Молекулярно-генетические механизмы активации тромбоцитов и чувствительности к антиагрегантным препаратам (стр. 6 )

Также мы проанализировали функциональную активность тромбоцитов на фоне приема аспирина у пациентов, перенесших ИМ в возрасте старше 45 лет (n=18). В данной группе функциональная активность тромбоцитов была оценена по показателям АДФ-индуцированной агрегации (2,5 мкМ, 5 мкМ и 10 мкМ АДФ) – T(%) и V(%/мин), а также параметрам, измеренным на проточном цитометре – К1 и К2, в зависимости от генетических вариантов Leu33Pro GP IIIa, Ile843Ser GP IIb, С807Т GP Ia, Т13254С GP VI, C18T P2Y12, G36T P2Y12 и A1622G P2Y1, количества рецепторов GP IIb-IIIa, P2Y12, P2Y1 и P2X1 на поверхности тромбоцитов и уровня экспрессии генов GP IIb, GP IIIa, P2Y12, P2Y1 и P2X1.

Аналогично группе ИБС, пациенты с ИМ – носители Pro33 аллеля гена GP IIIa на фоне аспирина (100 мг/день) показывали меньшую степень АДФ-индуцированной агрегации (10 мкМ АДФ) – (61,7±5,2)% против (72,7±2,4)% для генотипов LeuPro+ProPro и LeuLeu, соответственно (p=0,09). Полиморфизм Leu33Pro GP IIIa обсуждался в литературе в связи с развитием аспирин-резистентности, но эффекты Pro33 аллеля строго зависели от лабораторных методов оценки эффективности действия аспирина, примененных в различных исследованиях (Goodman T., Ferro A., Sharma P., 2008).

Противоположные результаты были получены для Т13254С GP VI. Если обследованные нами пациенты с ИБС эффективнее снижали функциональную активность тромбоцитов в зависимости от носительства мутации Т13254С GP VI, то у больных ИМ степень АДФ-индуцированной агрегации (5 мкМ АДФ) при приеме аспирина была несколько выше при наличии мутации Т13254С GP VI – (56,9±5,0)% и (70,2±5,1)% для TT и ТС генотипов, соответственно (р=0,09). Показатели функциональной активности тромбоцитов на фоне приема аспирина, измеренные с помощью цитометрического анализа, также показывали более высокие значения у носителей мутантного аллеля С13254 GP VI: К1=(4,0±2,3)% и К2=(67,8±23,8)% для лиц с генотипом «дикого типа» ТТ, К1=(17,2±3,1)% и К2=(72,4±6,9)% для пациентов с генотипом ТС (р=0,02 и р=0,09 для К1 и К2, соответственно). Таким образом, в группе больных ИМ старше 45 лет мы выявили ассоциацию Т13254С GP VI с низкой эффективностью аспирина, и данный результат согласуется с Lepantalo A. и соавт. (Lepantalo A. et al. 2006). Следует обратить особое внимание на критерии, по которым оценивалось снижение эффективности действия аспирина, в разных группах анализировались разные показатели – либо АДФ-индуцированная агрегация при различных концентрациях индуктора (группы ИБС и ИМс), либо показатели проточной цитометрии (группа ИМс), либо (у Lepantalo A. и соавт.) – PFA-100 анализ. Полученные отличия в результатах фармакогенетического исследования говорят о необходимости стандартизировать методы оценки функциональной активности тромбоцитов и индивидуальной чувствительности к антиагрегантным препаратам с установлением четких критериев состояния «аспирин-резистентности». Наши выводы полностью согласуются с позицией рабочей группы по аспирин-резистентности (Working Group on Aspirin Resistance) комитета по науке и стандартизации (SSC) Международного общества по тромбозу и гемостазу (ISTH) (Michelson A. D. et al, 2005).

Генотипы A1622G P2Y1 и G36T P2Y12 не влияли на развитие аспирин-резистентности, что не противоречит результатам других исследователей (Bernardo E. et al, 2006; Goodman T., Ferro A., Sharma P., 2008). Мы получили неожиданные результаты о влиянии полиморфизма C18T P2Y12, описанного нами как протективный в отношении развития ИМ и гиперагреации тромбоцитов, на индивидуальную чувствительность больных ИМ к аспирину. Скорость АДФ-индуцированной агрегации (5 мкМ АДФ) была несколько выше у носителей Т18 аллеля – (38,9±4,3) %/мин против (26,9±3,8) %/мин у лиц с генотипом СС (р=0,09). Выше был и показатель K2 – (85,9±3,3) % и (63,7±9,8) % у носителей СТ+ТТ и СС генотипов P2Y12, соответственно (р=0,05). Параметр K1 также был несколько выше у носителей Т18 аллеля, но различия не достигали статистической значимости – (14,2±4,2) % и (17,5±2,6) % для СТ+ТТ и СС генотипов P2Y12, соответственно (p>0,1). Однозначных выводов об ассоциации C18T P2Y12 с развитием аспирин-резистентности на основании полученных результатов делать нельзя. Но следует учитывать, что ранее данный полиморфный вариант был ассоциирован с увеличением риска возникновения церебро-васкулярных осложнений на фоне стандартной терапии клопидогрелом (Zeigler S. et al, 2005).

Таким образом, несмотря на то, что функциональная активность тромбоцитов у пациентов, принимающих аспирин, может быть различной в зависимости от исследованных генотипов, нельзя назвать эти генетические варианты строгими факторами, определяющими развитие аспирин-резистентности. Тем не менее, на практике у больных ССЗ целесообразно учитывать наличие полиморфных вариантов T13254C GP VI и A-842G COX-1, модулирующих индивидуальный ответ на аспирин.

3.  Клопидогрел

Результаты исследований, таких как COMMIT, СLARITY, CAPRIE, CURE и CREDO показали высокую эффективность клопидогрела во вторичной профилактике неблагоприятных клинических исходов. Но одновременно были получены данные о варьировании индивидуального ответа на клопидогрел, и описан феномен резистентности к клопидогрелу (Jaremo P., 2002; Gurbel P., 2003; Angiolillo D., 2004; Gurbel P. et al, 2005; Rocca B., Patrono C., 2005).

Для анализа молекулярно-генетических факторов, влияющих на индивидуальную чувствительность к клопидогрелу, нами были обследованы 94 пациента с ОКС и 28 пациентова, перенесших ИМ в возрасте старше 45 лет. Исследование АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов проводилось больным ОКС исходно (1-ая точка), через 7 дней (2-ая точка), через 30 дней (3-ая точка), через 6 – 8 месяцев с момента госпитализации (4-ая точка) при концентрациях АДФ 1, 2, 5, 10 и 20 мкМ, пациентам с ИМ – на 3-4 день (1-ая точка), на 12-15 день (2-ая точка, не менее 7 дней терапии клопидогрелом) и через 6 месяцев (3-я точка) при концентрации АДФ 2.5, 5 и 10 мкМ.

При первом измерении не было обнаружено ассоциации между активностью тромбоцитов и исследуемыми генетическими вариантами. Однако в динамике наблюдалось следующее: носители мутаций G36T P2Y12 и C807T GP Ia изначально показывая более высокую степень агрегации, на фоне терапии более эффективно ее снижали. Напротив, у носителей мутантных аллелей Leu33Pro GP IIIa, C18T P2Y12 и A1622G P2Y1 не наблюдалось уменьшения степени агрегации тромбоцитов, тогда как пациенты с генотипами «дикого типа» по указанным полиморфизмам вполне адекватно реагировали на антиагрегантную терапию клопидогрелом.

В настоящий момент нет однозначного мнения о влиянии полиморфизмов генов GP IIIa, P2Y12 и P2Y1 на индивидуальную чувствительность кардиологических пациентов к клопидогрелу, результаты исследований носят противоречивый характер. Ряд работ не показывают ассоциации генетических вариантов Leu33Pro GP IIIa, G36T P2Y12 и C18T P2Y12 с вариабельностью ответа на клопидогрел (von Beckerath N. et al, 2005; Angiolillo D. J. et al, 2005; Smith S. M.G. et al, 2006; Lev E. I. et al, 2007). Другие авторы связывают полиморфизмы Leu33Pro GP IIIa, G36T P2Y12 и A1622G P2Y1 с гиперреактивностью тромбоцитов на фоне антиагрегантной терапии и с развитием клопидогрел-резистентности (Dropinski J. et al, 2005; Malek L. A. et al, 2008; Feher G. et al, 2009; Staritz P. et al, 2009), а C18T P2Y12 выступает фактором риска развития цереброваскулярных осложнений на фоне терапии клопидогрелом (Ziegler S. et al, 2005). Более того, генетические варианты рецептора P2Y12 модулируют не только ответ тромбоцитов на клопидогрел, но и на ингибитор АДФ-рецепторов нового поколения - кангрелор (Bouman H. J. et al, 2010). Этот факт опровергает мнение некоторых исследователей о том, что новые препараты снимут вопрос «резистентности» и индивидуальной чувствительности к антиагрегантной терапии с повестки дня.

Под клопидогрел-резистентностью чаще всего подразумевается отсутствие снижения функциональной активности тромбоцитов или развитие неблагоприятных клинических исходов на фоне приема препарата. Патогенетически более корректным можно считать определение резистентности как неспособность препарата блокировать целевой рецептор Р2Y12 и эффективно подавлять агрегацию тромбоцитов. Так как такое определение позволяет использовать лабораторные методы диагностики резистентности к клопидогрелу – определение остаточной активности Р2Y12 рецепторов путем измерения АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов до и после начала терапии клопидогрелом (Gurbel P. A., Tantry U. S., 2007). В своем исследовании мы относили пациентов к клопидогрел-резистентным, если степень АДФ-индуцированной агрегации не снижалась или повышалась по отношению к исходной точке.

В группе пациентов, перенесших ИМ в возрасте старше 45 лет, клопидогрел-резистентность наблюдалась у 7 из 28 проанализированных по 2-м точкам пациентов, то есть составила 25%. В группе больных с ОКС клопидогрел-резистентность была выявлена у 24 из 94 проанализированных на 1-ой и 2-ой точках пациентов, и также составила 25%. Данная частота развития клопидогрел-резистентности в среднем соответствует таковой, описанной в литературе (Angiolillo D. et al, 2004; Gurbel P. et al, 2005; Phillips D. R. et al, 2005; Barsky A. A., Arora R. R., 2006; Ferguson A. et al, 2008).

Клопидогрел является пролекарством и для перехода его в активную форму необходима трансформация с помощью ферментов системы цитохромов Р-450 – CYP2C19, CYP3A4 и CYP3A5. Снижение активности данных ферментов может служить одной из причин развития клопидогрел-резистентности. Мы проанализировали генетические варианты А-293G CYP3A4, G6986A CYP3A5 и G681A CYP2C19 в группах ИМс и ОКС. Проведенный генетический анализ цитохромов CYP2C19, CYP3A4 и CYP3A5 не выявил полиморфизм, ассоциированный с развитием резистентности к клопидогрелу. И в группе ИМс, и в группе ОКС, пациенты, в целом положительно отвечающие на клопидогрел, показывали более высокие значения АДФ-индуцированной агрегации, если являлись носителями GA или AA генотипа G6986A CYP3A5. Среди цитохромов Р-450 чаще связывают с пониженной чувствительностью к клопидогрелу полиморфизм гена CYP2C19 (Hulot J. et al, 2006; Frere C. et al, 2008; Varenhorst C. et al, 2009). Варианты CYP3A4 и CYP3A5 в полной мере не объясняют развитие клопидогрел-резистентности, и их ассоциация с данным феноменом оценивается исследователями по-разному (Lau W. C. et al, 2004; Smith S. et al, 2006; Angiolillo D. et al, 2006; Frere C. et al, 2008).

Мы оценили количество рецепторов P2Y12 и P2Y1 на поверхности тромбоцитов до приема клопидогрела и через 1 месяц двойной антиагрегантной терапии клопидогрел (75 мг/день) + аспирин (100 мг/день). Антитела, которые использовались в исследовании, способны связываться только со свободными, не заблокированными активным метаболитом клопидогрела, рецепторами. На фоне антиагрегантной терапии клопидогрелом наблюдалось статистически достоверное снижение количества рецепторов P2Y12 и P2Y1 на мембране тромбоцитов (рис. 13).

Рис. 13. Количество рецепторов P2X1, P2Y1 и P2Y12 на поверхности тромбоцитов пациентов исходно и через 1 месяц терапии клопидогрелом

Количество рецептора P2X1 также было снижено, что довольно трудно объяснить, так как природа данного рецептора отлична от P2Y12 и P2Y1 – он является кальциевым каналом и активируется АТФ. Тем не менее, известно, что он может играть ключевую роль в активации тромбоцитов рядом индукторов, даже на фоне антиагрегантной терапии (Grenegard M. et al, 2008). В нашем исследовании от количества свободных рецепторов P2X1 зависела АДФ-индуцированная агрегация тромбоцитов на фоне двойной терапии клопидогрел+аспирин – наблюдалась прямая и достоверная корреляция между средней интенсивностью флуоресценции и степенью агрегации при 2,5 мкМ АДФ (R=0,68; p=0,02).

Также был проанализирован уровень экспрессии генов АДФ-рецепторов P2X1, P2Y1 и P2Y12 в тромбоцитах здоровых доноров и у пациентов, чувствительных и резистентных к клопидогрелу. Уровень экспрессии генов P2X1 и P2Y1 не различался у пациентов с положительным и отрицательным ответом на клопидогрел. В то время как экспрессия гена P2Y12 была выше у пациентов, не чувствительных к антиагрегантной терапии (табл. 16). Мы впервые выявили ассоциацию между высоким уровнем экспрессии гена P2Y12 и развитием клопидогрел-резистентности. Braun O. O. и соавт. не нашли такой взаимосвязи, однако они показали прямую корреляцию между количеством рецептора P2Y12 на поверхности тромбоцитов и эффективностью клопидогрела (Braun O. O. et al, 2007). Следует отметить, что работа Braun O. O. и соавт. – это единственное на настоящий момент исследование, которое, как и наше, было посвящено анализу уровня экспрессии гена и количества рецептора P2Y12 у пациентов, принимающих клопидогрел.

Таблица 16.

Уровень экспрессии генов АДФ-рецепторов тромбоцитов P2X1, P2Y1 и P2Y12 у доноров и пациентов, чувствительных и резистентных к клопидогрелу

Экспрессия гена	Доноры	ИМ пациенты
(+) ответ на клопидогрел	(-) ответ на клопидогрел
P2X1	3,29±0,83	3,96±1,39	1,30±0,48
P2Y1	2,42±0,59	1,79±0,84	0,92±0,77
P2Y12	3,71±0,76	1,74±0,45	2,79±0,61*

*p<0,01 – по сравнению с (+) ответом и контрольной группой

Таким образом, на основании проведенного нами фармакогенетического исследования можно заключить, что:

1) генетические варианты Leu33Pro GP IIIa, C18T P2Y12 и G6986A CYP3A5 модулируют индивидуальный ответ пациентов на терапию клопидогрелом – степень АДФ-индуцированной агрегации у носителей полиморфных аллелей остается высокой;

2) резистентные к клопидогрелу пациенты, которые составляют 25%, характеризуются высоким уровнем экспрессии гена P2Y12, кодирующего рецептор – «мишень» для клопидогрела;

3) лабораторным маркером, показывающим степень блокирования рецептора P2Y12 на мембране тромбоцитов, выступает количество свободных рецепторов, измеренное методом проточной цитометрии с использованием соответствующих флуоресцентно меченых антител.

Алгоритм лабораторного молекулярно-генетического исследования для оценки функционального состояния тромбоцитов у больных с ССЗ и определения индивидуальной чувствительности к антиагрегантным препаратам

Поиск причин различной чувствительности к антиагрегантым препаратам и сложность в оценке состояния тромбоцитарного гемостаза привели к необходимости искать комплексный подход к анализу функциональной активности тромбоцитов, что и было предпринято в данной работе. Оценка эффективности действия антиагрегантного препарата должна вестись одновременно по двум направлениям: наблюдение за клиническими исходами и анализ биологического действия препарата, то есть подавления активации и агрегации тромбоцитов с использованием адекватных лабораторных тестов. При этом обязательно надо учитывать индивидуальный генотип пациента, который может влиять на эффективность лекарственного средства. На примере клопидогрела, комплексный подход к анализу функциональной активности тромбоцитов и чувствительности к антиагрегантной терапии, должен учитывать генетические варианты цитохромов Р-450, метаболизирующих клопидогрел, АДФ-рецепторов P2Y12 и P2Y1, являющихся «мишенью» для препарата, а также те генетические факторы, которые определяют гиперагрегацию тромбоцитов, и в первую очередь – Leu33Pro GP IIIa (рис. 14).

Рис. 14. Комплексный подход к анализу функциональной активности тромбоцитов и чувствительности к клопидогрелу с учетом молекулярно-генетических механизмов активации тромбоцитарного гемостаза

В настоящее время активно ведется поиск новых методов анализа функциональной активности тромбоцитов как таковой, а также остаточной реактивности тромбоцитов на фоне антиагрегантной терапии. Результаты исследований подтверждают наш тезис о необходимости проведения комплексного анализа. Так Marcucci R. и соавт. показали, что только лабораторные тесты с использованием нескольких агонистов могут адекватно отразить состояние тромбоцитарного гемостаза и выявить высокую реактивность тромбоцитов на фоне терапии (Marcucci R. et al, 2010). Однако до сих пор нет четкого алгоритма обследования пациентов с целью выявления факторов риска высокой реактивности тромбоцитов, в том числе генетических, и рекомендаций по тактике анитиагрегантной терапии, основывающихся на проведенных лабораторных исследованиях. Помимо трудностей лабораторного определения состояния «резистентности» к антиагрегантным препаратам, существует проблема преодоления низкой чувствительности к лекарственному средству, решить которую возможно только с позиций персонализированной медицины. Уже появились сообщения о снижении функциональной активности тромбоцитов путем увеличения дозы аспирина до 325 мг/день (Brambilla M. et al, 2010), а также о возможном повышении дозы клопидогрела или замене клопидогрела на антагонисты АДФ-рецепторов последнего поколения, GP IIb-IIIa блокаторы, антагонисты рецепторов тромбина (Zurn C. S., Geisler T., Gawas M., 2010; Barrero A. E., 2010).

Мы сформулировали алгоритм лабораторного молекулярно-генетического исследования для оценки функционального состояния тромбоцитов у больных с ССЗ и определения индивидуальной чувствительности к антиагрегантным препаратам (рис. 15).

Рис. 15. Алгоритм лабораторного молекулярно-генетического исследования для оценки функционального состояния тромбоцитов у больных с ССЗ и определения индивидуальной чувствительности к антиагрегантным препаратам

Перед назначением клопидогрела рекомендуется провести анализ функциональной активности тромбоцитов, причем не ограничиваться одним методом, а использовать несколько подходов: АДФ-индуцированная агрегация при нескольких концентрациях индуктора (2,5, 5 и 10 мкМ АДФ), коллаген-индуцированная агрегация, исследования на проточном цитометре с расчетом параметров K1 и К2.

Следующее определение функциональной активности тромбоцитов проводится через 5-7 дней терапии клопидогрел 75 мг/день + аспирин 100 мг/день. Одновременно проводится молекулярно-генетический анализ Leu33Pro GP IIIa, C18T P2Y12, T13254C GP VI, G6986A CYP3A5 и A-842G COX-1. Если у пациента отсутствуют указанные мутации, а показатели функциональной активности тромбоцитов снизились по сравнению с исходной точкой, можно сделать заключение об эффективном действии антиагрегантной терапии и продолжать прием клопидогрела и аспирина в стандартной дозировке 75 мг/день и 100 мг/день, соответственно, в течении рекомендованного срока согласно диагнозу. Наличие мутаций T13254C GP VI и A-842G COX-1 при высокой степени коллаген-индуцированной агрегации и отсутствии изменений параметров K1 и К2 в сторону уменьшения по сравнению с исходными говорят о низкой индивидуальной чувствительности к аспирину. В таком случае может быть рекомендована коррекция дозы аспирина до 325 мг/день, доза клопидогрела остается стандартной (75 мг/день). Сохраняющаяся высокая функциональная активность тромбоцитов на фоне двойной антиагрегантной терапии клопидогрел (75 мг/день) + аспирин (100 мг/день) по сравнению с исходной с показателями степени индуцированной агрегации тромбоцитов больше 50% для всех индукторов и параметрами K1>10% и К2>50%, особенно при детекции у данных пациентов генетических вариантов Leu33Pro GP IIIa, C18T P2Y12 или G6986A CYP3A5, говорит о развитии «клопидогрел-резистентности» и повышенном риске повторных сердечно-сосудистых событий. В таком случае следует пересмотреть тактику антиагрегантной терапии. В первую очередь, может быть рекомендовано увеличение дозы клопидогрела до 150 мг/день, доза аспирина остается стандартной (100 мг/день). Если дальнейшее наблюдение за больным не покажет положительной динамики в снижении функциональной активности тромбоцитов, следует поставить вопрос о смене антиагрегантной терапии – замене клопидогрела на более быстродействующие антагонисты P2Y12, в том числе не требующие метаболизации ферментом CYP3A5 (особенно актуально у носителей мутации G6986A CYP3A5), или на ингибиторы GP IIb-IIIa рецепторов и рецепторов тромбина.

Контроль за антиагрегантной терапией необходимо продолжать, особенно если была проведена коррекция дозы аспирина и клопидогрела, для предотвращения как состояний с сохраняющейся высокой активностью тромбоцитов (остается риск повторных ССЗ), так и геморрагических осложнений при чрезмерном подавлении тромбоцитарной функции. При выборе тактики антиагрегантной терапии особое внимание необходимо уделять соблюдению баланса между уменьшением риска ССЗ и одновременной минимизацией риска геморрагических осложнений, это положение согласуется с мнением других исследователей (Merlini P., 2010).

ВЫВОДЫ:

1.  Выявлены следующие генетические факторы повышенного риска развития ССЗ: Leu33Pro GP IIIa, Thr145Met GP Ibα, C807T GP Ia и G36T P2Y12 у мужчин в возрасте до 45 лет и T13254C GP VI, Leu33Pro GP IIIa и G36T P2Y12 у пациентов обоего пола в возрасте старше 45 лет. Генетический вариант C18T P2Y12 оказался протективным в отношении развития инфаркта миокарда у мужчин моложе 45 лет.

2.  Генетические варианты рецепторов GP IIb-IIIa, P2Y12, GP VI и GP Ia-IIa определяют повышенную функциональную активность тромбоцитов у пациентов с ССЗ и доноров без тромбоэмболических и сердечно-сосудистых заболеваний в анамнезе.

3.  Количественные характеристики тромбоцитарных рецепторов GP IIb-IIIa, P2Y12 и P2Y1, такие как число рецепторов на поверхности клетки и уровень экспрессии соответствующих генов, коррелируют с показателями функциональной активности тромбоцитов и могут влиять на индивидуальную чувствительность к антиагрегантным препаратам – селективным блокаторам GP IIb-IIIa рецепторов, аспирину и ингибиторам АДФ-рецепторов, соответственно.

4.  Количество рецепторов GP IIb-IIIa на мембране тромбоцитов в большей степени определяет индивидуальную чувствительность к селективным блокаторам GP IIb-IIIa, тогда как мутация Leu33Pro GP IIIa может иметь значение при терапии препаратами антительной природы.

5.  Генетические варианты Leu33Pro GP IIIa, C18T P2Y12 и G6986A CYP3A5 модулируют индивидуальную чувствительность к антиагрегантной терапии клопидогрелом, в то время как генетические варианты T13254C GP VI и A-842G COX-1 влияют на индивидуальную чувствительность к аспирину.

6.  Разработанный новый метод на основе проточной цитометрии с использованием специфичных флуоресцентно-меченых антител позволяет оценивать функциональную активность тромбоцитов и эффективность антиагрегантной терапии клопидогрелом и аспирином. В качестве показателей активности тромбоцитов предложены расчетные параметры К1 и К2, которые характеризуют относительные изменения количества GP IIb-IIIa и Р-селектина на поверхности клетки в ходе активации.

7.  Сформулированный на основании проведенной работы алгоритм лабораторного молекулярно-генетического исследования больных с ССЗ позволяет определить индивидуальную чувствительность к антиагрегантным препаратам клопидогрелу и аспирину и осуществить патогенетически обоснованную терапию с позиций персонализированной медицины.

Практические рекомендации

1.  Для выявления генетических факторов высокого риска развития сердечно-сосудистых заболеваний и гиперагреации тромбоцитов показано тестирование следующих полиморфизмов – Leu33Pro GP IIIa, G36T P2Y12, С807Т GP Ia и Thr145Met GP Ibα у мужчин в возрасте до 45 лет, и Leu33Pro GP IIIa, G36T P2Y12 и Т13254С GP VI у лиц обоего пола старше 45 лет.

2.  Для оценки функциональной активности тромбоцитов и эффективности антиагрегантной терапии необходимо использовать несколько лабораторных методов, одним из которых является определение количества рецепторов GP IIb-IIIa и Р-селектина на поверхности тромбоцитов с помощью проточной цитометрии. В качестве показателей тромбоцитарной активности следует рассчитывать параметры К1 и К2, которые характеризуют относительные изменения количества GP IIb-IIIa и Р-селектина на поверхности клетки в ходе индуцированной активации с 10мкМ АДФ. При значении К1≤10 % и К2≤50% действие антиагрегантного препарата оценивается как эффективное, значения К1>10% и К2>50% считаются маркерами высокой реактивности тромбоцитов на фоне антиагрегантной терапии или неэффективности действия антиагрегантного препарата.

3.  В основе алгоритма обследования пациентов с сердечно-сосудистыми заболеваниями, которым показан прием антиагрегантных препаратов, должен лежать комплексный подход, учитывающий генетические варианты G6986A CYP3A5 – цитохрома Р-450, метаболизирующего клопидогрел, C18T P2Y12 – АДФ-рецепторов P2Y12, являющихся «мишенью» для препарата, а также те генетические факторы, которые определяют гиперагрегацию тромбоцитов, и в первую очередь – Leu33Pro GP IIIa. Для определения индивидуальной чувствительности к аспирину необходимо проводить генотипирование T13254C GP VI и A-842G COX-1.

Публикации по теме диссертационного исследования

Статьи, опубликованные в журналах по перечню ВАК Минобрнауки РФ

1.  Sirotkina O. V. The combination of glycoprotein IIIa Pl(A) polymorphism with polymorphism of serotonin transporter as an independent strong risk factor for the occurrence of coronary thrombosis / Schwartz E., Demidova D., Sirotkina O., Kudinov S. // Molecular Genetics and Metabolism. – 2003. – V.79. – №3. – P.229-230.

2.  Сироткина аллельных вариантов генов, определяющих склонность к тромбофилии, у мужчин, перенесших инфаркт миокарда в молодом возрасте / , , // Медицинский академический журнал. – 2004. – Т.4. - №1. – С.29-35.

3.  Сироткина мутация гена GP IIIa в российской популяции - Leu40Arg, сцепленная с Leu33Pro / , , . // Генетика. – 2005. – Т.41. - №6. – С.683-687.

4.  Сироткина гликопротеина IIb-IIIa в спонтанной агрегации тромбоцитов / , , Л. И Бурячковская, И. А Учитель, С. Г Хаспекова, , // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 2007. – Т.143. - №4. – С.398-401.

5.  Sirotkina O. V. Effect of platelet glycoprotein IIb-IIIa number and glycoprotein IIIa Leu33Pro polymorphism on platelet aggregation and sensitivity to glycoprotein IIb-IIIa antagonists / O. V. Sirotkina, S. G. Khaspekova, A. M. Zabotina, Y. V. Shimanjva, A. V. Mazurov // Platelet. – 2007. – V.18. – №7. – P.506-514.

6.  Сироткина факторы риска развития инфаркта миокарда у мужчин молодого возраста в северо-западном регионе России / , , , // Кардиология. – 2007. – Т.7. – С.29-34.

7.  Сироткина содержания гликопротеина IIb-IIIa (αIIb/β3 интегрина) у здоровых доноров. Влияние на агрегационную активность тромбоцитов и эффективность действия аспирина / , , // Биомедицинская химия. – 2008. – Т.54. - №3. – С.361-371.

8.  Сироткина антиагрегантной терапии клопидогрелом у пациентов, перенесших инфаркт миокарда с подъемом сегмента ST / , , // Кардиоваскулярная терапия и профилактика. – 2009. – Т.8. – №1. – С.51-55.

9.  Сироткина варианты АДФ-рецептора тромбоцитов P2Y12, ассоциированные с изменением функциональной активности тромбоцитов и развитием сердечно-сосудистых заболеваний / , , // Генетика. – 2009. – Т.45. – №.2. – С.247-253.

10.  Сироткина риска тромботических осложнений и прогноз у больных с хронической формой ишемической болезни сердца / , , // Кардиология. – 2009. – Т.11. – С.4-10.

11.  Сироткина -генетический анализ АДФ-рецепторов тромбоцитов у здоровых лиц и пациентов, принимающих клопидогрел / , , // Технологии живых систем. – 2009. – Т.8. – С.46-52.

12.  Сироткина к клопидогрелу у больных с острым коронарным синдромом / , , // Терапевтический архив. – 2010. – Т.8. – С.14-19.

13.  Сироткина методы в оценке функциональной активности тромбоцитов у больных с сердечно-сосудистыми заболеваниями / , , // Медицинская иммунология. – 2010. – Т.12. – №3. – С.213-218.

14.  Сироткина -генетические механизмы активации тромбоцитов и чувствительности к антиагрегантным препаратам у больных сердечно-сосудистыми заболеваниями / // Медико-биологические и социально-психологические проблемы безопасности в чрезвычайных ситуациях. – 2010. – Т.4. – №1. – С.69-76.

15.  Сироткина к аспирину у больных с острым коронарным синдромом / , , // Кардиоваскулярная терапия и профилактика. – 2010. – Т.6. – С.40-46.

Патенты на изобретение

16.  Сироткина оценки эффективности действия антиагрегантных препаратов на организм человека: Заявка на патент № 000 / , ,

Учебно-методические пособия

17.  Сироткина факторы риска развития сердечно-сосудистых заболеваний: Пособие для врачей / , , . – Санкт-Петербург, 2006. – Изд. СПбГМУ им. акад. . – C.27.

Статьи в сборниках

18.  Сироткина тромбофильных состояний / , , // В сб. Молекулярно-биологические технологии в медицинской практике. – Вып. 6. – Новосибирск: Альфа Виста, 2004. – C.127-143.

19.  Сироткина факторы риска развития инфаркта миокарда у мужчин молодого возраста / , , // В сб. Молекулярно-биологические технологии в медицинской практике. – Вып. 6. – Новосибирск: Альфа Виста, 2004. – C.24-58.

20.  Сироткина антитромботических препаратов / , , // В сб. Молекулярно-биологические технологии в медицинской практике. – Вып. 9. – Новосибирск: Альфа Виста, 2006. – C.67-83

21.  Сироткина причины гиперагрегации тромбоцитов / // В сб. Бреслеровские чтения. – 2007.- C.203-214.

22.  Р2-рецепторы тромбоцитов / , , // В сб. Молекулярно-биологические технологии в медицинской практике. – Вып. 12. – Новосибирск: Альфа Виста, 2008. – C.33-41.

23.  Сироткина функциональной активности тромбоцитов: история, современность, перспективы / // Сб. науч. тр. Молекулярно-биологические технологии в медицинской практике. – Вып. 15. – Новосибирск: АртЛайн, 2010. – C. 60-74.

Прочие научные публикации

24.  Сироткина метода проточной цитометрии для определения количества гликопротеиновых рецепторов GP IIb/IIIa на поверхности тромбоцитов / , , // Клинико-лабораторный консилиум. – 2006. – Т.13. – С.28-34.

25.  Сироткина -генетические основы наследственных тромбофилий / // Клинико-лабораторный консилиум. – 2006. – Т.13. – С.21-27.

26.  Сироткина антитромботических препаратов / , // Тромбоз, гемостаз и реология. – 2007. – Т.2. – С.3-15.

27.  Сироткина исследование как основа для индивидуализированного подхода к лекарственной терапии / , , // Клинико-лабораторный консилиум. – 2009. – Т.3. – С.36-43.

28.  Сироткина дефекты гена рецептора тромбоцитов IIb/IIIa, ассоциированные с гиперагрегацией / , , // Фундаментальные исследования и прогресс в кардиологии: Сборник тезисов Конгресса ассоциации кардиологов стран СНГ. – Санкт-Петербург. – Научно-практический журнал «Кардиология СНГ». – 2003. – Т.1. – №1. – С.263.

29.  Сироткина мутационных повреждений гена P2Y12, кодирующего АДФ-рецептор тромбоцитов, в патогенезе тромбофилических состояний / , , // Современные достижения клинической генетики: Материалы Всероссийской научно-практической конференции, Москва. – Медицинская генетика. – 2003. – Т.2. – №10. – С.440.

30.  Сироткина дефекты гемостаза в развитии инфаркта миокарда в молодом возрасте / , , // Современные достижения клинической генетики: Материалы Всероссийской научно-практической конференции. – Москва. – Медицинская генетика. – 2003. – Т.2. – №10. – С.447.

31.  Сироткина мутационных повреждений гена P2Y12, кодирующего АДФ-рецептор тромбоцитов / , , // Фундаментальные науки – медицине: Материалы конференции. – Москва. – М.: Фирма «Слово», 2003. – 176с., C.23-25.

32.  Сироткина структурные полиморфизмы гена P2Y12, кодирующего АДФ-рецептор тромбоцитов, и их функциональное значение / , , // Биология-наука XXI века: Сборник тезисов 8-ой Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых. – Пущино. – 2004. – C.24.

33.  Sirotkina O. The new mutation in the GPIIIa gene associated with high platelet aggregation is found in Russia / Sirotkina O., Sheydina A., Vavilova T., Schwarzman A. // 18th International Congress on Thrombosis, Slovenia, Ljubljana. – Pathofysiology of Haemostasis and Thrombosis. – 2004. – Suppl. – P. OC080.

34.  Сироткина структурные полиморфизмы кодирующей области гена АДФ-рецептора тромбоцитов P2Y12 / , // Молодые ученые – промышленности Северо-Западного региона: Материалы семинаров политехнического симпозиума. – СПб.: Изд-во Политехн. Ун-та, 2004. – 167с. – C.92-93.

35.  Сироткина носительство аллельных вариантов генов системы тромбообразования как фактор риска развития инфаркта миокарда у мужчин молодого возраста / , , // Российская кардиология: от центра к регионам: Материалы Российского национального конгресса кардиологов, Томск, Россия. – Кардиоваскулярная терапия и профилактика. – 2004. – Прил. – C.447.

36.  Сироткина механизмы гиперагрегации тромбоцитов: аллельные варианты гена АДФ-рецептора P2Y12 / , , // Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечно-сосудистой хирургии: Материалы второй всероссийской научной конференции (с международной участием), Москва. – 2005. – C.250.

37.  Сироткина критерии селективного применения антитромботических препаратов варфарина и плавикса / , , // Материалы V съезда Российского общества медицинских генетиков, Уфа. - Медицинская генетика. – 2005. – Т.4. – №6. – С.267.

38.  Сироткина SNPs гена АДФ-рецептора тромбоцитов P2Y12 и риск развития инфаркта миокарда / , // Биология-наука XXI века: Сборник тезисов 9-ой Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых. – Пущино. – 2005.

39.  Sirotkina O. The new single nucleotide polymorphisms of ADP receptor P2Y12 gene affected platelet aggregation and myocardial infarction development were found in Russia / Sirotkina O., Novikova A., Vavilova T. // Abstract of XX International Congress of the International Society on Thrombosis and Haemostasis, Sydney, Australia. - Journal of Thrombosis and Haemostasis. – 2005. – V.3. – Suppl.1. – P. P0980.

40.  Sirotkina O. V. New genetic risk factor for myocardial infarction development in patients with arterial hypertension / Novikova A. M., Sirotkina O. V. // International Congress “Hypertension – from Korotkov to present days”: Abstract book. – Saint-Petersburg, Russia. – 2005. – P.97-98.

41.  Sirotkina O. V. The analysis of the relationship between the combined risk of the cardiovascular disease development’s factors and the number of the genetic markers associated with the cardiovascular pathology in the healthy young men population / Chercashin D. V., Berkovitch O. A., Sirotkina O. V. // International Congress “Hypertension – from Korotkov to present days”: Abstract book. – Saint-Petersburg, Russia. – 2005. – P.25.

42.  Сироткина наследственных факторов в формирование наследственной предрасположенности к развитию сердечно-сосудистой патологии / , , // Перспективы российской кардиологии: Материалы Российского национального конгресса кардиологов, Москва. – Кардиоваскулярная терапия и профилактика. – 2005. – Т.4. – №4. – С.270.

43.  Сироткина активности тромбоцитов у больных с различным генотипом Leu33Pro GP IIIa, принимающих плавикс после чрескожной ангиопластики коронарных артерий / , , // Материалы Одиннадцатого Всероссийского съезда сердечно-сосудистых хирургов, Москва. - Бюллетень НЦССХ им. РАМН. – 2005. – Т.6. – №5. – С.297.

44.  Sirotkina O. V. The Leu33Pro GP IIIa genetic variants and quantity of the GPIIb/IIIa receptors on platelet’s membrane are the factors influenced the platelet hyperaggregation / O. V. Sirotkina, A. M. Novikova, M. I. Kadinskaya, T. V. Vavilova, A. L. Schwarzman // Abstract of Eurepean Human Genetics Conference, Amsterdam, The Nederlands. - European Journal of Human Genetics. – 2006. – V.14. – Suppl.1. – C.258-259.

45.  Сироткина PlA1/A2 полиморфизма гликопротеина IIIa с агрегационной активностью тромбоцитов и чувствительностью к антагонистам гликопротеина IIb/IIIa / , , // От диспансеризации к высоким технологиям: Материалы Российского национального конгресса кардиологов, Москва. – Кардиоваскулярная терапия и профилактика. – 2006. – Т.5. – С.343.

46.  Сироткина факторы риска развития тромбозов и функциоанльная активность тромбоцитов у больных, принимающих плавикс и аспирин после чрескожных вмешательств на коронарных артериях / , , // От диспансеризации к высоким технологиям: Материалы Российского национального конгресса кардиологов, Москва. – Кардиоваскулярная терапия и профилактика. – 2006. – Т.5. – С.383.

47.  Сироткина варианты гена P2Y12 – распределение в двух возрастных группах популяции Северо-Запада России и патогенетическое действие / , , // Биология – наука XXI века: Сборник тезисов 10-ой Пущинской школы-конференции молодых ученых. – Пущино. – 2006. – C.49.

48.  Sirotkina O. V. Variations of platelet glycoprotein IIb-IIIa quantity affects platelet aggregation and sensitivity to glycoprotein IIb-IIIa antagonists / A. V. Mazurov, S. G. Khaspekova, A. M. Zabotina, Y. V. Shimanova, O. V. Sirotkina // Abstracts XXIst Congress of the International Sosiety on Thrombosis and Haemostasis, Geneva, Switzerland. – Journal of Thrombosis and Haemostasis. – 2007. – V.5. – Suppl.2. – P.P-T-296.

49.  Sirotkina O. V. The GP IIb gene expression, Ile843Ser GP IIb gene polymorphism, glycoprotein IIb-IIIa number and platelet aggregation in healthy donors / O. V. Sirotkina, A. M. Zabotina, E. L. Zheleznjak, A. N. Stolyarova, T. V. Vavilova // Abstracts of Eurepean Human Genetics Conference, Nice, France. – European Journal of Human Genetics. – 2007. – V.15. – Suppl.1. – C.200.

50.  Сироткина особенности индивидуального ответа на антиагрегантную терапию аспирином / , // Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины: Сборник тезисов к научно-практической конференции молодых ученых. – Санкт-Петербург. – 2007. – C.49-51.

51.  Сироткина коллагеновых рецепторов T13254C GPVI и C807T GPIa, количество гликопротеинов GPVI и GPIa-IIa на мембране тромбоцитов и их функциональная активность у здоровых доноров / , // Молодые ученые – промышленности Северо-Западного региона: Материалы конференций Политехнического симпозиума 2007 года. – СПб.: Изд-во Политехн. Ун-та, 2007. – 198 с. – C.128-129.

52.  Сироткина генетических вариантов тромбоцитарного рецептора коллагена у больных, перенесших инфаркт миокарда, и в контрольной группе / , , // Тромбозы в клинической практике: факторы риска, диагностика, терапия: Материалы Всероссийской конференции с международным участие, Санкт-Петербург, Россия. – Клинико-лабораторный консилиум. – 2007. – Т.16. – С.74.

53.  Сироткина изменения агрегации тромбоцитов у больных ИБС, принимающих аспирин, в зависимости от генетических вариантов рецептора фибриногена (PLA1/A2 GPIIIa) и циклооксигеназы 1 (A-842G COX-1) / , , ., , // Тромбозы в клинической практике: факторы риска, диагностика, терапия: Материалы Всероссийской конференции с международным участие, Санкт-Петербург, Россия. – Клинико-лабораторный консилиум. – 2007. – Т.16. – С.87.

54.  Sirotkina O. The T13254C GPVI and C807T GPIa gene polymorphisms, glycoproteins GPVI and GPIa-IIa number and collagen-induced platelet aggregation in healthy donors / Stolyarova A., Bychkova N., Vavilova T., Sirotkina O. // Abstracts of 52nd GTH Congress, Wiesbaden. – Hamostaseologie. – 2008. – V.1-2. – P. A78.

55.  Sirotkina O. The variability of the platelet collagen receptor GPVI quantity measured by flow cytometry as a result of GP VI gene / O. Sirotkina, A. Stolyarova, chkova, T. Vavilova // Abstracts of the XXIst International Symposium on Technological Innovations in Laboratory Hematology, Sydney, Australia. – International Journal of Laboratory Hematology. – 2008. – V.30. – Suppl.1. – P.117.

56.  Sirotkina O. The mutant allele and expression of the ADP receptor gene P2Y12 as a novel molecular factor influencing platelet activity / O. Sirotkina, A. Stolyarova, N. Bogankova, T. Vavilova // Abstracts of the XXIst International Symposium on Technological Innovations in Laboratory Hematology, Sydney, Australia. – International Journal of Laboratory Hematology. – 2008. – V.30. – Suppl.1. – P.127.

57.  Sirotkina O. V. Contribution of gene sequence variant CYP3A4*1b of the hepatic cytochrome P450 3A4 enzyme to variability in indnvidual response to clopidogrel / A. N. Stolyarova, O. V. Sirotkina // Abstracts of Eurepean Human Genetics Conference, Barselona, Spain. – European Journal of Human Genetics. – 2008. – V.16. – Suppl.2. – P.305.

58.  Sirotkina O. Efficiency of clopidorgel in patients with ST-elevation myocardial infarction (STEMI) and key platelet receptors gene polymorphisms / O. Sirotkina, A. Stolyarova, N. Bogankova, E. Bogdanova, S. Boldueva, T. Vavilova // Abstracts from the 20th International Congress on Thrombosis, Athens, Greece. – Pathofysiology of Haemostasis and Thrombosis. – 2008. – Suppl. – P. A58.

59.  Сироткина антиагрегантной терапии у пациентов, перенесших инфаркт миокарда, в зависимости от полиморфизма рецепторов тромбоцитов и цитохромов Р-450 / , , // Повышение качества и доступности кардиологической помощи: Материалы Российского национального конгресса кардиологов, Москва. – Кардиоваскулярная терапия и профилактика. – 2008. – Т.7. – №6. – Прил.1. – С.341.

60.  Сироткина вариации тромбоцитарных рецепторов и их вклад в гиперагрегацию тромбоцитов, риск инфаркта миокарда и чувствительность к антиагрегантной терапии клопидогрелем / , , // Фундаментальные науки – медицине: Тезисы докладов на конференциях и семинарах по научным направлениям Программы в 2008 году. – М.: Фирма «Слово», 2008. – 240 с. – C.48-49.

61.  Сироткина экспрессионного профиля генов тромбоцитарных рецепторов – зависимость от возраста и влияние на функциональную активность тромбоцитов / , , // Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечно-сосудистой хирургии: Материалы IV Всероссийской конференции (с международным участием). – Москва. – 2009. – C.469-470.

62.  Sirotkina O. V. The P2Y1, P2Y12, GPIIb and GPIIIa gene expressions in platelets of healthy donors and patients with myocardial infarction / O. V. Sirotkina, N. A. Bogankova, A. L. Schwarzman, T. V. Vavilova // Abstracts XXIIst Congress of the International Sosiety on Thrombosis and Haemostasis, Boston, US. – Journal of Thrombosis and Haemostasis. – 2009. – V.7. – Suppl.2. – P. PP-TH-025.

63.  Сироткина подходы к оценке функциональной активности тромбоцитов – использование проточной цитометрии и генетического анализа / , , // Лабораторная медицина в свете Концепции развития здравоохранения России до 2020 года: Труды научно-практической конференции. – Москва. – 2009. – C.184-185.

64.  Сироткина экспрессии и генетические варианты тромбоцитарных рецепторов Р2 у больных, перенесших инфаркт миокарда, и здоровых доноров / , , // Материалы V съезда Вавиловского общества генетиков и селекционеров. – Москва. – 2009. – C.494.

65.  Сироткина профиль и генетические варианты АДФ-рецепторов у здоровых лиц и пациентов, принимающих клопидогрель / , , // Тромбозы, кровоточивость, ДВС-синдром: современные подходы к диагностике и лечению: Материалы Всероссийской конференции с международным участием, Москва. – Тромбы, кровоточивость и болезни сосудов. – 2009. – Прил.7. – C.115-116.

66.  Сироткина подходы к оценке функциональной активности тромбоцитов с использованием проточной цитометрии / , , // Кардиология: реалии и перспективы: Материалы Российского национального конгресса кардиологов, Москва. – Кардиоваскулярная терапия и профилактика. – 2009. – Т.8. – №6. – Прил.1. – С.330.

67.  Сироткина вариабельность тромбоцитарных Р-2 рецепторов и новые маркеры эффективности антиагрегантной терапии клопидогрелем / , , // Фундаментальные науки – медицине: Тезисы докладов на конференциях и семинарах по научным направлениям Программы в 2009 году. – М.: Фирма «Слово». – 2009. – 272 с. - C.33-34.

68.  Сироткина клопидогрела – полиморфизм и уровень АДФ-рецепторов / , , // Материалы VI Съезда Российского общества медицинских генетиков, Ростов-на Дону. – Медицинская генетика. – 2010. – Прил. – C.165.

69.  Sirotkina O. Molecular-genetic analysis of platelet P2 receptors in healthy donors and patients treated with antiplatelet agents / O. Sirotkina, N. Bogankova, A. Laskovets, T. Vavilova // Abstracts from the 21st International Congress on Thrombosis, Milan, Italy. - Pathofysiology of Haemostasis and Thrombosis. – . – V.37. – Suppl.1. – P. A150.

70.  Sirotkina O. V. Glycoprotein IIb-IIIa content and platelet aggregation in healthy volunteers and patients with acute coronary syndrome / Yakushkin V. V., Zyuryaev I. T., Khaspekova S. G., Sirotkina O. V., Ruda M. Ya., Mazurov A. V. // Platelets – Past, Present and Future: Abstracts of the Nottingham Platelet Conference, Nottingham, UK. – Platelets. – 2010. – V.21. – №5. – P.394.

71.  Sirotkina O. The P2 receptors measuring as new approach in assess of clopidogrel efficacy / O. Sirotkina, N. Bogankova, L. Gaykovaya, A. Lipunova, S. Boldueva, T. Vavilova // Laboratory Medicine in Health Care: Abstracts of First European Joint Congress of EFCC and UEMS, Lisbon, Portugal. – 2010. – P.80.

72.  Sirotkina O. New sensitive markers of platelet’s reactivity in omega-3-acid ethyl esters treated donors / L. Gaykovaya, O. Sirotkina, N. Bogankova, A. Laskovets, G. Kuharchik, T. Vavilova // Laboratory Medicine in Health Care: Abstracts of First European Joint Congress of EFCC and UEMS, Lisbon, Portugal. – 2010. – P.81.

73.  Sirotkina O. Analysis of platelet’s functional activity by immunological techniques in patients with cardiovascular disease / N. Bogankova, O. Sirotkina, A. Laskovets, L. Gaykovaya, T. Vavilova // Abstracts of XXIII International Symposium on Technological Innovations in Laboratory Hematology, Brighton, UK. – Int. Jnl. Lab. Hem. – 2010. – V.32. – Suppl.1. – P.97-98.

74.  Сироткина молекулярные методы в оценке функции тромбоцитов и эффективности антиагрегантов / , // Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине: Материалы I международной научно-практической конференции. – Москва. – 2010. – C.198.