Исследование структурных основ субстратной специфичности карбоксипептидазы Т Thermoactinomyces vulgaris (стр. 2 )

Таким образом, Asp253 действительно функционирует и как позитивная, и как негативная детерминанта субстратной специфичности КПТ.

	DnpAAR	ZAAL	ZAAE
Фермент	Km, мМ	kcat, c–1	kcat/Km, M-1c-1	Km, мM	kcat, c–1	kcat/Km, M-1c-1	Km, мM	kcat, c–1	kcat/Km, M-1c-1
КПAg	---c	---c	---c	0,012	35	2900000	---c	---c	---c
КПВg	0,07	35	500000	---c	---c	---c	---c	---c	---c
КПTwt	4,4±1,3	14,6 ± 3	3600±600	0,046±0,003	10,3±2,1	230000±65000	---b	---b	6100±2600
КПT1	3,6	2	550	0,02	6,7	335000	---c	---c	---c
КПT2	3,6	4,3	1200	0,04	28	700000	---c	---c	---c
КПT3	---b	---b	840	0,03	11,1	370000	---c	---c	---c
КПT4	---b	---b	150	0,09	6,8	76000	---c	---c	---c
КПT5	---b	---b	1300±280d	0,15±0,01	22,8±3,6	152000±21000	---b	---b	880±110
КПT6	---b	---b	142 ±12d	0,75±0,26	7,1±2,1	9700±730d	---b	---b	37,5±11,4d
КПT D253G	---b	---b	346±36d	0,016±0,004	4,1±0,1	282000±80000	0,18±0,015	7,2±0,1	40000±2400d
КПT D253G/T255I	---b	---b	132±8d	0,03±0,006	5,2±0,3	184000±31000	0,3±0,03	8,5±0,5	28000±1500d
КПT D253G/T255K	2,8±0,9	0,04±0,01	16,8±3,8d	0,033±0,007	1,6±0,2	55000±19000e	0,65±0,05	11,5±1,0	17800±1800d
КПT D253G/T255R	---c	---c	<5f	0,45±0,08	5,6±1,0	12500±600d	0,8±0,07	23,6±1,7	29600±1400d
КПT H68N	5,9±0,1	17,5±1,1	2940±210	0,02±0,002	8,4±0,8	422000±39000	---b	---b	2300±200
КПT L247N	4±0,3	14,4±0,9	3600±130	0,063±0,003	5,6±0,5	87400±3700	---b	---b	<213±50

Таблица 3

Кинетические параметры КПТ и ее вариантовa

Примечание.

а Процедуру экспрессии, ренатурации, активации, очистки и определения кинетических параметров проводили по три раза для вариантов с представленными значениями стандартной ошибки среднего и по одному разу – для остальных вариантов КПТ.

b Не было замечено насыщения субстратом в условиях эксперимента.

c Нет данных.

d p < 0,05 согласно Т-тесту Стьюдента. Параметр [kcat/Km] КПТ5 сравнивался с таковым КПТwt. Параметр КПТ6 сравнивался с таковым КПТ5. Параметр КПТ D253G сравнивался с таковым КПТwt. Параметры КПT D253G/T255I, КПT D253G/T255K, КПT D253G/T255R сравнивались с таковым КПТ D253G.

e p = 0,051 при сравнении параметра [kcat/Km] КПT D253G/T255K с таковым КПТ D253G.

f Активность варианта КПT D253G/T255R была ниже предела детекции, равного 5, M-1c-1.

g Данные согласно статье (Трачук и др., 2002).

Таблица 4

Субстратная специфичность КПТ и ее вариантов

	Специфичностьа
Фермент	Положение	Зарядb	Субстрат с С-концевым(ой)
253	255	Leu	Glu	Arg
КПTwt	Asp	Thr	-1	64	1,7	1
КПT 5	Gly	Asp	-1	172	1	1,5
КПT 6	Gly	Asp	-1	259	1	3,8
КПT D253G	Gly	Thr	0	815	115	1
КПT D253G/T255I	Gly	Ile	0	1390	212	1
КПT D253G/T255K	Gly	Lys	+1	3270	1060	1
КПT D253G/T255R	Gly	Arg	+1	1	2,4	0
КПT H68N				183	1	1,3
КПT L254N				24	<0,06	1

Примечание.