Новая технология культивирования высших базидиомицетов в искусственно замкнутой экосистеме (стр. 1 )

На правах рукописи

НОВАЯ ТЕХНОЛОГИЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ВЫСШИХ БАЗИДИОМИЦЕТОВ В ИСКУССТВЕННО ЗАМКНУТОЙ ЭКОСИСТЕМЕ

03.01.06 – биотехнология

(в том числе бионанотехнологии)

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Саратов - 2011

Работа выполнена в Федеральном государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Саратовский государственный аграрный

университет им. »

Научный руководитель: кандидат биологических наук, доцент

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

старший научный сотрудник,

доктор биологических наук, профессор,

Ведущая организация: ФГОУ ВПО «Кубанский государственный

аграрный университет»

Защита состоится «17» февраля 2011 г. в 1200 часов на заседании диссертационного совета Д 220.061.04 при ФГОУ ВПО «Саратовский государственный аграрный университет им. » 35, диссертационный зал.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГОУ ВПО «Саратовский ГАУ им. » 35.

Автореферат диссертации разослан «13» января 2011 г. и размещен на сайте университета www. *****.

Отзывы на автореферат направлять г. Саратов, Театральная пл., 1, ФГОУ ВПО «Саратовский ГАУ им. », ученому секретарю диссертационного совета.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

доктор биологических наук, профессор

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Современное развитие грибоводства в России выявило потребность создания новых интенсивных технологий, удовлетворяющих современным требованиям: сокращение сроков обрастания субстрата и выгонки плодовых тел, устойчивость к конкурентной микрофлоре, высокая продуктивность и товарные качества мицелия и плодовых тел.

Несмотря на возрастающие объемы культивирования вешенки, промышленное производство в значительной степени сдерживается из-за отсутствия продуктивных отечественных сортов и штаммов (Таксономический анализ..., 2002). На сегодняшний день в государственном реестре селекционных достижений РФ зарегистрированы четыре сорта, относящиеся к вешенке устричной, и один сорт вешенки флоридской. Общеизвестно, что непрерывное культивирование какого-либо сорта гриба в течение длительного времени неизбежно приводит к потере урожайности в результате генетического «старения». Поэтому, получение новых гибридов вешенки, обладающих повышенной урожайностью по сравнению с родительскими производственными штаммами, является наиболее актуальной задачей в области селекции грибов.

Не менее важной задачей является защита субстрата для получения плодовых тел от контаминации посторонней микрофлорой при помощи экологически чистых биопрепаратов, не способных оказывать негативное влияние на окружающую среду и здоровье потребителя. Современные способы выращивания мицелия и плодовых тел высших грибов-базидиомицетов основаны на интенсивной стерильной технологии в искусственно замкнутой экосистеме – специальных контейнерах с использованием растительных субстратов, следуя которой возможно получение быстрого и обильного урожая. Однако, применение этой технологии связано со значительными материальными и энергетическими затратами, включающими наличие специализированных бактериологических лабораторий и помещений для подготовки субстрата и выращивания мицелия и плодовых тел грибов небольшими грибоводческими фирмами.

В связи с этим, важной задачей современной грибной индустрии является создание новых технологий, позволяющих при незначительном повышении материальных затрат получить высокий урожай плодовых тел грибов. Выявлению различных факторов, влияющих на продуктивность плодовых тел, посвящен ряд работ (Eger, Wang, Anderson, 1972; Eger, 1974; Larraya, 2002).

Цель работы: разработка новой технологии культивирования мицелия и плодовых тел Pleurotus ostreatus, позволяющей с минимальными затратами в относительно простых условиях получать качественный мицелий и высокий урожай плодовых тел гриба.

Задачи исследования:

1.  Получить новые гибриды P. ostreatus путем скрещивания производственного и полученного из природных объектов штаммов вешенки.

2.  Оценить влияние различных стимуляторов на интенсивность роста мицелия изучаемых штаммов гриба на плотных и жидких питательных средах.

3.  Провести сравнительный анализ урожайности вешенки на растительных субстратах, обработанных перекисью водорода.

4.  Изучить влияние бактерий Bacillus subtilis 26D – основного действующего вещества промышленного биофунгицида «Фитоспорин-М» на характер взаимодействия P. ostreatus и естественного контаминанта - плесневого гриба р. Trichoderma.

5.  Оценить урожайность изучаемых штаммов на субстрате, обработанном препаратом «Фитосприн-М».

6.  Провести промышленные испытания разработанной технологии культивирования P. ostreatus.

Научная новизна. Получен новый гибридный штамм Pleurotus ostreatus Т5, при скрещивании P. оstreatus ВС (промышленный штамм) P. оstreatus L (дикий штамм). Обоснована эффективность применения естественного стимулятора – экстракта дубовой коры для интенсификации роста мицелия при мелкотоварном и промышленном культивировании грибов рода P. ostreatus - Вешенка.

Впервые изучено биотическое влияние промышленного биофунгицида «Фитоспорин-М», содержащего в качестве биологически активного агента клетки Bacillus subtilis 26Д, на жизнедеятельность P. ostreatus в частично замкнутой экосистеме.

Практическая значимость работы. Разработанная технология культивирования плодовых тел Pleurotus ostreatus в перспективе может быть использована грибоводческими хозяйствами России, как в мелкотоварных, так и промышленных объемах. Данная технология используется для выращивания грибов вешенки в -Весна» (г. Саратов), что подтверждается актом о внедрении от 01.01.2001. Материалы диссертационной работы вошли в учебное пособие «Проблемы и перспективы биологического разнообразия» (в соавторстве с , , 2008) для студентов, специализирующихся в области биоэкологии, рекомендованное и одобренное Учебно-методическим советом биотехнологического факультета СГАУ им. . Результаты диссертационной работы используются в учебном процессе при чтении лекций и написании дипломных работ в СГАУ им. .

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Получено 125 потенциально гибридных дикарионов, из которых было отобрано 5 изолятов, отличающихся от других по способности образовывать наибольшее количество примордиев при 22-25ºС

2. Экстракт дубовой коры стимулирует рост мицелия, что зафиксировано при выращивании клеток мицелия гибрида P. ostreatus Т5 на шуттель-апарате и лабораторном ферментере «Анкум-2M.

3. Штамм Bacillus subtilis 26Д, выделенный из препарата «Фитоспорин-М», с мицелиальной культурой P. ostreatus Т5 и спорами чистой культуры Trichoderma spp. на среде МС ингибировал развитие микромицета Trichoderma spp.

4. Наиболее оптимальным субстратом для получения плодовых тел гибрида является солома; обработка материала перекисью водорода служит не только дополнительным средством для поддержания необходимой стерильности, но и повышает общую урожайность.

5. При культивировании штамма P. ostreatus Т5 на субстрате, обработанном препаратом «Фитоспорин-М», происходит уменьшение времени появления примордий и общее увеличение урожайности в первую и вторую волны плодоношения.

Работа выполнена на кафедре экологии, биологии, физиологии и фармакологии ФГОУ ВПО «Саратовский государственный аграрный университет им. » в рамках научно-исследовательской темы: «Изучение биологических свойств высших грибов-базидиомицетов».

Апробация работы. Основные результаты работы представлены на:

- Всероссийской конференции «Актуальные проблемы ветеринарной патологии, физиологии, биотехнологии, селекции животных. Современные технологии переработки сельскохозяйственной продукции», (Саратов, 2008);

- Всероссийской научно-практическая конференция. «Актуальные проблемы ветеринарной патологии сельскохозяйственных животных и птиц», (Саратов, 2008);

- Международной научно-практической конференции, посвященной 95-летию госагроуниверситета. «Вавиловские чтения-2008», (Саратов, 2008).

Публикации. По теме диссертационной работы опубликовано 4 работы, в том числе 1 статья в журнале, рекомендованном ВАК РФ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей в себя материалы и методы исследования, результаты исследований и их обсуждение, а также заключения, выводов, предложений производству, списка используемых литературных источников, включающего 116 источников, в том числе 68 зарубежных авторов и приложений. Работа изложена на 144 страницах и иллюстрирована 22 рисунками, 20 таблицами.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Объекты, материалы и методы исследований

В работе использованы два штамма Pleurotus ostreatus БС и P. оstreatus L, полученные из коллекции грибов Института биохимии и физиологии растений и микроорганизмов Российской академии наук. Исследование проводили по следующей схеме (рис. 1).

Вегетативный мицелий данных штаммов культивировали на модифицированной среде Семерджиевой с добавлением экстракта дубовой коры.

Гибридизацию исходных штаммов проводили по методу Г. Фритше (1969), используя для этих целей моноспоровую селекцию.

Глубинное культивирование мицелия проводили в ферментере "Анкум-2М" в 6 л вышеуказанной жидкой среды, а также на шуттель-аппарате оригинальной конструкции.

Субстрат для посевного мицелия готовили из зерна пшеницы по традиционной методике (Бисько, 1983; 1987; Бухало, 1988; Методы приготовления…, 1982).

Для изучения оптимального состава субстрата для получения плодовых тел готовили следующие материалы: древесные опилки хвойных и лиственных пород деревьев, пшеничная солома.

Производственные испытания проводили на базе грибоводческого хозяйства комплекса -Весна», расположенного в г. Саратов. В качестве контрольного штамма в производственных экспериментах использовали штамм P. ostreatus HK-35 Duna, полученным из коллекции данного хозяйства.

Для создания дополнительной степени стерильности, при необходимости (рекомендуется для мелкотоварного производства), в субстрат при запаривании добавляли 6% перекись водорода (150 мл/л).

Фунгицидное воздействие препарата "Фитоспорин-М" изучали в процессе подготовки субстрата, культивирования и образования плодовых тел. Раствор препарата (1,5:1000) добавляли непосредственно в воду после запаривания субстрата и достижения температуры воды от 38-42ºС. Через 12 часов выдержки субстрата в воде с биофунгицидом, затем воду сливали, а субстрат использовали непосредственно для экспериментов.

Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью программы «STATISTICA 6.0» MS Office.

Рис. 1. Схема проведения эксперимента

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Подбор совместимых монокарионов и отбор фертильных дикарионов вешенки обыкновенной

В результате проведенных экспериментов по скрещиванию исходных штаммов было получено 125 потенциально гибридных дикарионов, из которых было отобрано 5 изолятов, отличающихся от других по способности образовывать наибольшее количество примордий при 22-25ºС, обозначенные, соответственно, Т1- Т5 (табл. 1).

Таблица 1 – Динамика образования примордиев

Т, (сут)	Штамм
BС	L	T5	T1	T2	T3	T4
n,(шт)
7	0,0	1,2±0,2	4,3±0,2	3,0+0,5	3,2±0,2	2,7±0,2	3,7±0,2
14	2,3±0,1	4,1±0,2	6,7±0,2	5,0±0,3	5,7±0,3	4,2±0,2	5,0±0,3
16	3,5±0,2	5,3±0,6	9,2±0,2	7,5±0,2	8,0±0,3	7,5±0,2	6,0±0,4
18	4,0±0,3	8,0±0,7	12,5±0,2	9,2±0,5	9,7±0,6	8,7±0,3	9,0±0,3
23	5,3±0,2	9,5±0,5	20,7±0,2	12,0±0,5	13,5±0,2	14,2±0,6	13,0±0,8
Всего	15,1±0,3	28,1±1,4	53,8±0,4	36,3±1,1	40,2±0,9	37,5±0,2	36,8±1,1

Предварительные эксперименты показали, что наиболее активным ростом мицелия на плотных питательных средах, а также более ранними сроками появления примордий обладает штамм Т5, что и позволило отобрать его для дальнейших исследований.

Полученный штамм способен так же, как и родительские, образовывать кластеры (сростки плодовых тел) от 2-4 до 20-30 шт. Шляпка 1-8 см в диаметре, в молодом возрасте выпуклая, светло-коричневая, затем – плоская, тарелкоподобная, более темная. Пластинки сероватые, ножка, как правило, центральная или слегка эксцентрическая, 4-6х0,5-1,6 см, серовато-белая. Мякоть плотная, сероватая (рис. 2).

Рис. 2. Морфология гибрида Т5

Культивирование штаммов P. ostreatus на различных питательных средах

В соответствии с поставленной целью по разработке технологии культивирования мицелия и плодовых тел P. ostreatus, были изучены показатели роста клеток штамма P. ostreatus Т5 на плотных питательных средах.

В качестве субстратов были выбраны модифицированная среда Семерджиевой МС и минеральная синтетическая среда, обычно применяемая для выращивания мицелия. Подбор питательной среды для проведения дальнейших экспериментов проводили при помощи сравнения коэффициентов роста мицелия на среде МС и минеральной синтетической среде (табл. 2).

В последующих экспериментах изучено влияние состава питательной среды на рост мицелия изучаемых штаммов.

Таблица 2 – Зависимость интенсивности роста мицелия изучаемых штаммов

от состава среды

Штамм	Ростовой коэффициент
источники углерода в минеральной среде	среда МС
мальтоза	лактоза	глюкоза
Т3	21,00±0,50	42,00±0,30	80,00±0,07	90,00±0,06
Т4	27,00±0,16	40,00±0,40	72,00±0,10	92,00±0,08
Т5	32,00±0,05	43,00±0,08	75,00±0,04	87,00±0,04
БС	18,00±0,08	38,00±0,15	52,00±0,08	70,00±0,50
L	22,00±0,05	43,00±0,16	57,00±0,30	64,00±0,08

Примечание. Ростовой коэффициент (Рк) - модифицированный ростовой коэффициент, который рассчитывали по формуле: Pk=Dhg/t; где D - диаметр колонии, в мм, g - плотность колонии, в баллах по 3-х балльной шкале, h - высота колонии, в мм, t - возраст колонии (сут).

Для исследования интенсивности роста мицелия в жидкой среде, оценивали степень влияния различных стимуляторов роста. Были использованы следующие добавки: подсолнечное масло, углекислый кальций, агар-агар, дубовый экстракт.

Установлено, что мицелий P. ostreatus наиболее интенсивно растет на средах с добавлением экстракта дубовой коры. Интенсификация роста происходит в результате стимулирования активности грибных фенолоксидаз, что подтверждается проведенными исследованиями при определении ростового коэффициента (Рк) (табл. 3).

Таблица 3 – Коэффициент зависимости роста мицелия (Рк) штаммов изучаемых грибов от

различных стимуляторов

Стимулятор роста	Штамм
Т5	БС	L	Т3	Т4
подсолнечное масло	14,00±0,07	7,00±0,04	11,0±0,3	9,00±0,70	9,50±0,06
дубовый экстракт	18,00±0,15	5,00±0,30	13,0±0,1	6,90±0,030	14,00±0,40
СаСО3	10,00±0,16	6,00±0,10	9,0±0,7	8,00±0,20	9,00±0,08
агар	9,00±0,30	8,00±0,04	7,0±0,3	5,00±0,06	7,00±0,06
без добавок	11,20±0,00	6,70±0,70	7,4±0,5	8,10±0,04	10,00±0,05

При выращивании клеток мицелия наиболее перспективного гибрида Т5 на лабораторном ферментере «Анкум-2M» также установлено, что добавка экстракта дубовой коры и скорость перемешивания существенно влияют на динамику нарастания клеток мицелия (рис. 3).