ИДЕНТИФИКАЦИЯ МЕМБРАННЫХ И ВНУТРИКЛЕТОЧНЫХ МАРКЕРОВ АПОПТОЗА У РАБОТАЮЩИХ В УСЛОВИЯХ ВОЗДЕЙСТВИЯ ВАНАДИЯ, КРЕМНИЯ, МАРГАНЦА
,
ФБУН «Федеральный научный центр медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения», Пермь
Введение. Широкий спектр химических агентов в условиях производства вызывает нарушение иммунного ответа, оказывая токсические эффекты на клетки иммунной системы [2]. Очевидно, индуцирующее влияние неблагоприятных техногенных химических факторов производственной среды на организм человека диктует необходимость углубленного изучения состояния иммунологического здоровья населения для своевременной диагностики и проведения адекватных, обоснованных лечебно-профилактических мероприятий [4]. Цель работы – идентификация биомаркеров летальной программы клетки у работающих в условиях воздействия ванадия, кремния, марганца с учетом дифференциации маркеров апоптоза на мембранные и внутриклеточные.
Материалы и методы. Результаты настоящего исследования базируются на данных углубленного медицинского обследования 158 человек. Биомедицинские исследования выполнены в соответствии с обязательным соблюдением этических принципов медико-биологических исследований, изложенных в Хельсинкской декларации 1975 года с дополнениями 1983 года. Основная группа – высокостажированные рабочие предприятия черной металлургии с полным технологическим циклом выпуска металла. В исследовании приняли участие плавильщики ферросплавов, сталевары, аппаратчики, шихтовщики, всего 52 человека в возрасте от 22 до 55 лет (средний возраст – 37,59±1,14 года), мужчин – 20 чел. (38,5%), женщин – 32 чел. (61,5%). Средний стаж на производстве – 13,00±1,24 года, из них у 29 чел. (55,8%) стаж до 5 лет, у 9 чел. (17,3%) – от 6 до 10 лет, у 14 чел. (26,9%) – больше 10 лет. Для оценки условий труда на рабочих местах использованы материалы аттестации рабочих мест, результаты производственного контроля, результаты химико-аналитического анализа содержания веществ (ванадия, марганца, кремния) в воздухе рабочей зоны на рабочих местах. Контрольная группа – 106 человек (средний возраст 41,04±2,17 года), не имеющих контакта с производственными вредностями (служащие налоговой инспекции).
Фенотипирование лимфоцитов проводили на проточном цитометре FACSCalibur фирмы «Becton Dickinson» («BD», USA) с использованием универсальной программы CellQuest. PrO с помощью компьютера Macintosh. Определение популяций и субпопуляций лимфоцитов осуществляли методом мембранной иммунофлюоресценции с использованием панели меченых моноклональных антител (МКАТ) к мембранным CD-рецепторам («BD», USA), при этом регистрировали суммарно не менее 10.000 событий. Идентификацию внутриклеточного маркера апоптоза – р53-протеина – проводили с помощью МКАТ против белка р53, конъюгированные с PE (Phycoerythrin) на проточном цитометре. Для анализа использовалась суспензия мононуклеарных клеток периферической крови, выделенных путем центрифугирования в градиенте плотности фиколл-верографина. Затем клетки, дважды отмытые в холодном фосфатно-солевом буфере, ресуспендировали и окрашивали стандартными МКАТ согласно протоколу фирмы-производителя «Becman Coulter» («BС», USA). Для определения уровня экспрессии рецептора к фактору некроза опухоли-α 1-го типа (TNFRI – tumor necrosis factor receptor I) использовали цитофлюориметрический метод, основанный на взаимодействии соответствующих моноклональных антител с мембранным рецептором к TNFα на лимфоцитах. Клетки (1х106 клеток/мл) отмывали фосфатно-солевым буфером и окрашивали стандартными МКАТ к рецептору TNFRI, меченными PE («BC», USA) согласно протоколу фирмы-производителя. Регистрацию апоптоза лимфоцитов проводили методом, основанным на определении экспрессии на наружной мембране молекул фосфатидилсерина с помощью аннексина V, конъюгированного с FITC (Annexin V-FITC) и фрагментации ДНК с помощью витального красителя 7-AAD (7-amino-actinomycin D) («BC», USA). После отмывания клетки (1х106 клеток/мл) ресуспендировали в рабочем растворе буфера для окрашивания и инкубировали с добавлением красителей («BC», USA). Через 15 мин их фиксировали рабочим раствором связывающего буфера и подвергали проточной цитофлюорометрии на цитометре FACSCalibur («BD», USA), при этом регистрировали суммарно не менее 10 000 событий.
Определение содержания низкомолекулярных соединений (ванадия, марганца, кремния) в крови обследуемых осуществляли в соответствии с методическими указаниями [5].
Для статистической обработки результатов исследования применялись методы математической статистики с помощью программы Microsoft® Office Excel 2003 и пакета прикладных программ Statistica 6.0. (StatSoft, USA). Для оценки уровня достоверности полученных данных использовали параметрический критерий Стьюдента с учётом нормального распределения переменных в сравниваемых группах. В случае отклонения от нормального распределения, для сравнения данных использовали непараметрический U-критерий Манна-Уитни. Результаты исследования представлены в виде среднего значения (М) и ошибки средней (m) изученных показателей. Различия между группами считали статистически значимыми при р<0,05 [1].
Результаты и их обсуждение. При проведении исследований воздуха рабочей зоны по химическому фактору установлено присутствие следующих химических веществ: ванадийсодержащие шлаки (пыль), дижелезо триокид, диванадий пентоксид, оксид углерода, оксид марганца, диоксид серы и оксид азота, диоксид кремния. Среди химических веществ, воздействующих на работников, преобладающее значение по воздействию на состояние здоровья работающих имеют ванадийсодержащие шлаки (пыль), оксид марганца, диванадий пентоксид и диоксид кремния, концентрации которых превышают допустимые уровни в 4,8-17,8 раза согласно ГН 2.2.5.1313–03 «Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны» (табл. 1). Концентрации остальных химических веществ, при определенных условиях, могут превышать допустимые уровни. По результатам проведенной на предприятии аттестации рабочих мест исследуемых подразделений выявлено, что, согласно Руководству Р 2.2.2006 - 05 «Руководство по гигиенической оценке факторов рабочей среды и трудового процесса. Критерии и классификация условий труда», на 100% рабочих мест условия труда оценены как вредные (от 1 до 4 степени 3 класса). Категории профессионального риска по классам условий труда работающих оцениваются от малого (умеренного) риска (по Р 2.2.1766-03) до очень высокого (непереносимого) риска.
Оценка уровня контаминации биосред всех обследуемых продемонстрировала, что средняя концентрация марганца в крови работающих в условиях производства не превышает фоновых концентраций и находится в диапазоне контрольных величин (табл. 2). Отмечено, что в биологических субстратах испытуемых основной группы содержание кремния достоверно выше фоновых и контрольных значений (р<0,05). Среднегрупповое содержание ванадия в биосредах обследуемых основной группы статистически значимо превышает величины, идентифицированные в группе контроля (р<0,05).
Таблица 1
Производственные факторы, воздействующие на здоровье работающих
Производственный фактор | Содержание на рабочем месте | Нормативное значение | Доли ПДК |
Диванадий пентоксид | 0,07 – 2,60 мг/м3 | 0,5 мг/м3 | 0,14 ПДК – 5,2 ПДК |
Ванадийсодержащие шлаки (пыль) | 1,7 – 71,2 мг/м3 | 4,0 мг/м3 | 0,43 ПДК – 17,8 ПДК |
Кремний диоксид кристаллический | 6,1 – 19,3 мг/м3 | 4,0 мг/м3 | 1,53 ПДК – 4,83 ПДК |
Марганца оксид | 0,11 – 2,34 мг/м3 | 0,3 мг/м3 | 0,37 ПДК – 7,8 ПДК |
Таблица 2
Уровень контаминации ванадия, марганца и кремния в крови обследуемых
Токсикант | Контрольная группа (n=34), M±m | Основная группа (n=107), M±m | Фоновый уровень (n=100), M±m |
Ванадий, мг/дм3 | 0,00077±0,00025 | 0,00357±0,00254* | 0,004626±0,00083 |
Марганец, мг/дм3 | 0,01720±0,0039 | 0,0193±0,00210 | 0,0198±0,008 |
Кремний, мг/дм3 | 1,687±0,152 | 2,375±0,152** | 0,0 |
Примечания: * – различия достоверны по сравнению с контрольной группой (р<0,05); ** – различия достоверны по сравнению с контрольной группой и нормой (р<0,05).
Сравнительная характеристика иммунограмм продемонстрировала, что у работающих в условиях вредного производства статистически значимо повышено процентное содержание маркеров ранней активации (CD25+) по сравнению с результатами, выявленными в контрольной группе (р<0,05) (табл. 3). Отмечено, что у обследуемых основной группы количество лимфоцитов, экспрессирующих CD95+-антиген определяется в диапазоне контрольных величин. Анализ результатов продемонстрировал, что у работающих в условиях вредного производства в 2,4 раза реже идентифицируется внутриклеточный белок р53 относительно значений, зафиксированных в контрольной группе. Выявлено, что у обследуемых основной группы статистически значимо снижена экспрессия TNFRI+-рецептора по отношению к результатам, полученным в группе контроля (р<0,05). Оценка активационно-индуцировнной гибели клетки показала, что у работающих в условиях вредного производства статистически значимо снижено количество Annexin V-FITC+7AAD--клеток в сравнении со значениями, зарегистрированными в контрольной группе (р<0,05). Процентное содержание Annexin V - FITC+7AAD+-клеток у обследуемых основной группы зафиксировано в диапазоне контрольных величин.
Таблица 3
Характеристика отдельных показателей иммунной системы обследуемых
Показатель | Контрольная группа (n=33), M±m | Основная группа (n=44), M±m |
CD3+CD25+, % | 9,21±0,63 | 12,59±0,47* |
CD3+CD25+, 109/ дм3 | 0,18±0,01 | 0,24±0,01 |
CD95+, % | 35,14±1,55 | 34,66±1,45 |
CD95+, 109/ дм3 | 0,69±0,03 | 0,66±0,03 |
p53, % | 3,42±0,29 | 1,44±0,11* |
TNFRI+, % | 3,31±0,27 | 1,39±0,11* |
Annexin V-FITC+7AAD-, % | 3,09±0,20 | 0,93±0,06* |
Annexin V-FITC+7AAD+, % | 6,96±0,51 | 7,57±0,47 |
Примечание: * – различия между группами достоверны при p<0,05.
Антигенная стимуляция приводит к активации и пролиферации Т-клеток, поэтому должен работать механизм, позволяющий элиминировать клоны больше ненужных клеток и поддерживать гомеостаз в иммунной системе [3]. Экспрессия CD25 считается обязательным этапом активации иммунной системы и признаком готовности лимфоцитов к вступлению в пролиферацию и дифференцировку. Значимая роль в регуляции апоптоза отводится таким рецепторам, как CD95+ (Fas, маркер поздней активации) и TNFRI+, величина экспрессии которых отражает готовность лимфоцитов вступить в апоптоз – включить механизм запрограммированной клеточной гибели. Белок р53 регулирует многие клеточные функции, включая дифференцировку клеток и их гибель по типу апоптоза. Активация р53 дает мощный апоптогенный сигнал [4].
В результате оценки реализации летальной программы клетки в аннексиновом тесте были установлены изменения апоптотической реакции лимфоцитарных клеток (статистически значимое повышение экспрессии CD25+-рецептора, достоверное снижение количестваTNFRI+-рецептора и внутриклеточного р53 белка) при повышенном содержании низкомолекулярных химических соединений в биосредах. Таким образом, полученные данные свидетельствуют о подавлении процессов запрограммированной клеточной гибели у обследуемых, что может быть обусловлено стрессовым воздействием производственных химических факторов, выступающих в роли гаптенов (ванадий, кремний, марганец).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Медико-биологическая статистика / С. Гланц ; под ред. [и др.]. – М. : Практика, 1998. – 459 с.
2. Полиморфизм гена фактора некроза опухоли и гена СРОХ у работающих в условиях химического производства / А [и др.] // Медицина труда и промышленная экология. – 2011. – № 11. – С. 29-32.
3. Особенности лимфоцитарно-клеточного звена у детей, проживающих на техногенно-нагруженных территориях / [и др.] // Биологические мембраны. – 2012. – Т. 29, № 5. – С. 349-353.
4. Зайцева жизненного цикла клетки в условиях экспозиции фенолами / , , // Казанский медицинский журнал. – 2012. – № 4. – С. 683-686.
5. Сборник методик по определению химических соединений в биологических средах / МУК МЗ РФ № .1.779-99. – М., 1999.
