- Для модели iCycler iQ создать программу амплификации, выбрав опцию Edit Protocol модуля Workshop. Для этого в нижнем окне задать параметры амплификации (количество циклов, время и температуру циклирования), а в окне справа указать шаг считывания флуоресцентного сигнала: Cycle 3 – Step 2. Сохранить протокол, задав имя файла в окне Protocol Filename и нажав кнопку Save this protocol (в верхней части экрана). При последующих постановках можно выбрать файл с этой программой в закладке View Protocol в модуле Library. Выбрав или отредактировав нужную программу, назначить ее использование, нажав кнопку Run with selected plate setup.
5. Запустить выполнение выбранной программы с заданной схемой планшета.
- Для прибора iCycler iQ5 перед запуском выполнения программы следует проверить правильность выбранного протокола (Selected Protocol) и схемы планшета (Selected Plate Setup). Для запуска нажать кнопку Run. Выбрать для измерения факторов лунок вариант Collect Well Factors from Experimental Plate. Нажать кнопку Begin Run, дать название эксперимента (в этом файле будут автоматически сохранены результаты данного эксперимента) и нажать OK.
- Для прибора iCycler iQ перед запуском выполнения программы в окне Run Prep следует проверить правильность выбранного имени протокола и схемы планшета. Выбрать для измерения факторов лунок вариант Experimental Plate в меню Select well factor source. Задать объем реакционной смеси в окне Sample Volume – 25 мкл. Для запуска нажать кнопку Begin Run, дать название эксперимента (в этом файле будут автоматически сохранены результаты данного эксперимента) и нажать OK.
6. После того, как температура реакционного блока достигнет 95 °С, нажать кнопку Pause, открыть крышку и поместить реакционные пробирки в ячейки амплификатора в соответствии с предварительно запрограммированной схемой планшета. Закрыть крышку прибора и нажать кнопку Resume Run (для прибора iCycler iQ – кнопку Continue Running Protocol).
7. После окончания программы приступить к анализу результатов.
АНАЛИЗ РЕЗУЛЬТАТОВ
Полученные данные интерпретируются с помощью программного обеспечения прибора по наличию пересечения кривой флуоресценции с установленной на соответствующем уровне пороговой линией (что соответствует наличию значения порогового цикла Ct в соответствующей графе в таблице результатов).
Для всех каналов FAM, JOE/HEX и ROX уровень пороговой линии необходимо установить (перетащить ее курсором при нажатой левой кнопке мыши) на 10-20 % от максимального уровня флуоресценции образцов ПКО в последнем цикле амплификации. При этом кривая флуоресценции ПКО должна пересекать пороговую линию на участке характерного экспоненциального подъема флуоресценции, переходящего в линейный подъем. Накопление продукта амплификации участка ВКО детектируется по каналу FAM, участка кДНК Influenza virus A/H1 (A/H3) по каналу JOE/HEX, накопление продукта амплификации кДНК Influenza virus A/N1 (A/N2) – по каналу ROX. Результаты исследования считаются достоверными только в случае получения правильных результатов исследования отрицательного и положительного контролей амплификации и экстракции НК (см. табл. 12). Результаты по положительным и отрицательным контрольным образцам не должны превышать значений пороговых циклов, указанных в табл. 9 для приборов iCycler iQ или iQ5 (BioRad, США).
Таблица 12
Результаты анализа контрольных образцов
для приборов iCycler iQ или iQ5 (Bio-Rad, США)
Контроль | Контролируемый этап ПЦР-исследования | Сигнал по каналу | ||
FAM | JOE/HEX | ROX | ||
Детекция ВКО | Детекция Гена-мишени (Н1/Н3) | Детекция Гена-мишени (N1/N2) | ||
ОК | Экстракция РНК | < 28 | отсутствует | отсутствует |
К- | ПЦР | отсутствует | отсутствует | отсутствует |
ВK+ | ПЦР | < 26 | отсутствует | отсутствует |
ПКО кДНК Influenza virus A H1N1 | ПЦР | отсутствует | < 25 | < 25 |
ПКО кДНК Influenza virus A H3N2 | ПЦР | отсутствует | < 25 | < 25 |
Анализ результатов амплификации ВКО.
- Для прибора iCycler iQ5 выбрать нужный файл с данными анализа (в окне Data File модуля Workshop) и нажать кнопку Analyze. Выбрать в окне модуля данные по каналу FAM. При этом должен быть выбран режим анализа данных PCR Base Line Subtracted Curve Fit (выбирается по умолчанию). Установить уровень пороговой линии. Чтобы вывести на экран таблицу результатов, нажать кнопку Results.
- Для прибора iCycler iQ в опции PCR Quantification в меню Select a Reporter выбрать значок канала FAM-490. При этом должен быть выбран режим анализа данных PCR Base Line Subtracted Curve Fit (выбирается по умолчанию). В меню Treshold Cycle Calculation выбрать режим ручной установки пороговой линии и автоматический расчет базовой линии. Для этого в подменю Baseline Cycles выбрать Auto Calculated, а в подменю Threshold Position выбрать User Defined. Установить уровень пороговой линии. Нажать на клавишу Recalculate Threshold Cycles. В таблице результатов появятся значения Ct.
Анализ результатов кДНК Influenza virus A/H1 (A/H3).
- Для прибора iCycler iQ5 выбрать в окне модуля данные по каналу JOE/HEX. При этом должен быть выбран режим анализа данных PCR Base Line Subtracted Curve Fit (выбирается по умолчанию). Установить уровень пороговой линии. Чтобы вывести на экран таблицу результатов, нажать кнопку Results.
- Для прибора iCycler iQ в модуле Lybrary активировать окно View Post-Run Data. В окне Data Files выбрать нужный файл с данными анализа и нажать кнопку Analyse Data. В опции PCR Quantification в меню Select a Reporter выбрать значок канала JOE-530. При этом должен быть выбран режим анализа данных PCR Base Line Subtracted Curve Fit (выбирается по умолчанию). В меню Treshold Cycle Calculation выбрать режим ручной установки пороговой линии и автоматический расчет базовой линии. Для этого в подменю Baseline Cycles выбрать Auto Calculated, а в подменю Threshold Position выбрать User Defined. Установить уровень пороговой линии. Нажать на клавишу Recalculate Threshold Cycles. В таблице результатов появятся значения Ct.
Анализ результатов амплификации кДНК Influenza virus A/N1 (A/N2).
- Для прибора iCycler iQ5 выбрать в окне модуля данные по каналу ROX, отключив кнопки FAM и JOE/HEX. При этом должен быть выбран режим анализа данных PCR Base Line Subtracted Curve Fit (выбирается по умолчанию). Установить уровень пороговой линии. Чтобы вывести на экран таблицу результатов, нажать кнопку Results.
- Для прибора iCycler iQ в опции PCR Quantification в меню Select a Reporter выбрать значок канала ROX-575. При этом должен быть выбран режим анализа данных PCR Base Line Subtracted Curve Fit (выбирается по умолчанию). В меню Treshold Cycle Calculation выбрать режим ручной установки пороговой линии и автоматический расчет базовой линии. Для этого в подменю Baseline Cycles выбрать Auto Calculated, а в подменю Threshold Position выбрать User Defined. Установить уровень пороговой линии. Нажать на клавишу Recalculate Threshold Cycles. В таблице результатов появятся значения Ct.
УЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ В ИССЛЕДУЕМЫХ ОБРАЗЦАХ
В исследуемом образце идентифицирован вирус гриппа А/H1 (или А/H3), если имеется значение Ct по каналу JOE/HEX.
В исследуемом образце идентифицирован вирус гриппа А/N1 (или А/N2), если имеется значение Ct по каналу ROX.
Если в исследуемом образце отсутствуют значения Ct по обоим или одному из каналов (JOE/HEX и ROX), а значение Ct по ВКО не превышает порогового значения для детекции ВКО (канал FAM) (см. таблицу 13), следует считать, что в этом образце данный субтип А/H1N1 (или А/H3N2) эпидемического вируса гриппа не идентифицирован (не обнаружен).
Таблица 13
Учет результатов в исследуемых образцах
для приборов iCycler iQ или iQ5 (Bio-Rad, США)
ПЦР-смесь-1 | Сигнал по каналу (пороговые циклы) | ||
FAM | JOE/HEX | ROX | |
Детекция ВКО | Детекция Гена-мишени (Н1/Н3) | Детекция Гена-мишени (N1/N2) | |
ПЦР-смесь-1-FEP/FRT Influenza virus A H1N1 | ВК<28 | H1 ≤ 35 | N1 ≤ 35 |
ПЦР-смесь-1-FEP/FRT (F) | ВК<28 | H1 ≤ 35 | N1 ≤ 35 |
ПЦР-смесь-1-FEP/FRT Influenza virus A H3N2 | ВК<28 | H3 ≤ 35 | N2 ≤ 35 |
ПЦР-смесь-1-FEP/FRT (F) | ВК<28 | H3 ≤ 35 | N2 ≤ 35 |
Результаты анализа не подлежат учету в следующих случаях:
1. Образцы (кроме К-), для которых получен отрицательный результат по всем каналам, требуют повторного проведения ПЦР-исследования, начиная с этапа экстракции. При получении отрицательного результата при повторной постановке рекомендовать повторный сбор материала для анализа. Для образца «K-» отрицательный результат по всем каналам является нормой.
2. Если для положительного контроля ПЦР (К+) значение порогового цикла по соответствующему каналу отсутствует или превышает граничное значение, необходимо повторить амплификацию для всех отрицательных клинических образцов.
3. Если для отрицательного контроля экстракции РНК/ДНК (ОК) и/или отрицательного контроля ПЦР (К-) по каналу детекции гена-мишени определено значение порогового цикла Ct, необходимо повторить исследование для всех образцов, в которых обнаружен данный ген-мишень, начиная с этапа экстракции, чтобы исключить следствие возможной контаминации.
Лист вносимых изменений
Редакция | Место внесения изменений | Суть вносимых изменений |
02.02.10 | по всему тексту | Исправлено сокр. Название контроля (замена В - на OK) |
21.10.10 | Нижний колонтитул | Указано соответствие формы выпуска и каталожного номера: Кат. №:Вариант FEP/FRT Форма 1: B62(RG, iQ, FEP) |
10.11.10 | По всему тексту | Добавлены приборы «ДТ-96», iCycler iQ (iQ5) и порядок работы на них. |
12.11.10 | Нижний колонтитул | Удалены каталожные номера, соответствующие варианту FEP |
07.12.10 | Нижний колонтитул | Удален кат.№ для формы 1: R-V54(iQ, Dt), добавлен для формы 2 кат.№ R-V54-100-F(RG, iQ, Dt, SC) в соответствии с инструкцией |
10.12.10 | Нижний колонтитул | Добавлен кат.№ для формы 1: R-V54(iQ, Dt) в соответствии с инструкцией |
22.12.10 ТР | Порядок проведения реакции амплификации, анализ и учет результатов при помощи приборов Rotor-Gene 3000, Rotor-Gene 6000 (Corbett Research, Австралия) и Rotor-Gene Q (Qiagen, Германия), анализ результатов | Изменен уровень пороговой линии для тестов H1N1 и H3N2 для канала JOE/Yellow |
11.10.11 VV | титульная страница | Удалены упоминания приборов и «Москва 2010» |
По тексту | Уточнены названия разделов | |
Анализ результатов реакции амплификации по каналу JOE/Yellow (для приборов Rotor-Gene), п. 4 | Значение порога по каналу JOE/Yellow для теста «H3N2» изменено на 0,05 (вместо 0,03) | |
11.01.12 VV | Учет результатов в исследуемых образцах Результаты анализа не подлежат учету в следующих случаях: | «Если для отрицательного контроля экстракции РНК/ДНК (ОК) и/или отрицательного контроля ПЦР (К-) сигнал по каналу детекции гена-мишени меньше граничного значения положительного результата…» изменено на «Если для отрицательного контроля экстракции РНК/ДНК (ОК) и/или отрицательного контроля ПЦР (К-) по каналу детекции гена-мишени определено значение порогового цикла Ct…» |
Титульная страница | Добавлены подпись и печать директора ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии | |
16.02.12 LA | Нижний колонтитул | «Кат. №» и «дата изменения» заменены на соответствующие символы |
14.08.12 IvI | Титульная страница | Добавлены новые подпись и печать директора ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии |
01.04.13 FN | Нижний колонтитул | Каталожные номера R-V54(RG) и R-V54(iQ, Dt) заменены на R-V54 |
16.07.13 PE | Назначение | Добавлена таблица «Соответствие названий флуорофоров и каналов детекции» |
По тексту | Qiagen исправлено на QIAGEN | |
Исправлены названия каналов в соответствии с протоколом № 20 от 26.02.13 |
[1] Название каналов детекции для соответствующего детектора см. в соответствующем разделе методических рекомендаций к набору реагентов.
|
Из за большого объема этот материал размещен на нескольких страницах:
1 2 3 4 |
