На правах рукописи
ЛЕВКОВСКАЯ МАРИЯ НИКОЛАЕВНА
ПРОТИВОВИРУСНОЕ ДЕЙСТВИЕ ВИТУЛИНА И ТУЛИМКАРА
В ОПЫТАХ IN VITRO И IN VIVO
06.02.02 – ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата ветеринарных наук
Санкт-Петербург – 2011
Работа выполнена на кафедре микробиологии, вирусологии и иммунологии животных ФГОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины»
Научный руководитель: доктор биологических наук
Официальные оппоненты: доктор ветеринарных наук
Заслуженный деятель науки,
доктор ветеринарных наук, профессор
Ведущая организация: ФГОУ ВПО «Курская государственная
сельскохозяйственная академия имени
профессора »
Защита диссертации состоится 29 сентября 2011 года в часов на заседании диссертационного совета Д 220.059.03 при ФГОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины» г. Санкт-Петербург, .
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины».
Автореферат разослан 2011 года и размещен на сайте академии http://***** 2011 года.
Ученый секретарь диссертационного совета,
доктор биологических наук
1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. Одной из важных проблем современной науки являются респираторные болезни.
По данным ученых, смертность от них во всём мире имеет тенденцию ко всё большему нарастанию ( и др.,1999; , 2001; и др., 2002; и др., 2005; , 2004 – 2010; и др., 2010; и др., 2010).
Выявлено многообразие различных вирусов и их многочисленных серотипов, что затрудняет борьбу с ними с помощью методов специфической профилактики и способствует возникновению спонтанных инфекций ( и др.,1991 – 1998; , 2002; , 2004 – 2011).
В племенном животноводстве у телят наиболее часто встречаются инфекционные болезни, вызванные вирусами из семейств Herpesviridae и Orthomyxoviridae. Возбудители данных семейств поражают эпителий верхних дыхательных путей, что способствует активации условно – патогенной и сапрофитной микрофлоры и проникновению её в ткань лёгких. Ассоциация респираторных вирусов и микроорганизмов приводит к снижению иммунологической реактивности организма телят и возникновению вторичного иммунодефицитного состояния. Переболевшие животные в дальнейшем не могут быть использованы для племенных целей, что затрудняет воспроизводство стада. Наиболее опасным является вирусоносительство в критические возрастные периоды жизни, когда колостральный иммунитет находится на стадии затухания, а иммунная система еще не сформирована (,1991 – 1998; , 2004 – 2011).
Поиск средств защиты новорожденных телят от респираторных вирусных болезней проводится учеными всего мира в нескольких направлениях:
1. Активная иммунизация живыми или инактивированными вакцинами;
2. Пассивная иммунизация специфическими гипериммунными сыворотками;
3. Повышение неспецифической резистентности организма с использованием иммунотропных препаратов.
Применение живых или инактивированных вакцин не предотвращает латенции вирусов сем. Herpesviridae в организме животных (,1991 – 1998; , 2003; , 2004, 2009).
Пассивная иммунизация специфическими гипериммунными сыворотками легко может быть преодолена вирусами с высокой вирулентностью (, 2006).
Интерес к иммунотропным препаратам обусловлен возрастающей неэффективностью традиционных методов терапии, а также ростом устойчивости патогенов к лекарственным средствам (, и др., 2002; Н., 2005; и др., 2006; и др., 2000 – 2011).
Однако использование иммуностимуляторов, иммунокорректоров, вызывающих активацию Т и В – клеточного иммунитета, представляет серьезную проблему. При их длительном применении возможна переактивация клеток иммунной системы (,1994).
На современном этапе науки для профилактики респираторных болезней телят необходимы препараты с направленным действием: антимикробным, противовирусным, противовоспалительным и предотвращающим запуск опухолевой трансформации клеток даже при их длительном применении. Таким требованиям отвечают патентованные иммуномодулирующие препараты Витулин и Тулимкар. В своём составе они содержат соединения нескольких подгрупп флавоноидов (флавоны, флавонолы, флавононы) и их гликозиды, полученные из цветов, вегетативной части и корней растений нескольких семейств: сложноцветные, барбарисовые и астровые. Флавоноиды этих растений, находящиеся в гликозидированном виде, подвергнуты полному гидролизу, что абсолютно исключает токсичность препаратов. При ферментации гликозидов образуются радикалы, которые обладают активным бактериостатическим действием в отношении грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов, а также патогенных грибков, микоплазм и простейших.
Витулин включает биологически активные вещества, способствующие индукции эндогенного гамма – интерферона, который в свою очередь обладает противовирусным, антибактериальным, противовоспалительным, антипролиферативным и гепатотропным действием.
Тулимкар корректирует Т - и В-клеточный иммунитет, активирует NK клетки. Содержащийся в препарате 3 – окси – флавон – силибин тормозит лектинининдуцированный митогенез клеток (, 2
Цель исследований. Целью данной работы является определение противовирусного действия Витулина и Тулимкара в опытах in vitro и in vivo.
Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
1. Изучить противовирусное действие препарата Витулин in vitro в перевиваемой конфлюэнтной культуре клеток MDCK, исключая влияние гомеостаза организма на активность вирусов;
2. Изучить противовирусное действие препарата Витулин in vivo на чувствительной биологической модели, самках мышей линии CBA;
3. Разработать эффективные и экономичные схемы и методы активной неспецифической иммунопрофилактики респираторных болезней новорожденных телят, обусловленных вирусами из семейств Herpesviridae и Orthomyxoviridae.
Научная новизна.
- впервые изучено ингибирующее действие Витулина на репродукцию респираторных эпидемических высоковирулентных для человека, животных и птиц вирусов гриппа А/Сидней/05/97(H3N2) и А/17/утка/Потсдам/86/92 (H5N2) в опытах in vitro в конфлюентных культурах клеток MDCK, без влияния гомеостаза организма на активность вирусов;
- впервые изучено в опытах in vivo на чувствительной биологической модели, самках мышей линии CBA, ингибирующее действие Витулина на репродукцию респираторных эпидемических высоковирулентных для животных, человека и птиц вирусов гриппа семейства Orthomyxoviridae;
- разработаны экономичные и эффективные схемы активной неспецифической иммунопрофилактики респираторных болезней новорожденных телят, обусловленных вирусами из семейств Herpesviridae и Orthomyxoviridae.
Практическая значимость диссертационной работы:
- разработаны эффективные и экономичные схемы и методы активной неспецифической иммунопрофилактики респираторных болезней новорождённых телят, обусловленных вирусами из семейств Herpesviridae и Ortho-myxoviridae;
- разработаны рекомендации по применению Витулина и Тулимкара для активной неспецифической иммунопрофилактики респираторных вирусных болезней телят (утверждены на научно - координационном совете по животноводству и ветеринарии Северо – Западного научно – методического центра Россельхозакадемии, протокол №4 от 01.01.01г.);
- разработанные рекомендации по применению Витулина и Тулимкара для активной неспецифической иммунопрофилактики респираторных вирусных болезней новорождённых телят с высоким положительным эффектом применены в племенных хозяйствах Калининградской области (Российская Федерация);
- полученные данные о противовирусном действии препаратов Витулин и Тулимкар используются в учебном процессе ФГОУ ВПО «СПбГАВМ».
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Витулин оказывает ингибирующее действие на репродукцию респираторных эпидемических высоковирулентных для животных, человека и птиц вирусов гриппа семейства Orthomyxoviridae в опытах in vitro в конфлюэнтной культуре клеток MDCK, без влияния гомеостаза организма;
2. Витулин ингибирует репродукцию респираторных эпидемических высоковирулентных для человека, животных и птиц вирусов гриппа семейства Orthomyxoviridae в опытах in vivo в тканях лёгких мышей линии CBA.
3. Разработаны оптимальные схемы и методы активной неспецифической иммунопрофилактики респираторных вирусных болезней новорожденных телят, обусловленных возбудителями из семейств Herpesviridae и Orthomyxoviridae, в критический период жизни животных с использованием Витулина и Тулимкара.
Апробация работы. Основные материалы исследований по диссертационной работе доложены и обсуждены на ежегодных научных конференциях Санкт – Петербургской Государственной академии ветеринарной медицины (Санкт – Петербург, 2007 – 2011 гг); Международном конгрессе ветеринарных фармакологов «Эффективные и безопасные лекарственные средства» (СПб, 2008 г); Всероссийском съезде ветеринарных фармакологов и токсикологов (СПб, 2009 г); научных конференциях молодых учёных и студентов СПбГАВМ (2008 – 2009 гг); Международных конгрессах ветеринарных фармакологов (СПб, 2008 – 2009); Международном съезде ветеринарных фармакологов и токсикологов (СПб, 2011 г).
Публикация результатов исследований. По материалам диссертации опубликовано 15 научных работ, в том числе 4 в журналах, рецензируемых ВАК; а также методические рекомендации (утверждены на научно - координационном совете по животноводству и ветеринарии Северо – Западного научно – методического центра Россельхозакадемии, 2009г).
Объем и структура диссертации. Диссертация включает введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты собственных исследований, обсуждение результатов, выводы, практические предложения, список литературы, приложения. Диссертационная работа изложена на 130 страницах машинописного текста, содержит 5 таблиц, 24 рисунка. Список литературы включает 263 источника, из них 103 иностранных авторов.
2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Материалы и методы исследований
Научные исследования были проведены в период с 2006 по 2009 гг. в соответствии с планами научно-исследовательской работы кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии ФГОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины».
Препарат Витулин с растворителем исследовали в опытах in vitro и in vivo в отделе вирусологии НИИ экспериментальной Медицины СЗО РАМН.
Испытания препаратов Витулин и Тулимкар проводили в производственных условиях в племенном хозяйстве Калининградской области на телятах черно-пестрой породы в возрасте до месяца в период энзоотии респираторных болезней, обусловленных возбудителями из семейств Herpesviridae и Оrthomyxoviridae.
Было проведено три серии опытов:
1. В первой серии использовали перевиваемые монослойные конфлюэнтные культуры клеток MDCK для выявления прямого противовирусного действия Витулина in vitro, исключая влияние гомеостаза организма.
2. Во второй – проводили исследования in vivo, на лабораторных животных, (самках мышей линии СВА) с целью определения противовирусного действия препарата на возбудителей семейства Orthomixoviridae.
3. В третьей – изучали профилактический эффект препаратов Витулин и Тулимкар на телятах девятнадцати – тридцати одного дня жизни, когда иммунная система еще не сформирована, в период энзоотии респираторных болезней, обусловленных вирусами из семейств Herpesviridae и Оrthomyxoviridae.
IN VITRO (на культуре клеток MDCK). Для выявления прямого противовирусного действия Витулина in vitro были использованы вирусы гриппа А/Сидней/05/97(H3N2) и холодоадаптированный, реассортантный штамм А/17/утка/Потсдам/86/92 (H5N2).
Культивирование вирусов проводили в десятидневных куриных эмбрионах от кур породы Леггорн из птицефабрики «Синявино». Гемагглютинирующую и инфекционную активность вирусов устанавливали в реакции гемагглютинации по (, 2001). Инфекционный титр вируса, выраженный в 50% эмбриональных дозах (ЭИД50), определяли путем титрования 10-кратных разведений вирусов гриппа на куриных эмбрионах с последующим подсчетом результатов по Риду и Менчу (Reed L. J., Muench H. A., 1938).
Для определения 50% тканевой инфекционной дозы (ТЦИД50) в конфлюэнтные культуры клеток MDCK, в 96-луночных панелях, вносили подготовленные разведения вирусов до 10-8. По окончании времени инкубации к супернатантам добавляли 1% куриные эритроциты. Результаты учитывали в реакции гемагглютинации и подсчитывали ТЦИД50 по Риду и Менчу.
Оценку противовирусного действия Витулина in vitro проводили на культуре клеток MDCK. Монослойные конфлюэнтные культуры клеток MDCK выращивали в 96 – луночных панелях для культур клеток при 37°С и 5% СО2. Культуральную среду удаляли и клетки трижды отмывали фосфатно – солевым буфером, содержащим антибиотики. В качестве заведомо положительного контроля был взят Ремантадин. На каждый препарат отводили по три лунки панели. В ряд А вносили Ремантадин, Витулин и Витулин с растворителем в объеме по 100 мкл. Далее проводили падающие двукратные разведения препаратов по ряд F на среде DMEM. Вирусы использовали в дозе 100 ТЦИД50 на лунку. Разведения вирусов готовили на среде DMEM, содержащей антибиотики и 5 мкг/мл трипсина. Во все лунки рядов А-F панели вносили по 100 мкл вируса. Ряд G служил клеточным контролем (в лунки вносили среду DMEM), ряд H служил индикатором вирусной активности (вносили только вирус). Панели инкубировали 72 часа в термостате при 37оС и 5% СО2.
По окончании времени инкубации клетки окрашивали 0,2% спиртовым раствором кристаллического фиолетового и проводили спектрофотометрию планшетов при длине волны 630 нм. Расчет 50% ингибирующей концентрации проводили, исходя из средних значений оптической плотности (ОП) в контрольных лунках рядов G и Н, по формуле: (ОП кл. к. – ОП вир. к)/2.
IN VIVO (на мышах линии СВА). Для изучения противовирусного действия Витулина в отношении возбудителей семейства Оrthomyxoviridae в опытах in vivo использовали высокочувствительных к вирусу гриппа самок мышей линии СВА в возрасте 6-8 недель. Животные были разделены на четыре группы по 10 мышей в каждой. Витулин, предварительно разведенный 1:1 растворителем, инъецировали парентерально в дозе 0,5 мл/мышь (0.3 мл – внутримышечно и 0.2 внутрибрюшинно).
Индикаторным вирусом служил эпидемический вирус гриппа А/Сидней/05/97 (H3N2). Мышей заражали интраназально в дозе 106ЭИД50 по 50 мкл на мышь.
Во второй группе (подопытная 1) препарат вводили мышам ежедневно в течение десяти дней до заражения и трёх - после введения вируса. В третьей группе (подопытная 2) инъекции проводили одновременно с введением вируса и в течение трёх дней после заражения. Животным первой, контрольной группы (контроль вируса), каждый день, в течение 10 дней до заражения, вводили физиологический раствор. Мыши четвертой группы (контроль 2) являлись здоровым контролем и не получали никаких препаратов (табл. 2).
Инфекционную активность вируса гриппа и ингибирующую эффективность Витулина определяли на третьи сутки после заражения, когда происходит максимальная репродукция возбудителя. Из каждой группы отбирали по три мыши и проводили забор легких, которые затем индивидуально гомогенизировали в 1 мл холодного фосфатно-солевого буфера в стерильных условиях. Гомогенаты центрифугировали при 10000 об/мин для удаления твердых примесей.
Инфекционный титр вирусов в пробах, выраженный в 50% тканевой цитопатической дозе (ТЦИД50), определяли титрованием десятикратных разведений образцов легких на культуре клеток MDCK. После инкубации при 37°С в течение трех суток клетки окрашивали 0,2% спиртовым раствором кристаллического фиолетового и проводили спектрофотометрию планшетов при длине волны 630 нм. Титр вируса в пробах вычисляли по методу Рида и Менча и графическим методом пробит – анализа.
Для гистологического исследования на третьи сутки после заражения из каждой группы отбирали по три мыши, у которых изымали легкие. Из отобранного материала готовили срезы по общепринятой методике и окрашивали гематоксилином и эозином, и пикроиндигокармином. Оценку и описание гистологических срезов проводили с помощью бинокулярного микроскопа «Микмед» («Петролазер»), используя окулярные насадки с увеличением 16 и 10 и объективы - 4, 10, 40. Фотографирование гистопрепаратов осуществляли цифровым фотоаппаратом Olympus SP 350, жёстко закреплённым с помощью фотонасадки на окуляр с увеличением 10. Обработку фотографий проводили с применением графического редактора Abode Photoshop SC.
Телята. В третьей серии опытов для изучения профилактического действия Витулина и Тулимкара использовали более ста двадцати телят черно-пестрой породы в возрасте до месяца в период энзоотии респираторных вирусных болезней. Животные были произвольно разделены на подопытную (65 голов) и контрольную (63 головы) группы. Телятам подопытной группы, начиная с девятнадцатого и по тридцать первый день жизни, проводили активную неспецифическую иммунопрофилактику с использованием Витулина и Тулимкара. Их вводили сочетано, внутримышечно, с интервалом в двое суток, в дозе 0,1 мл/кг массы. Перед применением препараты разводили специальным растворителем из расчета 1:1. Животным контрольной группы вводили γ – глобулины и иммунотропные препараты.
От телят до и после проведения активной неспецифической иммунопрофилактики брали кровь для определения биохимических и иммунологических показателей. Бактерицидную и лизоцимную активность сыворотки крови определяли, используя методические рекомендации под ред. с соавторами (1989). Белок определяли на полуавтоматическом биохимическом анализаторе «Stat Fax 1904 Plus» с использованием наборов реагентов «ОЛЬВЕКС ДИАГНОСТИКУМ».
Результаты экспериментов обрабатывали методом вариационной статистики с использованием критериев Стьюдента и К. Пирсона (, 1990).
2.2. Результаты исследований.
2.2.1. Противовирусные свойства Витулина in vitro.
В серии опытов с использованием перевиваемой культуры клеток MDCK в сравнительном аспекте изучено влияние различных концентраций иммуномодулирующих препаратов Витулин, Витулин с растворителем и Ремантадин на репродукцию вирусов гриппа A/Сидней/05/97(H3N2) и А/17/Утка/Потсдам/86/92(Н5N2), высоковирулентных для человека, животных и птиц. Полученные данные представлены в таблице 1.
Таблица 1.
Противовирусная 50% ингибирующая концентрация препаратов
Препарат | 50% ИК, мкг/мл |
A/Сидней/05/97(H3N2)* | |
Витулин | 16,1 |
Витулин с растворителем | 16,1 |
Ремантадин | 4,9 |
А/17/Утка/Потсдам/86/92(Н5N2)* | |
Витулин | 125 |
Витулин с растворителем | 62,25 |
Ремантадин | 9,1 |
* вирусы использовали в дозе 100 ТЦИД50
Как видно из таблицы, 50% ингибирующая концентрация Ремантадина для вируса гриппа A/Сидней/05/97(H3N2) составила 4,9 мкг/мл, а для вируса А/17/Утка/Пот-сдам/86/92(Н5N2) – 9,1 мкг/мл.
Противовирусная 50% ингибирующая концентрация Витулина и Витулина с растворителем в отношении эпидемического вируса гриппа А/Сидней/05/97 (H3N2) составила 16,1 мкг/мл. Для вируса гриппа А/17/Утка/Потсдам/86/92 (H5N2) 50% ингибирующая концентрация Витулина была в пределах 125 мкг/мл, Витулина с его растворителем – 62,25 мкг/мл.
При расчете ингибирующей концентрации Витулина и Ремантадина необходимо учитывать молекулярный вес данных препаратов. С учетом низкого молекулярного веса Витулина его 50% ингибирующая концентрация в отличие от Ремантадина несущественна.
На основании полученных данных можно заключить, что Витулин оказывал прямое ингибирующее действие на репродукцию эпидемических вирусов гриппа А в конфлюэнтной культуре клеток MDCK. Эффект воздействия был выраженным в отношении обоих эпидемических высоковирулентных для животных, человека и птиц вирусов А/Сидней/05/97 (H3N2) и А/17/Утка/Потсдам/86/92 (H5N2).
Проведённые исследования показали, что Витулин и Витулин с растворителем нетоксичны для культуры перевиваемых клеток MDCK в дозах, вызывающих ингибицию высокопатогенных эпидемических штаммов вируса гриппа. Использование в опытах двух штаммов вируса гриппа, различных по структуре ионного состава, не оказывало существенного влияния на активность Витулина и Витулина с растворителем.
2.2.2. Противовирусное действие Витулина in vivo.
В серии опытов, проведенных in vivo на высокочувствительной к вирусу гриппа биологической модели, самках мышей линии СВА, получены существенные различия в инфекционной активности вируса, выделенного из лёгких мышей подопытных и контрольных групп. Результаты проведённых исследований представлены в таблице 2.
Таблица 2.
Противовирусное действие препарата Витулин в опыте in vivo
№ группы | Группа животных | Титр вируса в lg ТЦИД50 /мл | Индекс ингибиции в lg ТЦИД50 /мл |
1 | Контроль вируса (в течении 10 дней до заражения мышам вводили физиологический раствор) | 10-6,1 | 0 |
2 | Подопытная 1 (Витулин инъецировали мышам ежедневно в течение 10 дней до заражения и 3 – после введения вируса) | 10-3,8 | 2,3 |
3 | Подопытная 2 (инеъкции Витулина проводили одновременно с введением вируса и в течение 3 дней после заражения) | 10-4,2 | 1,9 |
4 | Контроль 2 (здоровые животные) | 0 | 0 |
Примечание: индекс ингибиции представляет собой отношение титра вируса, выраженного в lg ТЦИД50 /мл контрольных групп к титру вируса подопытных групп.
Данные, приведённые в таблице, показывают, что репродукция вируса А/Сидней/05/97 (H3N2) в группе «контрольная 1» (контроль вируса) была максимальной – 6,1 lgТЦИД50/мл. Во второй группе (подопытная 1) снижение репродукции вируса наблюдали до 3,8 lg ТЦИД50/мл. Индекс ингибиции составил 2,3 lgТЦИД50/мл. В третьей группе (подопытная 2) наблюдали снижение репродукции вируса до уровня 4,2 lg ТЦИД50/мл. Индекс ингибиции был равен 1,9 lg ТЦИД50/мл. Таким образом, снижение инфекционной активности эпидемического штамма вируса гриппа А/Сидней/05/97 (H3N2) в подопытных группах было ≥200 раз по сравнению с группой 1 (контроль вируса).
Параллельно с вирусологическим исследованием была изучена гистологическая картина легочной ткани животных. Проведённые исследования показали, что картина легких мышей четвёртой группы (здоровые животные), не получавших никаких препаратов, характерна для здорового организма. Была обнаружена гиперемия, обусловленная танатологическими процессами, развившимися вследствие эвтаназии (рис. 1).
Рис.1.Контроль 2 (здоровые животные). Обнаружена гиперемия, обусловленная танатологическими процессами, развившимися вследствие эвтаназии. Окраска гематоксилином и эозином, ув.-100.
В первой группе (контроль вируса), где до заражения вирусом вместо Витулина вводили физиологический раствор, гистологические изменения в легких были характерны для пролиферативно-экссудативной (гнойной) очаговой интерстициальной пневмонии и катарально-гнойного бронхита. Крупные участки лёгочной ткани не имели выраженных структур из-за массивного скопления макрофагов, лимфоцитов и полиморфноядерных лейкоцитов, как целых, так и разрушенных, разроста фибробластов, диапедезных кровоизлияний, скопления белоксодержащей жидкости. Просветы бронхиол были заполнены десквамированным эпителием, лейкоцитами, белоксодержащей жидкостью; респираторный эпителий на большом протяжении имел признаки некробиоза, а стенка инфильтрирована клетками воспалительного ряда. В местах с массивными скоплениями клеток воспалительного инфильтрата отмечали разросты соединительной ткани (очаговый фиброз), перибронхиолярные абсцессы с захватом и разрушением стенки бронхиол (рис. 2).
Рис. 2. Контроль вируса. Изменения в лёгких характерны для пролиферативно – экссудативной (гнойной) очаговой интерстициальной пневмонии и катарально – гнойного бронхита. Окраска гематоксилином и эозином, ув.-100.
В группе №2 (подопытная 1) гистологическая картина легких животных, которым до заражения высоковирулентным для животных, человека и птиц вирусом гриппа А/Сидней/05/97 (H3N2) вводили Витулин в течение десяти дней и трёх после заражения, незначительно отличалась от гистологической картины легких животных здорового контроля. Была видна десквамация эпителия бронхиол, наличие катарального экссудата и отёк соединительной ткани в местах скопления лимфоцитов, плазматических клеток и макрофагов, причем более крупные наблюдались в периваскулярных и перибронхиальных пространствах; не встречались признаки катарально – гнойного бронхита и полиморфноядерных лейкоцитов в клеточных скоплениях (рис. 3).
Рис.3. Подопытная 1. Легочная ткань мыши. Десквамация эпителия бронхиол, наличие катарального экссудата и отёк соединительной ткани в местах скопления лимфоцитов, плазматических клеток и макрофагов. Окраска гематоксилином и эозином, ув.-100.
В третьей группе (подопытная 2), где Витулин вводили одновременно с вирусом гриппа А/Сидней/05/97 (H3N2), воспалительные изменения проявлялись ярче, чем в группе №2 (подопытная 1). Признаки сосудистых реакций (скопление жидкости в полости альвеол, отёк перибронхиальной и периваскулярной соединительной ткани, полиморфноядерные лейкоциты среди клеток воспалительного инфильтрата) были сильнее выражены. Встречались бронхи с признаками катарально-гнойного воспаления. Прослеживалось преобладание периваскулярных диффузных и очаговых скоплений над перибронхиальными. Однако, в отличие от первой группы (контроль вируса), где вместо Витулина использовали физиологический раствор, не наблюдалось участков лёгочной ткани, где не были бы видны структуры лёгкого (просветы альвеол и межальвеолярные перегородки) из-за скопления клеток воспалительного инфильтрата. Бронхи были менее поражены, не выявляли признаков очагового фиброза (рис. 4).
Рис. 4. Подопытная 2. Структура ткани лёгких (просветы альвеол и межальвеолярные перегородки) сохранена. Бронхи менее поражены и не выявлены признаки очагового фиброза. Окраска гематоксилином и эозином, ув.-100.
Таким образом, проведённые вирусологические исследования показали, что Витулин при парентеральном введении вызывает в организме снижение инфекционной активности вируса гриппа. Причём его профилактическое использование до заражения респираторным высоковирулентным вирусом гриппа А/Сидней/05/97 (H3N2) было более эффективным. Гистологическая картина лёгких мышей этой группы почти не отличалась от здоровых животных. Во второй подопытной группе, где Витулин вводили одновременно с вирусом, при гистологическом исследовании было выявлено, что структура лёгких сохранена, несмотря на кратковременное применение препарата (3 инъекции). Следовательно, Витулин обладает выраженным лечебным и профилактическим действием даже при экспериментальном заражении высокочувствительных биологических моделей, мышей линии СВА, дозами высоковирулентного вируса гриппа.
На основании данных, полученных при вирусологическом и гистологическом исследовании можно сделать заключение, что Витулин оказывает существенное ингибирующее действие на репродукцию эпидемических вирусов гриппа А в ткани легких мышей. Наибольший положительный эффект наблюдается при профилактическом применении препарата.
2.2.3. Применение Витулина и Тулимкара для неспецифической иммунопрофилактики респираторных вирусных болезней телят девятнадцати – тридцати однодневного возраста.
Профилактика респираторных вирусных болезней новорожденных телят в возрасте девятнадцати-тридцатиодного дней имеет свои характерные особенности. В этот период колостральный иммунитет находится на стадии затухания. Наблюдается снижение, как клеточного, так и гуморального иммунитета, а собственный еще не развивается. У таких животных клинические признаки болезни не проявляются, а выделение возбудителей происходит. Вирусы в большой концентрации (4,5 – 5 lg ТЦД 50/мл) выделяются из носовой слизи, содержимого коньюнктивального мешка, слюны и мочи. В связи с этим наблюдается широкое распространение возбудителей и массовое перезаражение ( и др., 1991 – 1998).
Как правило, в это время снижаются как биохимические, так и иммунологические показатели. Проведенный нами анализ сыворотки крови телят 19 – 31– дневного возраста в племенном хозяйстве Калининградской области, неблагополучном по респираторным болезням, показал снижение иммунологической реактивности организма животных в пределах 15-20%. Так, бактерицидная активность сыворотки крови в подопытной и контрольной группах составила: 29,1 ± 1,4 % и 31,3 ± 1,2 %; лизоцимная - 11,3 ± 0,4 % и 13,01 ± 0,5 %; концентрация общего белка - 51,3 ± 1,2 г/л и 50,1 ± 1,2 г/л, соответственно.
Нами были испытаны различные схемы и дозы применения Витулина и Тулимкара для активной неспецифической иммунопрофилактики широко распространенных респираторных вирусных болезней телят, обусловленных возбудителями из семейств Herpesviridae и Orthomyxoviridae в угрожаемых и неблагополучных хозяйствах по респираторным болезням. Наиболее эффективной была следующая схема - начиная с девятнадцатого по тридцать первый день жизни животным внутримышечно с профилактической целью сочетанно вводится Витулин и Тулимкар. Интервал между инъекциями - двое суток, доза - по 0,025 мл/кг массы каждого. Перед применением препараты разводятся специальным растворителем из расчета 1:1. Телятам контрольной группы вводили γ – глобулины и иммунотропные препараты. После проведения активной неспецифической иммунопрофилактики Витулином и Тулимкаром при повторном исследовании сыворотки крови было установлено повышение общего белка, лизоцимной и бактерицидной активности относительно исходных показателей. Бактерицидная активность сыворотки крови в подопытной группе составила 56,2 ± 2,1 %, лизоцимная – 21,3 ± 0,3 %, концентрация общего белка - 61,3 ± 1,2 г/л. В контрольной группе бактерицидная активность - 41,2 ± 1,6 %; лизоцимная – 14,1 ± 0,8% и концентрация общего белка - 51,2 ± 1,3 г/л.
Таким образом, повышение биохимических и иммунологических показателей наблюдалось, как в подопытной, так и в контрольной группе. Однако в опыте, где использовали Витулин, общий белок был увеличен на 19,47%, тогда как в контрольной лишь на 3,98%; бактерицидная активность сыворотки крови повысилась на 96,55% и 36,84%, а лизоцимная - на 88,13% и 7,49%, соответственно.
Повышение резистентности организма животных подопытной группы отразилось и на количестве заболевших (3,07% от общего числа - 65 голов) (таблица 3).
Таблица 3
Эффективность применения Витулина и Тулимкара при активной неспецифической иммунопрофилактике респираторных болезней телят 19– 31- дневного возраста
№ п/п | Группа животных | Количество животных | Возраст в днях | Больные | |
Количество животных | % | ||||
1 | Контрольная | 63 | 19 - 31 | 26 | 41,3 |
2 | Подопытная | 65 | 19 - 31 | 2 | 3,07 |
Следует отметить, что заболевание у телят протекало легко и через 10±3 суток животные выздоравливали.
В контрольной группе процент больных был высоким (41,3% от 63 голов), причем болезнь протекала тяжело, с осложнениями, часто сопровождаясь поражением желудочно-кишечного тракта, рецидивами и выбраковкой ценных племенных животных.
Таким образом, активная неспецифическая иммунопрофилактика с использованием Витулина и Тулимкара является эффективным и экономичным методом сохранения ценных племенных животных в возрасте 19 – 31 - дневного возраста при энзоотии респираторных вирусных болезней, обусловленных возбудителями из семейств Herpesviridae и Orthomyxoviridae. Почти 100% сохранность молодняка подопытной группы обусловлена высокой противовирусной активностью Витулина, а также повышением факторов естественной резистентности организма животных – индукции эндогенного гамма – интерферона, увеличением макрофагальной активности и других показателей, что было доказано в более ранних исследованиях ( и др., 2006 – 2009; и др., 2000 – 2011).
Следует отметить, что Витулин и Тулимкар защищали телят не только от возбудителей из семейств Herpesviridae и Orthomyxoviridae, но и от возможной ассоциации других патогенных вирусов, циркулирующих в животноводческих хозяйствах, включая аденовирусы, парамиксовирусы и многочисленные неклассифицированные энтеровирусы.
3. ВЫВОДЫ
1. Установлено противовирусное действие препарата Витулин in vitro в перевиваемой конфлюэнтной культуре клеток MDCK, без влияния гомеостаза организма. 50% ингибирующая доза Витулина в отношении высоковирулентных для животных, человека и птиц респираторных эпидемических вирусов гриппа А/Сидней/05/97(H3N2) составила 16,1 мкг/мл, для А/17/утка/Потсдам/86/-92 (H5N2) – 62,25 мкг/мл.
2. Установлено противовирусное действие Витулина in vivo на высокочувствительной к вирусу гриппа биологической модели – самках мышей линии СВА. Выявлено снижение инфекционной активности высоковирулентного для животных, птиц и человека вируса гриппа А/Сидней/05/97(H3N2) с 6,1 до 3,8 lg ТЦИД50/мл (>200 раз). Индекс ингибиции составил 2,3 lg ТЦИД50/мл.
3. Гистологическая картина ткани лёгких самок мышей линии СВА, которым до заражения высоковирулентным для животных, человека и птиц респираторным эпидемическим вирусом гриппа А/Сидней/05/97(H3N2) с профилактической целью вводили Витулин, почти не отличалась от гистологической картины ткани лёгких здорового организма. В контроле, где вместо Витулина использовали физиологический раствор, наблюдалась пролиферативно – экссудативная (гнойная) очаговая интерстициальная пневмония и катарально – гнойный бронхит.
4. Разработан эффективный и экономичный метод активной неспецифической иммунопрофилактики респираторных вирусных болезней телят девятнадцати – тридцатидневного возраста, когда колостральный иммунитет находится на стадии затухания, а иммунная система еще не сформирована. По данному методу в хозяйствах, неблагополучных по респираторным болезням, обусловленным вирусами из семейств Herpesviridae и Orthomyxoviridae, Витулин и Тулимкар вводят внутримышечно, сочетано, в течение двадцати дней один раз в сутки с интервалом в два дня. Доза каждого препарата составляет 0,025 мл/кг массы тела. Перед применением их разводят специальным растворителем в соотношении 1:1. Количество заболевших животных в таких группах не превышает 3% по сравнению с контролем – 41%. Различия достоверны при Р<0,01.
5. Активная неспецифическая иммунопрофилактика с использованием Витулина и Тулимкара защищает организм новорождённых телят не только от возбудителей семейств Herpesviridae и Orthomyxoviridae, но и от других многочисленных вирусов, циркулирующих у животных в хозяйствах.
4. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ
1. Витулин и Тулимкар можно с успехом использовать для профилактики многочисленных вирусных болезней новорождённых телят младшего возрастного периода жизни.
2. Разработана эффективная и экономичная доза и схема активной неспецифической иммунопрофилактики новорождённых телят с использованием Витулина и Тулимкара в хозяйствах, неблагополучных по респираторным болезням. Инъекции следует проводить через каждые двое суток в течение двадцати дней. Доза каждого препарата составляет по 0,025 мл/кг массы тела.
3. Разработана эффективная и экономичная доза и схема активной неспецифической иммунопрофилактики новорождённых телят с использованием Витулина и Тулимкара в хозяйствах, угрожаемых по респираторным болезням. Инъекции следует проводить через каждые четверо суток в течение месяца. Доза каждого препарата составляет по 0,025 мл/кг массы тела.
5. СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.
Публикации в изданиях списка ВАК
1. Левковская действие препарата Витулин на вирус гриппа / , , // Вестник РАСХН. – 2008. - №5. – С, 97.
2. Левковская терапевтического действия Витулина при экспериментальной гриппозной инфекции / , , // Российский иммунологический журнал. – 2008. – том 2 (11). - №2 – 3. – С. 168.
3. Тулев иммуномодулирующих препаратов при генерализованных воспалительных процессах инфекционного генеза / , , // Российский иммунологический журнал. – 2008. – том 2 (11). - №2 – 3. – С.168.
4. Тулев матки коров, больных хроническим катарально – гнойным эндометритом. / , , // Молочное и мясное скотоводство. – 2009 - №5 - С. 29 – 30.
Публикации в сборниках периодической печати
5. Левковская ингибирующего действия препарата Витулин на вирусы семейства Orthomixoviridae / , , // Новые ветеринарные препараты и кормовые добавки. – 2008. – С.
6. Тулев противовоспалительного действия препарата Апитулим / В, , // Матер. первого междунар. конгресса ветер. фармакологов и токсикол. «Эффект. и безопасные средства». – СПб. – 2008 - С. 73.
7. Лыкова действие иммуномодулирующих препаратов серии Тулим / , ,, , // Матер. первого междунар. конгресса ветер. фармакологов и токсикол. «Эффект. и безопасные средства». – СПбС. 67 – 68.
8. Тулев противовоспалительного действия иммуномодулирующего препарата Тулим / , , // Новые ветеринарные препараты и кормовые добавки. Экспресс информация 19. - СПб. – 2008. – С.
9. Тулев действие иммуномодулирующих препаратов серии Апитулим / , , Талыбов ветеринарные препараты и кормовые добавки. Экспресс - информация 19. - СПб. – 2008. – с.
10. Левковская противовирусного действия иммуномодулирующего препарата Витулин «in vitro» / , , // Матер. всерос. съезда ветер. фармакологов и токсикол. «Эффект. и безопасные лекарств. средства в ветеринарии. – СПбС. 41 – 42.
11. Тулев иммуномодулирующего препарата Апитулим на жизнеспособность микроорганизмов в опытах «in vitro» / , , // Матер. всерос. съезда ветер. фармакологов и токсикол. «Эффективн. и безопасные лекарств. средства в ветеринарии. – СПбС. 81 – 82.
12. Левковская противовирусного действия иммуномодулирующего препарата «Витулин» in vivo / , , // Матер. 63 – й научн. конф. молодых ученых и студентов СПбГАВМ. – 2009. – С. 50.
13. Левковская действие иммуномодулирующего препарата «Витулин» in vitro / , , // Матер. 63 – й научн. конф. молодых ученых и студентов СПб-ГАВМ. – 2009. – С. 49.
14. Тулева специфического антигена вируса семейства HERPESVIRIDAE у телят, больных инфекционным ринотрахеитом / , , // Новые ветеринарные препараты и кормовые добавки. Экспресс - информация 21. - СПб. – 2010. – С.
15. Левковская профилактического и терапевтического действия иммуномодулируюдщего препарата Витулин при вирусной гриппозной инфекции / , , // Матер. 3 Съезда фармакологов и токсикол. России «Актуальн. проблемы вет. фармакологии, токсикологии и фармации». – СПб. – 2011. – С. 308 – 309.
