Глава 2. История исследования белка

Глава 2. История исследования белка

2.5. Разработка методов синтеза аминокислот

Для того чтобы перейти к синтезу производных аминокислот, соединенных пептидной связью, Фишер провел большую работу по изучению строения и синтезу аминокислот.

До Фишера общим методом синтеза аминокислот был циангидринный синтез А. Штреккера:

+ NH3;HCN +H+;H2O

RR’C=O RR’C(NH2)CN RR’C(NH2)COOH

По реакции Штреккера удалось синтезировать аланин, серин и некоторые другие аминокислоты, а по ее модификации ( реакции Зелинского-Стадникова) как a-аминокислоты, так и их N-замещенные.

Однако сам Фишер стремился разработать методы синтеза всех известных тогда аминокислот. Он считал метод Штреккера недостаточно универсальным. Фишеру пришлось искать общий метод синтеза аминокислот в том числе аминокислот со сложными боковыми радикалами.

Он предложил аминировать бромзамещенные в a-положении карбоновые кислоты. Для получения бромопроизводных он использовал, как например, в синтезе лейцина, арилированную или алкилированную малоновую кислоту:

Br2 – CO2

(CH3)2CHCH2CH(COOH)2 (CH3)2CHCH2CHBr(COOH)2

NH3

(CH3)CHCH2CHBrCOOH (CH3)2CHCH2CHNH2COOH

Но создать абсолютно универсальный метод Э. Фишеру не удалось. Были разработаны и более надежные реакции. Например, ученик Лейкс предложил следующую модификацию для получения серина:

HCN

C2H5OCH2CHO C2H5OCH2CH(NH2)CN

HBr

C2H5OCH2CH(NH2)COOH HOCH2CHNH2COOH

Фишер также доказал, что белки состоят из остатков оптически активных аминокислот (см. стр.11). Это заставило его разработать новую номенклатуру оптически активных соединений, методы разделения и синтеза оптических изомеров аминокислот. Фишер также пришел к выводу, что в белках содержатся остатки L-форм оптически активных аминокислот, и он доказал это, впервые использовав принцип диастереоизомерии. Этот принцип заключался в следующем: к N-ацилпроизводному рацемической аминокислоты добавляли оптически активный алкалоид (бруцин, стрихнин, цинхонин, хинидин, хинин). В результате этого образовывались две стереоизомерные формы солей, обладающие различной растворимостью. После разделения этих диастереоизомеров алкалоид регенерировали и ацильную группу удаляли путем гидролиза.

Фишер сумел разработать метод полного определения аминокислот в продуктах гидролиза белков: он переводил хлоргидраты эфиров аминокислот обработкой концентрированной щелочью на холоду в свободные эфиры, которые заметно не омылялись. Затем смесь этих эфиров подвергал фракционной перегонке и из полученных фракций выделял отдельные аминокислоты путем дробной кристаллизации.

Новый метод анализа не только окончательно подтвердил, что белки состоят из аминокислотных остатков, но позволил уточнить и пополнить список встречающихся в белках аминокислот. Но все же количественные анализы не могли дать ответа на основной вопрос: каковы принципы строения молекулы белка. И Э. Фишер сформулировал одну из основных задач в изучении строения и свойств белка: разработка экспериментальные методы синтеза соединений, основными компонентами которых были бы аминокислоты, соединенные пептидной связью.

Таким образом Фишер поставил нетривиальную задачу – синтезировать новый класс соединений с целью установления принципов их строения.

Задачу эту Фишер решил, и химики получили убедительные доказательства, что белки представляют собой полимеры аминокислот, соединенных пептидной связью:

««« – CO – CHR’ – NH – CO – CHR’’ – NH – CO CHR’’’ – NH – «««

Это положение подтверждалось биохимическими доказательствами. Попутно выяснилось, что протеазы гидролизуют не все связи между аминокислотами с одинаковой скоростью. На их способность расщеплять пептидную связь влияли оптическая конфигурация аминокислот, заместители по азоту аминогруппы, длина цепи пептида, а также набор входящих в него остатков.

Главным доказательством пептидной теории стал синтез модельных пептидов и сопоставление их с пептонами гидролизата белков. Результаты показали, что из белковых гидролизатов выделяются пептиды, идентичные синтезированным.

В процессе выполнения этих исследований Э. Фишер и его ученик Э. Абдергальден впервые разработали метод определения аминокислотной последовательности в белка. Сущность его заключалась в установлении природы аминокислотного остатка полипептида, имеющего свободную аминогруппу (N-концевую аминокислоту). Для этого они предложили блокировать в пептиде аминоконец b-нафталин-сулфониловой группой, которая не отщепляется при гидролизе. Выделяя затем из гидролизата аминокислоту, меченую такой группой, можно было определить, какая из аминокислот была N-концевой.

После исследований Э. Фишера стало ясно, что белки представляют собой полипептиды. Это было важное достижение, в том числе и для задач синтеза белков: стало ясно, что именно нужно синтезировать. Только после этих работ проблема синтеза белка приобрела определенную направленность и необходимую строгость.

Говоря о работе Фишера в целом, следует отметить, что сам подход к исследованию был типичен скорее для наступающего XX века – он оперировал широким набором теоретических положений и методических приемов; его синтезы все менее и менее походили на искусство, основанное на интуиции, чем на точном знании, и приближались к созданию серий точных, почти технологических приемов.