лет. Кровь у него берут путем пункции яремной вены не чаще одного раза в 10 дней, в количестве не более 200 мл в сухую стерильную банку со стеклянными бусами, которую встряхивают в течение 5-10 минут. Затем кровь фильтруют через двойной слой марли (отделяют образовавшиеся сгустки нитей фибрина).
В день постановки реакции эритроциты барана трех - пятикратно отмывают изотоническим раствором натрия хлорида путем центрифугирования. Центрифугируют 10 минут при 3,0 тысячах оборотов в минуту. Последнюю бесцветную порцию промывной жидкости сливают, а осадок вновь центрифугируют при 1,5 тысячах оборотов в минуту для его уплотнения. Надосадочную жидкость вновь удаляют, а из плотного осадка готовят 3% взвесь эритроцитов барана в изотоническом растворе натрия хлорида (на 3 мл плотного осадка эритроцитов добавляют 97 мл изотонического раствора натрия хлорида). Отмытые эритроциты в последующие дни в работе не используют. При наличие гемолиза эритроциты барана к употреблению не пригодны.
Дефибринированную кровь сохраняют в широкогорлом сосуде, накрытом стерильной двухслойной марлевой салфеткой в течение 5-7 дней в холодильнике при 4 град. С.
Для хранения дефибринированной крови барана длительное время рекомендуется консервировать ее по методу Мигулиной. Для этого к 100 мл дефибринированной крови барана добавляют 15 мл смеси, приготовленной по следующей прописи: глюкозы - 6,0 г, борной кислоты - 4,5 г, 100 мл изотонического раствора натрия хлорида; приготовленную смесь кипятят на водяной бане 3 дня подряд по 20 минут. Консервированная кровь барана по методу Мигулиной годна к употреблению в течение 3-4 недель. Перед постановкой реакции при использовании консервированной крови эритроциты необходимо отмывать изотоническим раствором натрия хлорида так же, как неконсервированной.
6. Комплемент
Применяют смесь сыворотки крови, полученной пункцией сердца у 5-10 здоровых морских свинок. Кровь для лучшего свертывания помещают в термостат при 37 град. С на 30 минут. После образования сгустка последний отделяют от стенок пробирки, которую помещают в холодильник при 4 град. С до следующего дня.
Полученную прозрачную сыворотку крови сливают и используют как комплемент. Активность этого комплемента при хранении в холодильнике при 4 град. С сохраняется в течение 1-2 суток.
При консервировании сухой борной кислотой и сернокислым натрием комплемент сохраняется в холодильнике при 4 град. С 1-2 месяца (4,0 г борной кислоты + 5,0 г сернокислого натрия на 100 мл комплемента).
Может быть использован лиофильно высушенный комплемент. Сухой комплемент выпускается в ампулах по 1 мл. Растворение сухого комплемента производят в день постановки реакции изотоническим раствором натрия хлорида при легком встряхивании. В ампулу с сухим комплементом добавляют 1 мл изотонического раствора натрия хлорида. Нужное для постановки реакции количество комплемента смешивают из нескольких ампул одной серии.
Непосредственно перед постановкой реакции Вассермана проводят титрование комплемента в присутствии всех ингредиентов, участвующих в опыте.
Комплемент титруют обязательно: а) в чистом виде (без антигенов), т. е. в присутствии только гемолитической системы и б) с каждым антигеном, входящим в опыт. Титрование комплемента проводят также в присутствии инактивированной отрицательной сыворотки крови человека.
При титровании комплемента ингредиенты разводят в следующем порядке:
1. Разводят гемолитическую сыворотку по утроенному титру в
изотоническом растворе натрия хлорида.
2. Из плотного осадка эритроцитов готовят 3% взвесь в
изотоническом растворе натрия хлорида.
3. Разливают 3% взвесь эритроцитов барана и изотонический
раствор натрия хлорида в 5 контрольных пробирок и
разведенную по утроенному титру гемолитическую сыворотку
(во второй контроль) - таблица N 3.
4. Готовят гемолитическую систему: раствор гемолитической
сыворотки, разведенной по утроенному титру, приливают к
равному объему 3% взвеси эритроцитов барана и производят
быстрое смешивание путем переливания из одной колбы в
другую.
Полученную смесь помещают в термостат при 37 град. С на 30
минут для сенсибилизации эритроцитов.
5. Разводят антигены изотоническим раствором натрия хлорида по
указанному на этикетке титру.
6. Разводят заведомо отрицательную инактивированную сыворотку
крови человека в соотношении 1:5 (2 мл сыворотки крови + 8
мл изотонического раствора натрия хлорида).
7. Разводят комплемент 1:10 (1 мл комплемента + 9 мл
изотонического раствора натрия хлорида).
Таблица N 3
ТИТРОВАНИЕ КОМПЛЕМЕНТА В ОБЪЕМЕ 1,25 МЛ
Ингредиенты (мл) (общий объем - 1,25 мл) | Контрольные пробирки | ||||
1-я | 2-я | 3-я | 4-я | 5-я | |
Гемолитическая сыворотка, разведенная по | - | 0,25 | - | - | - |
3% взвесь эритроцитов барана | 0,25 | 0,25 | 0,25 | 0,25 | 0,25 |
Комплемент 1:100 | 0,25 | - | - | - | - |
Изотонический раствор натрия хлорида | 0,75 | 0,75 | 1,0 | 0,5 | 0,5 |
Антиген трепонемный, разведенный по титру | - | - | - | 0,5 | - |
Антиген кардиолипиновый, разведенный по | - | - | - | - | 0,5 |
Встряхнуть, поместить в термостат при 37 град. на 45 минут | |||||
Результат | --Г --Г -- Г --Г --Г | ||||
После 45 минут пребывания в термостате |
Титрование комплемента проводят в 30 пробирках, поставленных по 10 штук в три ряда. Два ряда пробирок для титрования комплемента в присутствии двух антигенов и третий ряд - для титрования комплемента без антигенов. Пять контрольных пробирок: две - для контроля антигенов и по одной - для контроля комплемента, гемолитической сыворотки и изотонического раствора натрия хлорида на гемотоксичность - заполняют до объединения раствора гемолитической сыворотки и взвеси эритроцитов барана (таблица N 3).
Комплемент, разведенный 1:10, разливают в десять пробирок первого ряда в дозах: 0,1; 0,16; 0,2; 0,24; 0,3; 0,36; 0,4; 0,44; 0,5; 0,55 мл (таблица N 4).
Таблица N 4
ТИТРОВАНИЕ КОМПЛЕМЕНТА В ПРИСУТСТВИИ АНТИГЕНА И
ОТРИЦАТЕЛЬНОЙ СЫВОРОТКИ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА
Ингредиент (мл) | NN пробирок | |||||||||
1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | |
Комплемент 1:10 | 0,1 | 0,16 | 0,2 | 0,24 | 0,3 | 0,36 | 0,4 | 0,44 | 0,5 | 0,55 |
Изотонический раствор | 0,9 | 0,84 | 0,8 | 0,76 | 0,7 | 0,64 | 0,6 | 0,56 | 0,5 | 0,45 |
После тщательного перемешивания из каждой пробирки переносят по 0,25 мл | ||||||||||
Отрицательная инактиви- | По 0,25 мл во все 30 пробирок | |||||||||
Антиген трепонемный, | 0,25 | 0,25 | 0,25 | 0,25 | 0,25 | 0,25 | 0,25 | 0,25 | 0,25 | 0,25 |
Первый ряд пробирок | ||||||||||
Антиген кардиолипино - | 0,25 | 0,25 | 0,25 | 0,25 | 0,25 | 0,25 | 0,25 | 0,25 | 0,25 | 0,25 |
Второй ряд пробирок | ||||||||||
Изотонический раствор | 0,25 | 0,25 | 0,25 | 0,25 | 0,25 | 0,25 | 0,25 | 0,25 | 0,25 | 0,25 |
Третий ряд пробирок | ||||||||||
Гемолитическая система | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 |
Третий ряд пробирок | ||||||||||
Встряхнуть, поместить в термостат при 37 град. С на 45 минут | ||||||||||
Гемолитическая система | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 |
Первый и второй ряды | ||||||||||
Встряхнуть, поместить в термостат при 37 град. С на 45 минут | ||||||||||
Результат | --Г | --Г | --Г | --Г | +Г | +Г | +Г | +Г | +Г | +Г |
Примечание: --Г (задержка гемолиза); +Г (гемолиз)
|
Из за большого объема этот материал размещен на нескольких страницах:
1 2 3 4 5 6 7 |
