Методические рекомендации по применению наборов реагентов для одновременного выявления и количественного определения ДНК возбудителей ИППП в клиническом материале методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией (стр. 4 )

7.  Открыть крышку прибора, нажав кнопку Open Lid. Поставить реакционные пробирки в ячейки амплификатора в соответствии с предварительно запрограммированной схемой планшета. Закрыть крышку прибора нажав кнопку Close Lid.

8.  Запустить выполнение выбранной программы «АмплиСенс-1» с заданной схемой планшета нажав кнопку Start Run.

9.  После окончания выполнения программы можно приступить к анализу результатов.

Анализ результатов

Поочередно для каналов FAM, HEX, ROX, Cy5 установить уровень пороговой линии (левой кнопкой мыши) на таком уровне, где кривые флуоресценции носят линейный характер, выбрав в окне модуля Data Analysis во вкладке Quantitation данные по соответствующему каналу, выделив галочкой соответствующий бокс под графиком флуоресценции.

Учет результатов

Выражение конечного результата концентрации ДНК выявляемых возбудителей возможно в двух вариантах – в абсолютных и в относительных (нормированных) значениях.

В обоих случаях предварительно необходимо оценить концентрацию ДНК ВКО (Glob) в исследуемых образцах соскобов из уретры и цервикального канала это значение должно превышать 103 и 102 геномных эквивалентов человека на реакцию для женщин и мужчин, соответственно.

ВНИМАНИЕ! В случае использования в качестве клинического материала соскобного отделяемого слизистых оболочек прямой кишки, ротоглотки, отделяемого конъюнктивы глаз, образцов мочи и секрета предстательной железы человека количество геномных эквивалентов человека на реакцию может быть менее 103 у женщин и менее 102 у мужчин.

Абсолютные значения концентрации возбудителя

Абсолютные значения концентраций ДНК выявляемых возбудителей отражают общее содержание микроорганизмов во взятом клиническом материале, помещенном в транспортную среду.

Относительные (нормированные) значения концентрации ДНК возбудителя

Нормированные значения концентраций отражают количество клеток возбудителя относительно клеток слизистой человека. Полученные значения количества геномных эквивалентов возбудителя нормируют на 100 тыс клеток человека. Кроме того, значения концентраций ДНК человека отражают качество взятия клинического материала.

Расчеты проводятся с программного обеспечения в формате Microsoft Excel AmpliSens screen-titr Matrix. Для этого необходимо скопировать данные Ct для всех каналов в расчетную таблицу AmpliSens screen-titr Matrix, контрольные образцы и калибраторы назвать согласно инструкции к программному обеспечению, нажать кнопку Рассчитать.

Возможные ошибки

1.  Появление значения более 5 (копий на реакцию) в таблице результатов для отрицательного контрольного образца этапа экстракции (ОК) и/или этапа ПЦР (К–) на каналах для детекции ВКО (HEX, либо ROX, либо Cy5 в зависимости от используемого комплекта реагентов) свидетельствует о наличии контаминации реактивов или образцов. В этом случае результаты анализа по всем пробам считаются недействительными. Требуется повторить анализ всех проб, в которых обнаружена ДНК определяемого возбудителя, начиная с этапа экстракции ДНК, а также предпринять меры по выявлению и ликвидации источника контаминации.

2.  Если при выявлении ДНК микроорганизмов для отрицательного контрольного образца этапа экстракции (ОК) и/или этапа ПЦР (К–) регистрируется сигнал по каналам для детекции этих микроорганизмов, необходимо повторить ПЦР-исследование для всех образцов, для которых определено значение порогового цикла по соответствующим каналам.

3.  Если для ДНК калибраторов ПЦР (UG1, UG2) значение порогового цикла по каналам FAM и/или HEX (а также по каналам ROX и Cy5 при использовании комплектов реагентов для выявления ДНК трех микроорганизмов) отсутствует, необходимо повторить амплификацию для всех образцов.

4.  Разница Ct(UG1) – Ct(UG2) больше 6,7±0,5 свидетельствует о сбое калибровки. Необходимо проверить правильность задания калибраторов и исправить неточности. При повторном получении неудовлетворительного результата повторить ПЦР для всех проб и калибраторов.

Лист вносимых изменений

Редакция	Место внесения изменений	Суть вносимых изменений
08.11.10	Таблица 5. Пример расчета с помощью таблицы Excel	В столбце lg возбудителя/105 для образца 4 добавлено значение 3.2; для образцов 5 и 6 удалены значения 4.5 и 4.9, соответственно
29.12.10 LA	Нижний колонтитул	Добавлен каталожный номер R-B81-100-FT(RG, iQ, Mx)
«Вариант FRT» исправлено на «Формат FRT»
12.01.11 LA	Нижний колонтитул	Соответствие кат. номеров и форм выпуска исправлено согласно инструкциями по применению наборов реагентов
02.04.11 LA	Нижний колонтитул	Каталожный номер R-B81-100-FT(RG, iQ, Mx) изменен на R-B81(RG)
13.07.11 VV	Нижний колонтитул	Добавлен каталожный номер R-B19-100-FT(RG, iQ, Mx)
По тексту	Изменено название Института на ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора
04.08.11 VV	Титульная страница	Добавлен символ, обозначающий «изделие для in vitro диагностики»
Нижний колонтитул	«Кат. №» и «дата изменения» заменены на соответствующие символы
вариант FRT заменен на формат FRT
26.09.11 LA	Титульная страница	Добавлены символ, наименование и адрес производителя
Значок «Изделие для in vitro диагностики» перемещен в правый нижний угол страницы
Удалена информация из нижнего колонтитула
Удалено название приборов
По тексту	Добавлен раздел «Меры предосторожности» с таблицей реагентов, подлежащих маркировке, как содержащих опасные вещества
08.02.12 VV	Титульная страница	Удален символ «Изделие для in vitro диагностики»
15.08.12 IvI	Титульная страница	Добавлены подпись и печать директора ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии
22.08.12 EN	п. Анализ и учет результатов. Возможные ошибки (для всех приборов)	Уточнены критерии наличия контаминации реактивов или образцов
06.03.13 VN	По тексту	Добавлены разделы: «Проведение реакции амплификации, анализ и учет результатов при помощи прибора CFX96 (Bio-Rad, США)» и «Проведение реакции амплификации, анализ и учет результатов при помощи прибора «ДТ-96» («ДНК-Технология», Россия)»
Анализ и учет результатов. Расчет количественных значений (для всех приборов)	Раздел изменен и дополнен
Введено понятие «абсолютных» и «нормированных» значений концентрации ДНК возбудителя
Удалено описание расчета с помощью таблицы Excel
Изменено значение концентрации ДНК ВКО (Glob) в исследуемых образцах соскобов уретры для мужчин: 102 вместо 5 х102
Указано, что расчеты проводятся с помощью программного обеспечения AmpliSens screen-titr Matrix в формате Microsoft Excel
Возможные ошибки (для всех приборов)	Добавлен пункт о диапазоне, в который должна укладываться разница граничных значений калибраторов
Пункты о детекции сигнала в отрицательных контролях при одновременном выявлении одного, двух или трех микроорганизмов объединены в один пункт
Проведение реакции амплификации, анализ и учет результатов при помощи приборов Mx3000P, Mx3005P (Stratagene, США)	Уточнено название программы амплификации для приборов планшетного типа: «АмплиСенс-1» вместо «АмплиСенс-1 Mx»
09.08.13 FN	Назначение	Добавлена таблица «Соответствие названий флуорофоров и каналов детекции»
По тексту	Исправлены опечатки
Названия каналов детекции для каждого из приборов приведены в соответствие с протоколом № 20 от 26.02.13
06.09.13 GA	Оглавление	Добавлено оглавление

[1] Название каналов детекции для соответствующего детектора см. в соответствующем разделе методических рекомендаций к набору реагентов.

[2] Данные ГН 2.2.5.1313-03 «Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны». Класс опасности по ГОСТ 12.1.007-76. ССБТ. «Вредные вещества. Классификация. Общие требования безопасности».

[3] Использованы данные о коде опасности, факторах риска (R) и мерах предосторожности (S) фирмы Sigma-Aldrich (harmful - вредный для здоровья, highly flammable – легковоспламеняющийся).

[4] При одновременном проведении в приборе нескольких различных тестов для выявления ДНК возбудителей ИППП с помощью комплектов реагентов «ПЦР-комплект» (производства ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора) для автоматической калибровки по параметру Gain/Усиление сигнала можно использовать пробирку с любой из подготовленных реакционных смесей, помещенную в 1-ю позицию в роторе. При одновременном проведении тестов в формате «МУЛЬТИПРАЙМ» с помощью комплектов реагентов «ПЦР-комплект» (производства ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора) в 1-ю позицию в роторе необходимо помещать пробирку с реакционной смесью для теста в формате «МУЛЬТИПРАЙМ».