Методические рекомендации

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

по применению набора реагентов

для выявления РНК вирусов гриппа А (Influenza virus A)

и гриппа В (Influenza virus В) в биологическом материале методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией

«АмплиСенс® Influenza virus A/B-FL»

Формат FEP

АмплиСенсÒ

Федеральное бюджетное учреждение науки «Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии», Российская Федерация, город Москва, улица Новогиреевская, дом 3а

ОГЛАВЛЕНИЕ

НАЗНАЧЕНИЕ.. 3

МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ.. 4

ДЕТЕКЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ С ПОМОЩЬЮ ФЛУОРЕСЦЕНТНОГО ПЦР-ДЕТЕКТОРА АLA-1/4 (BioSan, Латвия) 5

детекции результатов с помощью флуоресцентного ПЦР детектора АLА-1/4 (BioSan, Латвия) с версией программного обеспечения 5.1.0 и выше.. 7

детекции результатов с помощью флуоресцентного ПЦР–детектора «Джин-4» («ДНК-Технология», Россия) 9

ВОЗМОЖНЫЕ ОШИБКИ.. 11

НАЗНАЧЕНИЕ

Методические рекомендации описывают порядок действий при использовании набора реагентов для выявления РНК вирусов гриппа А (Influenza virus A) и гриппа В (Influenza virus В) в биологическом материале методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией «АмплиСенс® Influenza virus A/B-FL» совместно с детекторами конечной флуоресценции:

-  трехканальным и четырехканальным АLA-1/4 (BioSan, Латвия) при использовании программного обеспечения версии 4.10 или 5.1.0 и выше,

-  четырехканальным «Джин-4» («ДНК-Технология», Россия) при использовании программного обеспечения версии Gene v.3.3i. или Gene v.4.4i.

Соответствие названий флуорофоров и каналов детекции

Канал для флуорофора	Название канала детекции для разных моделей приборов[1]
канал для флуорофора FAM	FAM/Специфика
канал для флуорофора JOE	HEX/ВК
канал для флуорофора ROX	ROX

МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ

ВНИМАНИЕ! В соответствии с Директивой Европейского Союза 67/548/EEC следующие реагенты подлежат маркировке как содержащие опасные вещества, а также требуют указания факторов риска (R) и мер предосторожности (S):

Наименование реагента	Наименование комплекта, в который входит реагент	Наименование опасного (в соответствии с директивой 67/548/EEC) вещества	Код опасности, перечень факторов риска (R) и мер предосторожности (S) в соответствии с директивой 67/548/EEC	по ГН 2.2.5.1313-03[2]
ПДКмакс разовая/среднесменная, мк/м3	основная опасность	класс опасности	автоматический контроль за содержанием вещества в воздухе рабочей зоны
Раствор для лизиса	«РИБО-преп»	Гуанидин тиоционат	Harmful[3] R:20/21//53 S:13-61	Нет данных
Лизирующий раствор	«РИБО-сорб»
Раствор для отмывки 1	«РИБО-сорб»
Раствор для преципитации	«РИБО-преп»	Изопропанол	Highly flammable. Irritant2 R: S:7-16-24/25-26	50/10	Пары	Класс опас-ности 3	не требуется
Раствор для отмывки 3	«РИБО-сорб», «РИБО-преп»	Этанол	Highly flammable2 R:11 S:7-16	2000/1000	Пары	Класс опас-ности 4	не требуется
раствор для отмывки 4	«РИБО-сорб», «РИБО-преп»

Расшифровка обозначений факторов риска (R) и мер предосторожности (S).

R11: легко воспламеняется.

R20/21/22: опасен при проглатывании, контакте с кожей или вдыхании.

R32: при контакте с кислотой образуются токсический газ.

R36: раздражает слизистую глаз.

R52/53: опасен для водных организмов, может вызывать долговременное нежелательное воздействие на водную среду.

R67: пары вещества могут вызывать сонливость и головокружение.

S7: держать емкость плотно закрытой.

S13: держать вдали от пищевых продуктов и напитков, продуктов для животных.

S16: держать вдали от источников огня, не курить.

S24/25: избегать контакта с кожей и глазами.

S26: в случае попадания в глаза, немедленно промыть большим количеством воды и обратиться за медицинской помощью.

S61: избегать попадания в окружающую среду.

ВНИМАНИЕ! При работе с легковоспламеняющимися веществами соблюдать правила пожарной безопасности для учреждений здравоохранения ППБО 07-91 от 30.08.91.

ДЕТЕКЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ С ПОМОЩЬЮ ФЛУОРЕСЦЕНТНОГО ПЦР-ДЕТЕКТОРА АLA-1/4 (BioSan, Латвия)

Работа с флуоресцентным ПЦР-детектором АLА-1/4 проводится согласно паспорту к прибору.

Детекция и учет результатов проводится в соответствии с настройками теста, указанными во вкладыше к набору реагентов.

Настройки теста можно просмотреть и изменить, выбрав опцию Список тестов в главном меню Настройки.

Установка параметров теста «Influenza virus A-B»

1.  Запустить программу ALA_1 на компьютере, присоединенном к прибору.

2.  В главном меню программы выбрать Настройки → Тест.

3.  Нажать кнопку Новый (в верхнем правом углу).

4.  В открывшемся меню задать название теста «Influenza virus A-B», нажать кнопку ОК.

5.  В группе параметров Каналы отметить галочкой все задействованные в тесте каналы (FAM, HEX, ROX).

6.  В полях п– и п+ установить пороговые значения для отношения сигнал/фон по каждому каналу для детекции специфической PНК (см. вкладыш к набору реагентов).

7.  Ввести названия мишеней в блок параметров Привязка каналов и соотнести их с каналами детекции. Для этого напечатать название мишени в свободное поле и нажать клавишу Добавить, при этом новая мишень появится в столбце уже существующих в памяти прибора мишеней. Название мишени в столбце Привязка каналов выделить курсором и нажать соответствующую ей кнопку канала для детекции:

ВКО = FAM;

Influenza virus В = HEX;

Influenza virus A = ROX.

Примечание – Уровень фона и доверительный интервал не задаются.

8.  После ввода указанных значений, следует нажать кнопку Сохранить.

Измерение флуоресцентного сигнала

1.  Включить прибор и запустить программу ALA_1 на компьютере, присоединенном к прибору.

2.  Создать протокол измерения. Для этого в главном меню выбрать Протокол → Создать новый или Открыть, чтобы открыть созданный ранее протокол.

3.  В окне протокола необходимо выбрать тип используемого ротора (36 х 0,5 или 48 х 0,2), ввести номер протокола, выбрать нужный тест («Influenza virus A-B») в меню-вкладке Тест и ввести последовательность детектируемых образцов (в колонке Образец).

4.  Обозначить образцы, которые являются фоновыми для данной группы образцов, как ФОН (используя сочетание клавиш Ctrl и F).

5.  Закрыть окно редактирования протокола, нажав на кнопку Exit в верхнем левом углу панели. Протокол сохранить.

6.  Поставить пробирки в ячейки предварительно снятого ротора прибора АLА-1/4 согласно заданной последовательности, установить ротор в модуль прибора, закрепить его фиксатором и закрыть крышку. Запустить измерение, нажав на значок детекции (вверху экрана) или выбрав в меню Протокол опцию Детекция. По окончании детекции на экран будет выведена таблица результатов.

Примечание – Если в одном протоколе проводится детекция болееобразцов, то после окончания детекции партии изобразцов необходимо извлечь ротор, поместить в него следующую группу образцов, поставить ротор в прибор и для продолжения детекции нажать кнопку Продолжить в окне программы.

детекции результатов с помощью флуоресцентного ПЦР детектора АLА-1/4 (BioSan, Латвия) с версией программного обеспечения 5.1.0 и выше

1.  Включить прибор и запустить программу ALA_1 на компьютере, присоединенном к прибору.

2.  Создать новый протокол, нажав кнопку Новый протокол на панели задач. В Окне настройки протокола выбрать тип ротора, который будет использоваться. Из списка доступных тестов выбрать нужный тест, нажать стрелку Добавить тест. Если тест не был предустановлен в программе АLА-1, то для проведения детекции и учета результатов необходимо создать новый тест или импортировать его через архивный файл в список тестов, используемых на программе ALA_1.

ВНИМАНИЕ! Импорт или создание новых тестов в программе ALA_1 возможно только для пользователей с правами администратора.

Вариант 1. Импортировать новый тест. Импорт новых тестов в программе ALA_1 осуществляется через выбор основного меню Настройки → Импорт тестов. Далее выбрать архивный файл в формате *.zip и импортировать его в программу.

Вариант 2. Создать новый тест.

-  Выбрать в основном меню программы Настройки → Настройка тестов. В появившемся окне Окно настройки тестов добавить название нового теста кнопкой Добавить в таблице Список тестов.

-  В поле Каналы для данной реакционной смеси и их обозначения задать каналы детекции. Для этого в таблице Список каналов выбрать канал детекции и нажать стрелку Добавить. Выбранный канал появится в таблице Каналы и обозначения, под таблицей в поле Обозначения задать обозначения по этому каналу, в поле пороги для + и – задать пороги (см. вкладыш к набору реагентов). Далее в таблице Список каналов выбрать канал FAM и обозначить с помощью галочки, что по этому каналу будет детектироваться ВК (внутренний контрольный образец), задать для ВК пороговое значение (см. вкладыш к набору реагентов). Далее в поле Введите/измените тип теста выбрать тип теста Генотипирующий.

-  Отметить контроли, подлежащие интерпретации по умолчанию: В– – отрицательный контроль выделения РНК (все отрицательные, ВК-любой); K– – отрицательный контроль аплификации (все отрицательные).

-  В поле Таблица интерпретации результатов нажать кнопку Создать. Программой ALA_1 будет автоматически создана таблица возможных вариантов сочетаний результатов детекции для всех каналов и итоговый результат для каждого из этих вариантов. Продолжением этой таблицы являются возможные варианты сочетаний результатов контролей. Результаты детекции клинических образцов и контролей будут выдаваться после измерения в соответствии с этой таблицей. Сохранение теста и закрытие окна осуществляется кнопкой ОК.

3.  Создать протокол измерения.

-  В основном окне программы нажать кнопку Новый протокол. В появившемся окне Окно настройки протокола выбрать тест из списка доступных тестов и нажать стрелку Добавить. Выбранный тест появится в списке Тесты протокола.

-  В поле Количество образцов задать количество исследуемых образцов без фоновых пробирок и контрольных образцов, нажать кнопку Добавить. В поле Количество фоновых пробирок выбрать необходимое количество фона (рекомендуется постановка двух фоновых пробирок).

-  В Таблице имён образцов, фоновых пробирок и контролей задать имена образцов и необходимое количество контролей. В поле Тип ротора выбрать ротор, который будет использоваться в данном протоколе. Сохранение протокола и закрытие окна осуществляется кнопкой ОК.

4.  Поставить пробирки в ячейки модуля прибора АLА-1/4 в соответствии с заданной последовательностью. Запустить измерение, нажав на кнопку Измерить в панели активных кнопок (вверху экрана).

Учет результатов

1.  Результат измерения выдаётся программой после завершения измерения протокола в окне Окно результатов. Полученные данные интерпретируются программой автоматически в соответствии с Таблицей интерпретации результатов. При необходимости просмотра исходных данных со значениями флуоресценции необходимо закрыть Окно Результатов, нажав кнопку Закрыть внизу окна. Повторно открыть окно результатов - нажать кнопку .

2.  Для образцов, в которых обнаружен возбудитель, указывается «ОБНАРУЖЕНО».

3.  Для образцов, в которых не обнаружен возбудитель указывается «НЕ ОБНАРУЖЕНО».

4.  При получении сигнала, превышающего пороговое значение для отрицательных образцов, но не превышающего пороговое значение для положительных образцов (сигнал находится между пороговыми значениями), образец указывается как «СОМНИТЕЛЬНЫЙ».

5.  Результаты исследования считаются достоверными только в случае получения правильных результатов исследования отрицательного и положительного контролей амплификации и экстракции РНК. При автоматической интерпретации в случае корректного прохождения контролей К-, В-, K+ прибор выдает результат ОК .

детекции результатов с помощью флуоресцентного ПЦР–детектора «Джин-4» («ДНК-Технология», Россия)

Настройка теста

Детекция проводится согласно описанию в паспорте «Детектор полимеразной цепной реакции флуоресцентный Джин».

Для проведения детекции и учета результатов необходимо в программе Gene создать новый тест «Influenza virus A-B».

Настройки теста можно установить, выбрав меню Настройки, Список тестов в главном меню программы. Пороговые значения для отношения сигнал/фон по каждому каналу для детекции специфической ДНК указаны во вкладыше к набору реагентов.

1.  Включить прибор и запустить программу Gene на компьютере, присоединенном к прибору.

2.  Задать протокол измерения. Ввести количество измеряемых образцов и количество фоновых пробирок (2), выбрать тест Influenza virus A-B в графе Тест, нажать кнопку OK (кнопкой мыши).

3.  Ввести последовательность детектируемых образцов (в колонке Образец).

4.  Поставить пробирки в ячейки модуля прибора «Джин» в соответствии с заданной последовательностью и запустить детекцию, нажав кнопку, обозначенную значком цветной призмы, в панели активных кнопок (вверху экрана). По окончании детекции первой группы, вынуть пробирки и заменить следующей группой пробирок и продолжить измерения, нажав кнопку OK. По окончании детекции вынуть пробирки и нажать кнопку OK.

5.  Сохранить полученные результаты в виде файла, выбрав в меню значок сохранения результатов .

Обозначения ПЦР-детектора при автоматической интерпретации результатов

«+» – положительный результат;

«–» – отрицательный результат;

«?» – результат, который нельзя однозначно интерпретировать (сигнал превышает пороговое значение, допустимое для отрицательных образцов, но не превышает пороговое значение для положительных образцов (сигнал находится между пороговыми значениями));

«нд» – недостоверный результат (в образце не детектируется ни специфический сигнал (ниже установленного порогового значения отрицательного результата), ни сигнал ВКО (ниже установленного порогового значения).

Примечание – Для образца K– результат нд по всем каналам является нормой.

ВОЗМОЖНЫЕ ОШИБКИ

1.  Если для положительного контроля ПЦР (К+) сигнал по каналу HEX и ROX ниже порогового значения положительного результата, необходимо повторить амплификацию и детекцию для всех образцов, в которых не обнаружена РНК вируса гриппа, соответствующего данному флуорофору.

2.  Если для отрицательного контроля ПЦР (К–) сигнал по каналу HEX и ROX выше порогового значения положительного результата, необходимо повторить ПЦР-исследование для всех образцов, в которых обнаружена РНК вируса гриппа, соответствующего данному флуорофору, начиная с этапа экстракции РНК.

Лист вносимых изменений

Редакция	Место внесения изменений	Суть вносимых изменений
04.07.13 РЕ	Назначение	Добавлена таблица «Соответствие названий флуорофоров и каналов детекции» в соответствии с протоколом № 20 от 26.02.13
По тексту	Изменены названия каналов детекции в соответствии с протоколом № 20 от 26.02.13
10.09.13 GA	Титульный лист	Добавлена отсканированная печать и подпись директора ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора

[1] Название каналов детекции для соответствующего детектора см. в соответствующем разделе методических рекомендациq к набору реагентов.

[2] Данные ГН 2.2.5.1313-03 «Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны». Класс опасности по ГОСТ 12.1.007-76. ССБТ. «Вредные вещества. Классификация. Общие требования безопасности».

[3] Использованы данные о коде опасности, факторах риска (R) и мерах предосторожности (S) фирмы Sigma-Aldrich (harmful – вредный для здоровья, highly flammable – легковоспламеняющийся, irritant - вызывающий раздражение).