Влияние экзогенных факторов среды на морфогенез и регенерационную способность селекционного материала гороха посевного (Pisum Sativum l.) (стр. 3 )

- подбор исходного материала и введение в культуру;

- микроразмножение;

- получение пробирочных растений с корнями;

- пересадка в условия закрытого грунта.

В результате исследований было размножено две селекционно-ценные по ряду признаков линии (№ 000-02, № 000-02). Данный материал был передан селекционерам для проведения гибридизации и создания форм гороха с новыми признаками, что может способствовать ускорению процесса создания и внедрения новых сортов в два раза при меньших затратах труда и времени.

5. ЭМБРИОКУЛЬТУРА В СИСТЕМЕ IN VITRO

Влияние стерилизующих агентов на стерильность и выживаемость эксплантов. Применение в качестве стерилизующих агентов Хлорамина Б и Хлоргексидина в различных концентрациях и при различных экспозициях обработки (30, 60, 90 минут) не обеспечивало стерильности материала и приводило к некротизации тканей и гибели эксплантов.

Использование Белизны в концентрации 2 и 4 % при экспозиции эксплантов 30 и 60 минут позволило получить 20 % стерильность материала. Повышение концентрации до 8 % и 10 % увеличивало стерильность до 35 %, но приводило к ожогу тканей эксплантов и оказывало угнетающее действие на рост и развитие регенерантов. Аналогичный эффект наблюдался при применении Доместоса, хотя стерильность материала достигала 80 %.

Обработка зародышей гороха Анолитом в течение 30, 60, 90 и 120 минут не позволила достичь высокого стерилизующего эффекта. Стерильность эксплантов достигала 25 %.

Изучение в качестве стерилизующего вещества ртутьсодержащего препарата Мертиолят выявило его высокую эффективность. Стерильность материала удалость повысить до 80 %. Однако при дальнейшем культивировании эксплантов было отмечено ингибирующее действие Мертиолята. По истечениидней у большинства регенерантов отмечалось оводнение и некроз тканей. Высокий стерилизующий эффект наблюдался при применении Ломаксхлора в концентрации 0,05 % и времени экспозиции 60 минут. Стерильность эксплантов достигала 90 %. Аномалий в развитии зародышей не замечено.

Таким образом, наилучший стерилизующий эффект наблюдался при применении раствора Ломаксхлора в концентрации 0,05 % и времени экспозиции 60 минут.

Зависимость регенерационной способности зародышей

от стадий их развития

В связи с тем, что незрелые зародыши гороха имеют небольшие размеры и вычленение их без нанесения травм затруднено, введение в культуру производилось семязачатками.

Проведенные исследования показали, что 3 – 5 дневные зародыши в условиях in vitro формировали до 3,8 % нормально развитых проростков (рис. 2).

НСР05(норм.)=0,20 НСР05(всего)=0,72

Рис. 2. Влияние возраста зародышей на получение жизнеспособных проростков гороха

Количество полученных проростков из 5 – 8 дневных зародышей составило 16,8 %, в том числе нормально развитых – 10,5 %. Частота регенерации зародышей возраста 8 – 12 дней после опыления была на уровне 33,4 %, из которых 26,9 % нормально развитых. Максимальная частота регенерации (39,8 %) была отмечена у зародышей старше 12 дневного возраста. Нормально развитые проростки формировались в данном варианте у 28,9 % зародышей. Развитие эксплантов шло быстро, через 14 – 20 дней проростки имели четко выраженный корень и стебель.

Таким образом, применение метода эмбриокультуры дает возможность получать нормально развитые микроклоны из незрелых зародышей разного возраста (3 – 12 дней и более от опыления), причем большую склонность к дальнейшему развитию в условиях культуры тканей проявляли зародыши старших возрастов.

Влияние гормонального состава питательной среды на

регенерационную способность эксплантов

Для определения оптимального гормонального комплекса питательной среды было изучено 10 вариантов питательных сред с различными сочетаниями и концентрациями фитогормонов. Установлено, что наибольшая частота образования регенерантов (18,6 %) наблюдалась на питательной среде с добавлением 6 – БАП, ГК, Кин, ИМК по 0,1 г/л. На среде, содержащей 6 – БАП (0,2 мг/л), ГК (1,0 мг / л), образовывалось до 7,1 % нормально развитых регенерантов. При добавлении в питательную среду ИМК или ИУК в концентрации 0,1 мг/л при одинаковом содержании 6 – БАП (0,2 мг/л), ГК (1,0 мг/л) количественных и качественных различий замечено не было. Регенеранты были нормально развиты, имели насыщенную окраску и характерные растению гороха признаки.

Одновременное присутствие в питательной среде 6 – БАП в концентрации 0,5 мг/л и 1,0 мг/л гиббереллина стимулировало лишь каллусообразование в культуре незрелых зародышей. На средах, содержащих 6 – Б АП (0,5 мг/л), ИМК / ИУК (0,1 мг/л), шло активное нарастание каллусной массы с одновременным развитием регенерантов.

Образование регенерантов на питательной среде с добавлением 1,0 мг/л 6 – БАП, 0,1 мг/л ГК и ИМК / ИУК достигнуто не было. Наблюдалось оводнение тканей эксплантов и постепенная их гибель.

На среде, содержащей 6 – БАП (0,5 мг/л), ГК (0,1 мг/л), кинетин (0,5 мг/л), образовывалось 4,3 % аномально развитых регенерантов.

На контрольном варианте (без гормонов) наблюдалось единичное развитие эксплантов. Причем развитие шло у зародышей старше 12 дней после опыления. Это подтверждает мнение А. Атанасова (1993) о том, что, чем моложе зародыш, тем выше требования к гормональному составу питательной среды.

В связи с этим при изучении влияния гормонального состава питательной среды для культивирования незрелых зародышей была выделена питательная среда с гормональным комплексом 6 – БАП : ГК : ИМК / ИУК (по 0,1 мг/л), на которой формировались нормально развитые, жизнеспособные регенеранты.

Определение лимитирующих факторов культивирования незрелых зародышей гороха (стадии развития эксплантов, их стерилизация при введении в культуру тканей, состав питательной среды) позволило разработать режимы культивирования незрелых зародышей в системе in vitro.

Использование разработанных режимов культивирования незрелых зародышей гороха позволяет создавать новый исходный материал для селекции путем получения различных гибридов. Часто невозможность осуществления некоторых скрещиваний связана с приостановкой развития гибридного зародыша, что может быть обусловлено его ранней гибелью или дегенерацией эндосперма (Атанасов, 1993).

В нашей работе по внутривидовой гибридизации использовались сорта и линии гороха разного происхождения (wi 7106 – США, VSB 128.132 - Германия). В проведенных исследованиях эффективность гибридизации находилась на невысоком уровне – до 7 %. Увеличить жизнеспособность зародышей удалось с применением эмбриокультуры.

В опыте было проведено две гибридные комбинации скрещивания (VSB 128.132 х Рамонский-77 и wi 7106 х АМЗК-99). В результате применения культуры незрелых зародышей и дальнейшего микроразмножения на горохе было получено 23 и 31 растений. После самоопыления в условиях закрытого грунта получено 58 семян от комбинации скрещивания VSB 128.132 х Рамонский-77и 69 семян от комбинации скрещивания wi 7106 х АМЗК-99. Семена были зеленого и розового цвета. Полученные семена были переданы селекционерам для дальнейшей селекционной работы.

Таким образом, применение культуры незрелых зародышей может быть широко использовано для создания новых селекционных линий с хозяйственно-ценными признаками.

Восстановление всхожести длительно хранившихся семян

методом эмбриокультуры

Проведенные нами попытки получения растений из длительно хранившихся семян гороха с помощью культуры in vitro показали повышение их всхожести, что может способствовать восстановлению селекционного материала ценных сортов.

Так, у 5 изучаемых селекционных номеров (Рамус, Зенит, Амур, Рамонский-77, № 000) лабораторная всхожесть колебалась от 12 % до 82 % в зависимости от срока хранения.

В литературных источниках указано, что всхожесть значительно падает уже после 5 лет хранения. В наших исследованиях даже после 7 и 10 лет хранения семена гороха имеют всхожесть на уровне 79 % и 54 % соответственно. Образец семян сорта Рамонский-77, хранившийся 18 лет, имел показатели всхожести до 12 %. По-видимому, сохранение всхожести длительно хранившихся семян связано в большей степени с генотипическими особенностями и условиями произрастания растений.

При введении в условия in vitro длительнохранившихся семян были получены нормально развитые проростки. Прорастание семян наблюдалось в пределах 38 – 95 %. Средняя длина корешка достигала 3-6 см. Наблюдалось наличие многочисленных боковых корешков. Проростки имели насыщенную зеленую окраску листьев и стебля. Высота растений достигала 5-6 см. Наличие уродливых или недоразвитых проростков отмечено не было.

Данные показатели свидетельствуют о том, что метод эмбриокультуры позволяет получать нормально развитые проростки из длительно хранившихся семян и повысить показатель всхожести практически в два раза. Это объясняется тем, что в условиях in vitro факторы температуры, влажности и освещенности искусственно регулируются и являются оптимальными. Кроме того, наличие экзогенного минерального и гормонального комплекса питательной среды также обеспечивают благоприятные условия для прорастания семян и нормального развития проростков.

Таким образом, при определении режимов культивирования незрелых и зрелых зародышей гороха было установлено, что:

· наилучший стерилизующий эффект наблюдался при применении раствора Ломаксхлора в концентрации 0,05 % и времени экспозиции 60 минут;

· нормально развитые микроклоны из незрелых зародышей разного возраста (3 – 12 дней и более от опыления), причем большую склонность к дальнейшему развитию в условиях культуры тканей проявляли зародыши старших возрастов;

· для культивирования незрелых зародышей оптимальной является питательная среда с гормональным комплексом 6 – БАП : Гк : ИМК / ИУК (по 0,1 мг/л), на которой формировалось 18,6 % нормально развитых, жизнеспособных регенерантов и применение культуры незрелых зародышей может быть широко использовано для создания новых селекционных линий с хозяйственно-ценными признаками.

ВЫВОДЫ

1. Влияние экзогенных факторов на возрастные периоды развития растений в онтогенезе от заложения вегетативных органов до формирования репродуктивной сферы и зрелых семян определяет особенности формирования жизнеспособных растений-регенерантов в условиях in vitro. Это способствует разработке методов биотехнологии для создания новых форм растений и повышает результативность селекционной работы.

2. Морфогенетические особенности возрастной периодизации жизненного цикла гороха посевного углубляют представления о природе онтогенеза. Установлена продолжительность возрастных состояний и взаимосвязь их с этапами органогенеза и фазами развития растения. Диагностика растительных тканей в онтогенезе дает возможность отбирать ценные морфотипы растений при разработке новых биотехнологических и селекционных методов.

3. Взаимосвязь возрастных состояний с органообразовательными процессами выражается в сопряжении I этапа органогенеза с состоянием проростка и появлением всходов. Во время ювенильного, имматурного и виргинильного состояния (II и III этапы органогенеза) у растений гороха идет активное нарастание главного и боковых побегов. С IV по XII этапы ограногенеза связаны с генеративным периодом развития и затрагивает репродуктивный цикл развития: формирование мужского и женского гаметофитов, самоопыление, образование, налив и созревание семян. Затем следует постгенеративный период, соответствующий отмиранию растений.

4. Выявлены отличительные признаки возрастных состояний и этапов органогенеза индетерминантных (Рамонский-77) и детерминантных (АМЗК-99) форм гороха. Индетерминантный тип роста характеризуется «открытым» конусом нарастания, что дает возможность растению формировать большее число продуктивных узлов, увеличивая длину стебля. У детерминантного типа роста стебля наблюдается замедление образования числа продуктивных узлов на IV этапе развития, что вызывает быстрое прохождение периодов цветения, плодообразования и созревания семян (VI – IX этапы органогенеза).

5. Определены критические по отношению к высокой температуре и недостатку влаги периоды онтогенеза, из которых особо чувствительны к данным стрессам этапы формирования репродуктивных органов, фазы цветения и налива зерна. Установлена высокая положительная корреляционная связь (r=0,905-1,0) влияния гидротермических условий на формирование генеративной сферы и элементов продуктивности, что способствует прогнозированию продуктивности гороха на ранних этапах развития растений и повышению результативности селекционной работы.

6. Разработана схема стерилизации эксплантов гороха при введении в условия in vitro, включающая в себя обработку апикальных меристем вегетирующих растений, зрелых семян и незрелых зародышей 0,05 % раствором Ломаксхлора при экспозиции в течение 60 минут. Данная схема обработки обеспечивает стерильность материала на уровне 90 %.

7. Усовершенствован метод микроклонального размножения гороха в условиях in vitro. Установлена оптимальная для микроразмножения гороха питательная среда на основе Мурасиге, Скуга (MS) с половинной нормой минеральных солей и гормональным комплексом, содержащим 6-БАП в концентрации 0,5 мг/л и ИУК / ИМК в концентрации 0,1 мг/л, обеспечиваюшая формирование хорошо развитых регенерантов с коэффициентом размножения 4-5.

8. Установлено, что при введении изолированных тканей в культуру необходимо учитывать гормональный состав питательной среды, тип экспланта и его положение на среде. При культивировании эксплантов на среде с повышенными концентрациями гормонов (6 - БАП 5,0 мг/л + НУК 0,2 мг/л) оптимальным типом экспланта являются части стебля с почками при горизонтальном положении на питательной среде, с умеренной концентрацией гормонов (6 - БАП 0,5 мг/л + ИМК 0,1 мг/л) оптимальна апикальная часть стебля и вертикальное положение. Коэффициент размножения при этом увеличивается до 5 микроклонов с 1 экспланта.

9. Выявлены основные лимитирующие факторы культивирования незрелых и зрелых зародышей гороха, что позволило разработать режимы их культивирования в системе in vitro. Показано, что оптимальной для незрелых зародышей является питательная среда, содержащая 6-БАП, ГК, ИМК/ИУК по 0,1 мг/л, позволяющая формировать до 18,6 % нормально развитых, жизнеспособных проростков. Культивирование зрелых зародышей и зародышей длительно хранившихся семян обеспечивала питательная среда с содержанием 6-БАП 0,5 мг/л и ИМК/ИУК 0,1 мг/л, что повышало коэффициент размножения с 2 до 5 и всхожесть семян в два раза.

Рекомендации для практического применения

1. При разработке новых селекционных программ по созданию высокопродуктивных сортов гороха рекомендуется использовать разработанные методы биотехнологии с учетом особенностей онтогенетического развития растений:

- усовершенствованный метод микроклонального размножения гороха в условиях in vitro для размножения и сохранения оригинального селекционного материала;

- режимы культивирования незрелых и зрелых зародышей гороха для получения растений при трудно проводимых скрещиваниях и восстановления ценного селекционного материала из длительно хранившихся семян.

2. Полученный в результате исследований материал (2 линии от внутривидовой гибридизации VSB 128.132 х Рамонский-77 и wi 7106 х АМЗК-99) и (2 селекционно-ценные по ряду признаков линии (№ 000-02, № 000-02) целесообразно использовать в селекционном процессе.

Публикации в изданиях, рекомендованных ВАК РФ

1. Особенности вегетативного размножения гороха в культуре in vitro / // Научные ведомости Белгородского Государственного Университета. Серия естественные науки. – 2011. - № 9 (104), выпуск 15/2. – С. 139-143.

2. Н. Особенности размножения гороха в культуре in vitro / , , // Вестник Воронежского Государственного Аграрного Университета. Агрономические науки. – 2012. - № 2 (33). – С.41 – 46.

3. Разработка основных этапов метода культивирования незрелых зародышей гороха в условиях in vitro / , , // Вестник Воронежского Государственного Аграрного Университета. Агрономические науки. – 2013. - № 2 (37). – С.121-125.

Публикации по теме диссертации в иных изданиях

4. Влияние дезинфицирующих веществ на жизнеспособность семян гороха в культуре in vitro / // Материалы межрегиональной науч-практ. конф. молодых ученых 30-31 октября 2007 г.- Ч.1.- Воронеж: Изд-во ВГАУ, 2007 – С. 275-278.

5. Жизнеспособность эксплантов гороха при использовании различных стерилизующих веществ / // IX Международная конференция «Биология клеток растений in vitro и биотехнология». 8-12 сентября 2008 г.- Звенигород: Изд-во ИД ФБК-ПРЕСС, 2008- С. 336-337.

6. Особенности вегетативного размножения гороха в культуре in vitro / // Материалы Всероссийской науч.-практ. конференции «Современные проблемы АПК». 25 апреля 2008 г.- ГНУ Адыгейский НИИСХ, 2008 – С. 206-209.

7. Вегетативное размножение гороха в культуре in vitro / // IX Молодежная научная конференция «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии». 8 апреля 2009 г.- Москва, 2009 –С. 25-26.

8. Микроразмножение гороха в условиях in vitro / // Перспективы развития сельского хозяйства: наука, образование, практика: Материалы российско-германской науч.-практ. конференции 24-25 октября 2008 г. – Воронеж: Изд-во «Истоки», 2009 – С. 159-161.

9. Влияние возраста зародыша и состава питательной среды на получение жизнеспособных проростков гороха в культуре тканей / // X Молодежная научная конференция «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии». 7 апреля 2010 г. - Москва, 2010 – С. 40-41.

10. Микроклонирование гороха в культуре тканей /, , // II Международная научно – практическая конференция «Молодежь и наука: модернизация и инновационное развитие страны». 27 октября 2012 г. – Пенза, 2012 – С. 315 – 318.

11. Культивирование незрелых зародышей гороха в условиях культуры тканей / // Материалы VII Международной науч. – практ. конференции, посвященной 70 – летию Алтайского ГАУ «Аграрная наука сельскому хозяйству». 6-7 февраля 2013 г. – Барнаул, 2013 – Книга 2 – С. 208 – 209.

12. Зависимость регенерационной способности экспланта от его расположения на питательной среде / // XIII Молодежная научная конференция «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии». 10 апреля 2013 г. - Москва, 2013 –С. 47 – 49.

13. Квиткина влияния дезинфицирующих веществ на жизнеспособность эксплантов гороха в культуре тканей / , , // Глинковские чтения: Материалы Всероссийской студенческой науч. – практ. конференции. – Воронеж: ФГБОУ ВПО «Воронежский ГАУ», 2013 – С. 245 – 252.

14. Влияние расположения экспланта в культуре тканей на способность к микроразмножению / // X Международная конференция «Биология клеток растений in vitro и биотехнология». 14-18 октября 2013 г.- Казань, 2013.