МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
по применению набора реагентов
для обнаружения ДНК микобактерий
туберкулеза (Mycobacterium tuberculosis complex)
методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с
гибридизационно-флуоресцентной детекцией
«АмплиСенс® MTC-FL»
Формат FRT
АмплиСенсÒ
| Федеральное бюджетное учреждение науки «Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии», Российская Федерация, город Москва, улица Новогиреевская, дом 3а |
|
ОГЛАВЛЕНИЕ
НАЗНАЧЕНИЕ.. 3
МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ.. 3
ПРОВЕДЕНИЕ АМПЛИФИКАЦИИ, АНАЛИЗ И УЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ ПРИ ПОМОЩИ ПРИБОРОВ Rotor-Gene 3000, Rotor-Gene 6000 (Corbett Research, Aвстралия), Rotor-Gene Q (QIAGEN, Германия) 5
ПРОВЕДЕНИЕ РЕАКЦИИ АМПЛИФИКАЦИИ, АНАЛИЗ И УЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ ПРИ ПОМОЩИ ПРИБОРОВ iCycler iQ и iQ5 (Bio-Rad, США) 9
ПРОВЕДЕНИЕ АМПЛИФИКАЦИИ, АНАЛИЗ И УЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ ПРИ ПОМОЩИ ПРИБОРА SmartCycler (Сephied, США) 12
ПРОВЕДЕНИЕ РЕАКЦИИ АМПЛИФИКАЦИИ, АНАЛИЗ И УЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ ПРИ ПОМОЩИ ПРИБОРА ДТ-96 (ДНК-Технология, Россия) 14
ПРОВЕДЕНИЕ РЕАКЦИИ АМПЛИФИКАЦИИ, АНАЛИЗ И УЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ ПРИ ПОМОЩИ ПРИБОРОВ Mx3000P/Mx3005P (Stratagene, США) 16
НАЗНАЧЕНИЕ
Методические рекомендации описывают порядок действий при использовании набора реагентов для обнаружения ДНК микобактерий туберкулеза (МБТ) – Mycobacterium tuberculosis complex (MTC), в разных видах клинического материала, культурах микроорганизмов и объектах окружающей среды методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией «АмплиСенс® МТС-FL» формат FRT совместно с приборами для ПЦР в режиме «реального времени»:
¾ Rotor-Gene 3х и 4-х канальные), Rotor-Gene 6000 (Corbett Research, Австралия),
¾ Rotor-Gene Q (QIAGEN, Германия),
¾ iCycler iQ (2-х и более канальный), iQ5 (Bio-Rad, США),
¾ SmartCyclerII (Cephied, США),
¾ Mx3000P, Mx3005 (Stratagene, США),
¾ «ДТ-96» («ДНК-Технология», Россия).
Соответствие названий флуорофоров и каналов детекции
Канал для флуорофора | Название канала детекции для разных моделей приборов[1] |
канал для флуорофора FAM | FAM/Green |
канал для флуорофора JOE | JOE/HEX/R6G/Yellow/Cy3 |
МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ
ВНИМАНИЕ! В соответствии с Директивой Европейского Союза 67/548/EEC следующие реагенты подлежат маркировке, как содержащие опасные вещества, а также требуют указания факторов риска (R) и мер предосторожности (S):
Наименование реагента | Наименование комплекта, в который входит реагент | Наименование опасного (в соответствии с директивой 67/548/EEC) вещества | Код опасности, перечень факторов риска (R) и мер предосторожности (S) в соответствии с директивой 67/548/EEC | по ГН 2.2.5.1313-03[2] | |||
ПДК макс разовая/ среднесменная (мг/м3) | основная опасность | класс опасности | автоматический контроль над содержанием вещества в воздухе рабочей зоны | ||||
Буфер для лизирующего реагента | «ДНК-сорб-С» | Гуанидин хлорид | Harmful[3] R:22-36/38 S:22 | Нет данных | |||
Раствор для лизиса | «РИБО-преп» | Гуанидин тиоцианат | Harmful2 R:20/21//53 S:13-61 | Нет данных | |||
Лизирующий раствор | «ДНК-сорб-В» | ||||||
Раствор для отмывки 1 | «ДНК-сорб-В», «ДНК-сорб-С» | ||||||
Раствор для преципитации | «РИБО-преп» | Изопропанол | Highly flammable2 Irritant2 R: S:7-16-24/25-26 | 50/10 | Пары | Класс опасности 3 | Hе требуется |
Раствор для отмывки 2 | «ДНК-сорб-В», «ДНК-сорб-С» | Этанол | Highly flammable2 R:11 S:7-16 | 2000/ 1000 | Пары | Класс опасности 4 | Не требу-ется |
Раствор для отмывки 3 | «РИБО-преп» | ||||||
Раствор для отмывки 4 | «РИБО-преп» | ||||||
Расшифровка обозначений факторов риска (R) и мер предосторожности (S).
R11: легко воспламеняется.
R20/21/22: опасен при проглатывании, контакте с кожей или вдыхании.
R22: опасен при проглатывании.
R32: при контакте с кислотой образует токсичный газ.
R36: раздражает слизистую глаз.
R36/38: оказывает раздражающее действие при попадании в глаза и на кожу.
R52/53: опасен для водных организмов, может вызывать долговременное нежелательное воздействие на водную среду.
R67: пары вещества могут вызывать сонливость и головокружение.
S7: держать емкость плотно закрытой.
S13: держать вдали от пищевых продуктов и напитков, продуктов для животных.
S16: держать вдали от источников огня, не курить.
S22: не вдыхать порошок.
S24/25: избегать контакта с кожей и глазами.
S26: в случае попадания в глаза, немедленно промыть большим количеством воды и обратиться за медицинской помощью.
S61: избегать попадания в окружающую среду.
ВНИМАНИЕ! При работе с легковоспламеняющимися веществами соблюдать правила пожарной безопасности для учреждений здравоохранения ППБО 07-91 от 30.08.91.
ПРОВЕДЕНИЕ АМПЛИФИКАЦИИ, АНАЛИЗ И УЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ ПРИ ПОМОЩИ ПРИБОРОВ Rotor-Gene 3000, Rotor-Gene 6000 (Corbett Research, Aвстралия), Rotor-Gene Q (QIAGEN, Германия)
Для работы с прибором Rotor-Gene 3000 следует использовать программу Rotor-Gene версии 6, с приборами Rotor-Gene 6000 и Rotor-Gene Q - русифицированную программу Rotor-Gene 6000 версии 1.8.17.5 (или выше), или программу Rotor-Gene 6000 версии 1.7 (build 67) или выше.
Далее по тексту термины, соответствующие разным версиям приборов и программного обеспечения указаны в следующем порядке: для прибора Rotor-Gene 3000 / для англоязычной версии программы Rotor-Gene 6000 / для русскоязычной версии программы Rotor-Gene 6000 или Rotor-Gene Q.
Поместить пробирки в ячейки ротора прибора Rotor-Gene 3000, Rotor-Gene 6000, Rotor-Gene Q так, чтобы первая пробирка попала в лунку 1; установить ротор в прибор, закрыть крышку (ячейки ротора пронумерованы, эти номера используются в дальнейшем для программирования положения проб в амплификаторе).
ВНИМАНИЕ! Лунка 1 обязательно должна быть заполнена какой-либо исследуемой пробиркой из текущего эксперимента.
Если в один ротор загружаются пробирки с реагентами от разных наборов реагентов, то в первую лунку должна попасть пробирка с наибольшим количеством флуорофоров. Например, при одновременной загрузке в ротор пробирок с тестами на обнаружение Mycobacterium tuberculosis complex, его количественное определение или дифференцирование, в первую лунку следует поместить пробирки с реагентами для количественного определения или дифференцирования Mycobacterium tuberculosis complex.
Программирование амплификатора
1. Нажать кнопку New/Новый в основном меню программы.
2. В открывшемся окне New Run/Новый тест выбрать шаблон запуска эксперимента Advanced/Детальный мастер и выделить Dual Labeled Probe/Hydrolysis probes/Двухшаговый цикл. Нажать кнопку New/Новый.
3. В открывшемся окне выбрать ротор на 36 лунок 36-Well Rotor/36-луночный ротор, и отметить, что вы не используете пробирки с круглыми крышками (No Domed Tubes (Rotor-Gene 3000) и одето фиксирующее кольцо (Rotor-Gene 6000 и Rotor-Gene-Q) Locking Ring Attached/Кольцо закреплено). Нажать кнопку Next/Далее.
4. В открывшемся окне задать оператора и выбрать объем реакционной смеси: Reaction volume/Объем реакции – 25 мкл. Для прибора Rotor-Gene 6000 или Rotor-Gene-Q установить галочку напротив функции 15 µl oil layer volume/15 μL с добав. воска. Нажать кнопку Next/Далее.
5. В открывшемся окне необходимо задать температурный профиль эксперимента. Для этого нажать кнопку Edit profile/Редактор профиля и задать параметры программы амплификации « MTC» для приборов роторного типа.
6. Дважды нажать кнопку OK/Да.
7. Задать автоматическую калибровку для выбора параметра gain/уровень сигнала.
Для этого в окне New Run Wizard/Мастер нового теста нажать кнопку Calibrate/Gain Optimisation/Опт. уровня сигн. В открывшемся окне Auto Gain Calibration Setup/Авто-оптимизация уровня сигнала нажать кнопку Calibrate Acquiring/Optimise Acquiring/Опт. Детек-мых, пометить галочкой бокс в строке Perform Calibration Before 1-st Acquisition/Perform Optimisation Before 1-st Acquisition/Выполнить оптимизацию при 1-м шаге детекции. Для всех каналов указать в графе Min Reading/Миним. Сигнал значение 5 Fl, а в графе Max Reading/Максим. Сигнал значение 10 Fl. Выйти из окна, нажав кнопку Close/Закрыть.
8. Нажать кнопку Next/Далее, запустить амплификацию кнопкой Start run/Старт.
9. Дать название эксперимента и сохранить его на диске (в этом файле будут автоматически сохранены результаты данного эксперимента).
10. Внести данные в таблицу образцов (открывается автоматически после запуска амплификации). В колонке Name/Имя указать названия/номера исследуемых клинических образцов. Отрицательный контроль ПЦР обозначить как «К–», положительный – «К+». Для пустых ячеек установить тип None/Пусто.
ВНИМАНИЕ! При установке типа None/Пусто данные образца анализироваться не будут!
Обработка и анализ данных
Анализ результатов реакции амплификации по каналу FAM/Green:
1. Активировать нажатием в меню кнопки Analysis/Анализ, выбрать режим анализа Quantitation/Количественный, активировать кнопку Cycling A. FAM/ Cycling A. Green, нажать кнопку Show/Показать.
2. Убрать всплывающее окно, предлагающее автоматический выбор уровня пороговой линии Threshold.
3. В меню основного окна (Quantitation analysis/Количественный анализ) должны быть активированы кнопки Dynamic tube/Динамич. фон и Slope Correct/Коррект. Уклона.
4. Масштабировать графики кривых, нажав кнопку Auto-Scale в нижней части окна Quantitation analysis - Cycling A. Green.
5. В меню CT Calculation/Вычисление СТ (в правой части окна) выставить уровень пороговой линии Threshold/Порог = 0.03.
6. Выберите параметр More Settings/Outlier Removal/Устранение выбросов и установите значение порога отрицательных проб равным 10 %.
7. В таблице результатов (окно Quant. Resultes – Cycling A. FAM/Quant. Results – Cycling A. Green/Количественные результаты – Cycling A. Green) появятся значения Ct.
Анализ результатов реакции амплификации по каналу JOE/Yellow:
1. Активировать нажатием в меню кнопки Analysis/Анализ, выбрать режим анализа Quantitation/Количественный, активировать кнопку Cycling A. JOE/Cycling A. Yellow, нажать кнопку Show/Показать.
2. Отменить автоматический выбор уровня пороговой линии Threshold.
3. В меню основного окна (Quantitation analysis/Количественный анализ) должна быть активирована кнопка Dynamic tube/Динамич. фон.
4. В меню основного окна (Quantitation analysis/Количественный анализ) не должна быть активирована кнопка Slope Correct/Коррект. Уклона.
5. Масштабировать графики кривых, нажав кнопку Auto-Scale в нижней части окна Quantitation analysis - Cycling A. Yellow.
6. В меню CT Calculation/Вычисление СТ (в правой части окна) выставить уровень пороговой линии Threshold/Порог = 0.05.
7. Выберите параметр More Settings/Outlier Removal/Устранение выбросов и установите значение порога отрицательных проб равным 15 %.
8. В таблице результатов (окно Quant. Resultes – Cycling A. JOE/Quant. Results – Cycling A. Yellow/Количественные результаты – Cycling A. Yellow) появятся значения Ct.
Учет результатов
В случае получения:
1. Положительного результата по каналу FAM/Green (Ct не превышает граничное значение, указанное во вкладыше) и положительного (Ct не превышает граничное значение, указанное во вкладыше) или отрицательного (Ct превышает граничное значение, указанное во вкладыше) результата по каналу JOE/Yellow – результат валидный – Mycobacteruim tuberculosis complex обнаружена.
2. Отрицательного результата по каналу FAM/Green и положительного по каналу JOE/Yellow (Ct не превышает граничное значение, указанное во вкладыше) – результат валидный – Mycobacterium tuberculosis complex не обнаружена.
3. Отрицательного результата или значения Ct, превышающего граничное значение, указанное во вкладыше, по каналам FAM/Green и JOE/Yellow результат считается невалидным. Требуется повторная амплификация образца, в случае повторного получения аналогичного результата, необходимо повторить анализ образца, начиная с этапа экстракции. Если валидный результат не получен, то образец обозначается как невалидный и рекомендуется повторное взятие и исследование материала.
4. Значения Ct, превышающего граничное значение, указанное во вкладыше по каналу FAM/Green, и положительного – по каналу JOE/Yellow (Ct не превышает граничное значение, указанное во вкладыше) – результат невалидный. Требуется повторная амплификация образца, в случае повторного получения аналогичного результата, необходимо повторить анализ образца, начиная с этапа экстракции. Если валидный результат не получен, то образец интерпретируется как сомнительный и рекомендуется повторное взятие и исследование материала.
ПРОВЕДЕНИЕ РЕАКЦИИ АМПЛИФИКАЦИИ, АНАЛИЗ И УЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ ПРИ ПОМОЩИ ПРИБОРОВ iCycler iQ и iQ5 (Bio-Rad, США)
Программирование амплификатора
1. Включить прибор и блок питания оптической части прибора. Проводить измерения не менее чем через 30 мин после включения оптической части прибора.
2. Открыть программу для соответствующего прибора iCycler или Bio-Rad iQ5.
3. Поместить пробирки, стрипы или планшет в реакционный модуль амплификатора и запрограммировать прибор.
ВНИМАНИЕ! Необходимо следить за тем, чтобы на стенках пробирок не оставалось капель, так как падение капли в процессе амплификации может привести к сбою сигнала и усложнить анализ результатов. Не переворачивать стрипы/планшет при установке в прибор.
4. Задать схему планшета – расположение пробирок в модуле и измерение флуоресцентного сигнала:
- Для прибора iCycler iQ отредактировать схему планшета в окне Edit Plate Setup модуля Workshop. Для этого в опции Samples: Whole Plate Loading задать схему расположения образцов в реакционном модуле и указать имя каждой пробы в окне Sample Identifier. В опции Select and load Fluorophores задать измерение флуоресцентного сигнала во всех пробирках по каналам FAM-490 и JOE-530. Сохранить схему планшета, задав имя файла в окне Plate Setup Filename (с расширением. pts) и нажав кнопку Save this plate setup (в верхней части экрана). Можно редактировать уже использованную ранее схему планшета, для этого в окне Library открыть View Plate Setup, выбрать нужный файл Plate Setup (с расширением. pts) и нажать кнопку Edit справа. Отредактированный файл нужно также сохранить перед использованием. Назначить использование данной схемы планшета, нажав кнопку Run with selected protocol.
- Для прибора iCycler iQ5 для создания схемы планшета в окне Selected Plate Setup модуля Workshop нажать кнопку Create New или Edit. Редактировать схему планшета в режиме Whole Plate loading. В опции Select and load Fluorophores задать измерение флуоресцентного сигнала во всех пробирках по каналам FAM и JOE/HEX. Задать объем реакции (Sample Volume): 25 мкл, тип крышек (Seal Type): Domed Cap, тип пробирок (Vessel Type): Tubes. Сохранить заданную схему планшета, нажав кнопку Save&Exit Plate Editing.
5. Задать программу амплификации « МТС» для приборов планшетного типа:
- Для прибора iCycler iQ создать программу амплификации, выбрав опцию Edit Protocol модуля Workshop. Для этого в нижнем окне задать параметры амплификации (количество циклов, время и температуру циклирования), а в окне справа указать шаг считывания флуоресцентного сигнала. Сохранить протокол, задав имя файла в окне Protocol Filename и нажав кнопку Save this protocol (в верхней части экрана). При последующих постановках можно выбрать файл с этой программой в закладке View Protocol в модуле Library. Выбрав или отредактировав нужную программу, назначить ее использование, нажав кнопку Run with selected plate setup.
- Для прибора iCycler iQ5 для создания протокола в окне Selected Protocol модуля Workshop нажать кнопку Create New или Edit. Задать параметры амплификации и сохранить протокол, нажав кнопку Save&Exit Protocol Editing. При последующих постановках можно выбрать файл с этой программой в блоке Protocol (по умолчанию файлы протоколов сохраняются в папке Users).
6. Запустить выполнение выбранной программы с заданной схемой планшета:
- Для прибора iCycler iQ перед запуском выполнения программы в окне Run Prep следует проверить правильность выбранного имени протокола и схемы планшета. Выбрать для измерения факторов лунок вариант Experimental Plate в меню Select well factor source. Задать объем реакционной смеси в окне Sample Volume – 25 мкл. Для запуска нажать кнопку Begin Run, дать название эксперимента (в этом файле будут автоматически сохранены результаты данного эксперимента) и нажать OK.
- Для прибора iCycler iQ5 перед запуском выполнения программы следует проверить правильность выбранного протокола (Selected Protocol) и схемы планшета (Selected Plate Setup). Для запуска нажать кнопку Run. Выбрать для измерения факторов лунок вариант Use Persistent Well Factors (предлагается по умолчанию). Нажать кнопку Begin Run, дать название эксперимента (в этом файле будут автоматически сохранены результаты данного эксперимента) и нажать OK.
Обработка и анализ данных
После проведения амплификации перейти в режим анализа данных Data Analysis. Данные просматриваются отдельно по каждому из каналов.
- Для прибора iCycler iQ выбрать значок анализируемого канала в окне Select a Report. При этом должен быть выбран режим анализа данных PCR Base Line Subtracted Curve Fit (выбирается по умолчанию). Задать уровень пороговой линии – ввести в текстовом поле Threshold Position значение 30 для канала FAM-490 и 45 для канала JOE-530. Нажать кнопку PCR Quant. В таблице результатов Quant. Results появятся значения Ct для анализируемого канала.
- Для прибора iCycler iQ5 выбрать в окне модуля данные по анализируемому каналу. При этом должен быть выбран режим анализа данных PCR Base Line Subtracted Curve Fit (выбирается по умолчанию). Задать уровень пороговой линии на уровне, соответствующем 15 % от максимального уровня флуоресценции, полученного для образца ПКО ДНК MTC/STI в последнем цикле амплификации для обоих каналов. Уровень флуоресценции образца считают равным ближайшему бóльшему к нему делению шкалы, помеченному цифрой. При этом необходимо, чтобы график флуоресценции для образца ПКО ДНК MTC/STI имел характерный сигмообразный вид. Можно использовать автоматически выбираемый уровень пороговой линии (по умолчанию), если он попадает в указанный диапазон. Чтобы выделить график образца можно воспользоваться кнопкой Display Wells, либо установить курсор на графике этого образца и сделать двойной щелчок. Чтобы изменить уровень пороговой линии нужно либо перетащить его с помощью левой кнопки мыши, либо выбрать меню Baseline Threshold (в ниспадающем меню, вызываемом щелчком правой кнопки мыши по окну графиков флуоресценции), затем выбрать опцию User Defined и ввести нужное значение в текстовом поле Threshold Position. Для выведения на экран таблицы результатов, нажать кнопку Results.
Учет результатов
В случае получения:
1. Положительного результата (Ct не превышает граничное значение, указанное во вкладыше) по каналу FAM/FAM-490 и положительного (Ct не превышает граничное значение, указанное во вкладыше) или отрицательного результата (Ct превышает граничное значение, указанное во вкладыше) по каналу JOE/HEX/JOE-530 – результат валидный – Mycobacterium tuberculosis complex обнаружена.
2. Отрицательного результата по каналу FAM/FAM-490 и положительного (Ct не превышает граничное значение, указанное во вкладыше) – по каналу JOE//HEX/JOE-530 – результат валидный – Mycobacterium tuberculosis complex не обнаружена.
3. Отрицательного результата или значения Ct, превышающего граничное значение, указанное во вкладыше, по каналам FAM/FAM-490 и JOE//HEX/JOE-530 результат считается невалидным. Требуется повторная амплификация образца, в случае повторного получения аналогичного результата, необходимо повторить анализ образца, начиная с этапа экстракции. Если валидный результат не получен, то образец обозначается как невалидный и рекомендуется повторное взятие и исследование материала
4. Значения Ct, превышающего граничное значение, указанное во вкладыше по каналу FAM/FAM-490 и положительного – по каналу JOE//HEX/JOE-530 (Ct не превышает граничное значение, указанное во вкладыше) – результат невалидный. Требуется повторная амплификация образца, в случае повторного получения аналогичного результата, необходимо повторить анализ образца, начиная с этапа экстракции. Если валидный результат не получен, то образец интерпретируется как сомнительный и рекомендуется повторное взятие и исследование материала
ПРОВЕДЕНИЕ АМПЛИФИКАЦИИ, АНАЛИЗ И УЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ ПРИ ПОМОЩИ ПРИБОРА SmartCycler (Сephied, США)
1. Перед постановкой в амплификатор необходимо опустить реакционную смесь в нижнюю термоциклируемую часть пробирки. Для этого нужно поместить пробирки в ротор специальной центрифуги Mini-Spin (фирмы Cephied, США) и включить ее на 5-7 с.
2. Поместить пробирки в ячейки амплификатора, закрыть крышки ячеек.
Программирование амплификатора
1. В основном меню программы выбрать Define Protocols. В открывшемся окне в нижнем левом углу выбрать кнопку New Protocol, дать название протоколу « МТС» и запрограммировать прибор для выполнения программы « МТС» для прибора SmartCycler (Cephied, США).
2. В нижней части окна нажать кнопку Save Protocol.
3. Нажать кнопку Create Run в основном меню программы. В левой центральной части экрана нажать кнопку Dye set и выбрать комбинацию красок FCTC25.
4. В центре экрана нажать кнопку Add/Remove Sites и в появившемся окне выбрать нужный протокол (программу) и сайты, в которых проводится анализ. Нажать кнопку OK.
5. Запустить выполнение программы эксперимента, нажав в нижней части экрана кнопку Start Run. В появившемся диалоговом окне нужно ввести имя файла, в котором будут сохранены все данные эксперимента.
6. В таблице в верхней половине окна перечислены установки анализа данного эксперимента. В этой таблице для каждого образца в столбце Sample Type по умолчанию указан тип образца UNKN (неизвестный). В колонке Sample ID дать название каждому образцу.
Обработка и анализ данных
1. Выбрать в меню Analysis settings. Задать уровень расчета пороговой линии равный 30 для каналов FAM и Cy3.
2. В таблице результатов (окно Results Table) для каждой пробы появятся значения Ct по каналам FAM и Cy3.
3. Результаты можно интерпретировать пользуясь автоматическим учетом, отраженным в таблице результатов (Results) и визуально, просматривая графики кривых флуоресценции по каналам FAM и Cy3.
Учет результатов
1. Если в таблице результатов в графе Std/Res FAM указан результат POS (кривая флуоресценции для данного образца на графике данных по каналу FAM пересекает пороговую линию (CtFAM≠0), при этом в графе Std/Res Cy3 указан результат POS (CtCy3≠0) или NEG (CtCy3=0) – образец считается положительным, Mycobacteruim tuberculosis complex обнаружена.
2. Если в таблице результатов в графе Std/Res FAM указан результат NEG (кривая флуоресценции для данного образца на графике данных по каналу FAM не пересекает пороговую линию (CtFAM=0), при этом в графе Std/Res Cy3 указан результат POS (CtCy3≠0) – образец считается отрицательным, Mycobacteruim tuberculosis complex не обнаружена.
3. Если в таблице результатов в графах Std/Res FAM и Std/Res Cy3 указаны результаты NEG (CtFAM=0 и CtCy3=0), требуется повторная амплификация этого образца, в случае повторного получения аналогичного результата, необходимо повторить анализ образца, начиная с этапа экстракции. Если валидный результат не получен, то образец обозначается как невалидный и рекомендуется повторное взятие и исследование материала.
ПРОВЕДЕНИЕ РЕАКЦИИ АМПЛИФИКАЦИИ, АНАЛИЗ И УЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ ПРИ ПОМОЩИ ПРИБОРА ДТ-96 (ДНК-Технология, Россия)
1. Включить прибор и запустить программу RealTime_PCR v.7.3. В стартовом окне необходимо выбрать существующего оператора или добавить нового оператора и выбрать режим Работа с прибором.
2. В диалоговом окне Список приборов выбрать необходимый прибор и нажать кнопку Подключить.
3. В меню Тест выбрать команду Создать новый тест, ввести название нового теста – « MTC» – и нажать кнопку ОК. В появившемся окне Тест задать следующие параметры:
- Тип – качественный
- Метод – пороговый (Ct)
- Пробирки – образец, контроль +, контроль –
- Контроли: положительный (К+) – 1, отрицательный (К–) – 1.
- Объем рабочей смеси в пробирке – 25 мкл
- Флуорофоры: FAM – Cпецифика, HEX – ВКО.
- Задать программу амплификации « MTC» и нажать ОК.
4. Нажать кнопку Добавить тест и в появившемся окне выбрать название MTC, указать количество образцов и нажать ОК.
5. Присвоить имена образцам в графе Идентификатор появившейся таблицы. Указать расположение пробирок в рабочем блоке прибора.
6. Выбрать закладку Запуск программы амплификации, проверить параметры теста. Нажать кнопку Открыть блок и установить пробирки в строгом соответствии с указанным расположением пробирок в рабочем блоке прибора.
ВНИМАНИЕ! Необходимо следить за тем, чтобы на стенках пробирок не оставалось капель, так как падение капли в процессе амплификации может привести к сбою сигнала и усложнить анализ результатов. Не переворачивать стрипы/плашку при установке в прибор.
7. Последовательно нажать кнопки Закрыть блок и Запуск программы. Сохранить эксперимент.
Анализ результатов:
1. Перейти в режим Просмотр архива и открыть сохраненный файл данных.
2. Указать в выпадающем списке Тип анализа: Качественный.
3. Указать в выпадающем списке Метод: Пороговый (Сt).
4. Нажать кнопку Изменить параметры анализа и выставить Критерий положительного результата ПЦР - 60%.
5. Для каждого канала проверить правильность автоматического выбора пороговой линии. В норме пороговая линия должна пересекать только сигмообразные кривые накопления сигнала положительных образцов и контролей и не пересекать базовую линию. В противном случае необходимо повысить уровень порога.
6. Нажать кнопку Отчет, затем Сохранить отчет как… (рекомендуется сохранять отчет в папку Мои документы), выбрать формат *.xls Excel либо *.rtf MS Word, выбрать папку для сохранения, присвоить имя файлу и нажать кнопку Сохранить.
Учет результатов
1. Если в таблице результатов в графе Fam Ct указано значение Ct≠0 (кривая флуоресценции для данного образца на графике данных по каналу Fam пересекает пороговую линию), и при этом в графе Hex Ct значение Ct≠0, либо значение не указано, образец считается положительным, Mycobacteruim tuberculosis complex обнаружена.
2. Если в таблице результатов в графе Fam Ct не указано значение (Ct=0 – кривая флуоресценции для данного образца на графике данных по каналу Fam не пересекает пороговую линию) и при этом в графе Hex Ct указано значение Ct≠0 –образец считается отрицательным, Mycobacteruim tuberculosis complex не обнаружена.
3. Если в таблице результатов в графах Fam Ct и Hex Ct не указано значений, требуется повторная амплификация этого образца, в случае повторного получения аналогичного результата, необходимо повторить анализ образца, начиная с этапа экстракции. Если валидный результат не получен, то образец обозначается как невалидный и рекомендуется повторное взятие и исследование материала.
ПРОВЕДЕНИЕ РЕАКЦИИ АМПЛИФИКАЦИИ, АНАЛИЗ И УЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ ПРИ ПОМОЩИ ПРИБОРОВ Mx3000P/Mx3005P (Stratagene, США)
1. Включить прибор и запустить программу Stratagene Mx3000P.
2. В окне New Experiment Options выберать пункт Quantitative PCR (Multiple Standarts) и установить флажок Turn lamp on for warm-up.
ВНИМАНИЕ! Лампа должна быть прогрета до запуска эксперимента не менее 15 мин.
3. Установить пробирки в прибор, закрыть фиксатор и дверцу прибора.
4. В меню Options выбрать пункт Optics Configuration и на вкладке Dye Assignment напротив пункта напротив пункта FAM filter set установить параметр FAM, напротив HEX/JOE filter set – JOE.
5. В меню Plate Setup задать параметры измерения флуоресценции. Для этого выбрать все ячейки, в которых установлены исследуемые или стрипы и обозначить все выделенные ячейки как Unknown в окне Well type. Для опции Collect fluorescence data отметить флуорофоры FAM, JOE.
6. Открыть окно Well Information с помощью двойного щелчка левой кнопкой мышки по ячейке с исследуемым образцом. Внести имя для каждого образца.
7. На вкладке Thermal Profile Setup задать программу амплификации (см. табл. 6 «Программа амплификации « MTC» для приборов планшетного типа (например, iCycler iQ и iQ5 (Bio-Rad, США), «ДТ-96» («ДНК-Технология», Россия) и др.)» в инструкции).
8. В меню выбрать команду Run. Проверить правильность заданной программы амплификации. Нажать кнопку Start. Поставить галочку в окошке Turn lamp off at end of run. Сохранить эксперимент.
Анализ результатов:
1. Перейти в раздел Analysis, выбрав соответствующую кнопку на панели инструментов.
2. На открывшейся вкладке Analysis Selection/Setup убедиться, что все исследуемые образцы активны (ячейки соответствующие образцам должны иметь другой оттенок).
3. Перейти на вкладку Results.
4. Для каждого канала проверить правильность автоматического выбора пороговой линии. В норме пороговая линия должна пересекать только сигмообразные кривые накопления сигнала положительных образцов и контролей и не пересекать базовую линию. В случае если это не так, необходимо повысить уровень порога. Для этого в нижней панели Dyes shown активировать отображение каждого флуоресцентного канала в отдельности, просмотреть положение линии порога, и, при необходимости, изменить.
5. В блоке Area to analyze выбрать строку Text report.
Учет результатов
1. Если в таблице результатов в столбце Assay, графе Fam указано значение Ct≠0 (кривая флуоресценции для данного образца на графике данных по каналу Fam пересекает пороговую линию), и при этом столбце Assay, графе Joe значение Ct≠0, либо значение не указано, образец считается положительным, Mycobacteruim tuberculosis complex обнаружена.
2. Если в таблице результатов в столбце Assay, графе Fam не указано значение (Ct=0 – кривая флуоресценции для данного образца на графике данных по каналу Fam не пересекает пороговую линию) и при этом столбце Assay, графе Joe указано значение Ct≠0 – образец считается отрицательным, Mycobacteruim tuberculosis complex не обнаружена.
3. Если в таблице результатов столбце Assay в графах Fam и Joe не указано значений, требуется повторная амплификация этого образца, в случае повторного получения аналогичного результата, необходимо повторить анализ образца, начиная с этапа экстракции. Если валидный результат не получен, то образец обозначается как невалидный и рекомендуется повторное взятие и исследование материала.
Лист вносимых изменений
Редакция | Место внесения изменений | Суть вносимых изменений |
28.12.09 | По всему тексту | Добавлен прибор Rotor-Gene-Q. Внесены изменения, касающиеся русифицированной версии программы «Rotor-Gene 6000» 1.8.17.5. |
18.08.10 | По тексту | Исправлены стилистические ошибки |
Добавлен прибор «ДТ-96» («ДНК-Технология», Россия) | ||
24.10.11 VV | По тексту | Исправления по шаблону |
Добавлен раздел «Меры предосторожности», включающий таблицу реагентов, подлежащих маркировке как содержащие опасные вещества | ||
27.02.12 IvI | Нижний колонтитул | «Кат. №» и «дата изменения» заменены на соответствующие символы |
07.06.12 ВО | Титульная страница | Добавлен знак IVD, знак и адрес производителя |
Нижний колонтитул | Вариант FRT заменено на Формат FRT | |
15.08.12 IvI | Титульная страница | Добавлены подпись и печать директора ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии |
19.08.12 LA | По тексту | Из п. Учет результатов (для всех приборов) удалены таблица «Оценки результатов анализа контролей» и таблица «Интерпретация результатов клинических образцов» |
Удалены примеры полученных результатов | ||
Добавлен раздел «Проведение реакции амплификации, анализ и учет результатов при помощи приборов Mx3000P/Mx3005P (Stratagene, США)» | ||
31.07.13 РЕ | Назначение | Добавлена таблица «Соответствие названий флуорофоров и каналов детекции» |
По тексту | Названия каналов детекции приведены в соответствие с протоколом № 20 от 26.02.13 |
[1] Название каналов детекции для соответствующего детектора см. в соответствующем разделе методических рекомендаций к набору реагентов.
[2] Данные ГН 2.2.5.1313-03 «Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны». Класс опасности по ГОСТ 12.1.007-76. ССБТ. «Вредные вещества. Классификация. Общие требования безопасности».
[3] Использованы данные о коде опасности, факторах риска (R) и мерах предосторожности (S) фирмы Sigma-Aldrich (harmful - вредный для здоровья, highly flammable – легковоспламеняющийся, irritant - вызывающий раздражение).
