Качественный и количественный флуориметрический анализ биомолекул

Качественный И КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ

флуориметрический АНАЛИЗ биомолекул

Спектры люминесценции, как и абсорбционные электронные спектры, используются для качественного и количественного анализа, в структурных исследованиях, для изучения физико–химических свойств сложных молекулярных систем. Люминесцентные методы анализа обладают высокой чувствительностью, в 1000 раз превышающей чувствительность большинства спектрофотометрических методов. Такая высокая чувствительность объясняется тем, что свечение молекул определяют непосредственно, причём его можно усилить или ослабить путём изменения интенсивности возбуждающего света. Особенность люминесцентных методов анализа обусловлена двумя основными факторами. Во-первых, существует относительно небольшое число веществ, обладающих люминесцентной способностью, по сравнению с поглощающими способностями. Во-вторых, в люминесцентном анализе используются две длины волны (возбуждения и испускания), тогда как, например, в спектрофотометрии анализ проводят при одной длине волны.

К недостаткам люминесцентных методов с точки зрения анализа веществ можно отнести зависимость люминесценции молекул от условий окружающей среды (температура, рН, вязкость и т. д.). Но этот недостаток делает люминесцентные методы перспективными для исследования физико–химических процессов в конденсированных средах. Природа таких процессов определяется из спектрально–люминесцентных характеристик молекул, которые носят название люминесцентных зондов. Таким образом, люминесцентные методы служат как для анализа самого вещества обладающего люминесцентной способностью (структурный анализ, качественный и количественный анализ), так и для изучения фотофизических процессов в конденсированных средах с использованием люминесцентных зондов.

Качественный флуориметрический анализ.

Качественный флуориметрический анализ позволяет обнаружить по спектрам флуоресценции (возбуждения и испускания) присутствие определённого вещества в анализируемой пробе. Для отождествления измеренного спектра флуоресценции со спектром какого-либо вещества определяют следующие параметры:

1) количество максимумов в спектре флуоресценции;

2) спектральное положение максимумов (lmax) полос флуоресценции;

3) полуширину полос флуоресценции (Dl1/2) - разность между двумя длинами волн, при которых интенсивность флуоресценции составляет половину от максимальной.

При этом необходимо помнить, что экспериментальные условия, при которых проводятся люминесцентные измерения, существенным образом влияют на форму спектра флуоресценции. Так, в частности, все перечисленные выше параметры могут изменяться в зависимости от рН среды, ее температуры, полярности растворителя, концентрации исследуемого вещества и т. д.

1) Исследование спектров испускания флуоресценции.

По спектрам испускания флуоресценции можно проводить качественный анализ веществ. При измерениях спектров испускания люминесценции часто облегчается анализ спектров многокомпонентных систем, поскольку не все поглощающие вещества люминесцируют. Преимуществом флуоресцентного анализа смесей нескольких соединений также является возможность выделения флуоресценции отдельных компонентов путём изменения длины волны возбуждения флуоресценции. Незначительные изменения состояния вещества: агрегация, комплексообразование, изменение кислотно-основного равновесия и т. д. - обычно очень сильно сказываются на его люминесцентных свойствах. Поэтому измерение спектров люминесценции - один из основных методов изучения состояния вещества в биологических системах.

2) Исследование спектров возбуждения флуоресценции.

В связи с тем, что спектр возбуждения люминесценции какого-либо вещества совпадает по форме и положению максимумов со спектром его поглощения, измерение спектра возбуждения люминесценции позволяет установить характеристики спектра поглощения вещества, люминесцирующего в данной спектральной области. Это очень важно для идентификации люминесцирующих веществ. Например, совпадение спектра возбуждения люминесценции разбавленного раствора триптофана с его спектром поглощения, является лучшим доказательством того, что в данной спектральной области люминесцирует именно триптофан, а не примеси. Совпадение спектра возбуждения люминесценции для разбавленных растворов белка со спектром поглощения триптофана свидетельствует о том, что из многих аминокислот, входящих в состав белковых молекул, именно присутствие триптофана обеспечивает люминесценцию в исследуемой спектральной области.

Количественный флуориметрический анализ.

Между интенсивностью флуоресценции (Iф) вещества и его концентрацией (С) существует следующая зависимость:

Iф = K × jкв. × (I0 - I) = I0 × K × jкв. × (1 - T) = I0 × K × jкв. ×D), (1)

где

I0 и I - интенсивности возбуждающего (падающего) и выходящего из образца светового пучка соответственно;

jкв. - квантовый выход люминесценции;

К - коэффициент, характеризующий чувствительность прибора для измерения люминесценции;

Т - пропускание образца при длине волны возбуждения люминесценции;

D - оптическая плотность образца при длине волны возбуждения люминесценции.

Из уравнения (1) видно, что величина Iф меняется в зависимости от D по экспоненциальному закону, и, следовательно, в общем случае между Iф и концентрацией вещества нет линейной зависимости, что осложняет использование измерения Iф для количественного анализа. Однако при небольших значениях D (D £ 0.01) в формуле (1) выражение в скобке можно разложить в ряд, и, ограничиваясь линейным членом, получаем равенство:

Iф @ 2.3 × I0 × K × jкв. × D = 2.3 × I0 × K × jкв. × e × C × l, (2)

где

e - коэффициент молярной экстинкции люминесцирующего вещества при длине волны возбуждения люминесценции;

С - концентрация люминесцирующего вещества;

l - длина оптического пути возбуждающего света

Таким образом, в определённых пределах оптических плотностей Iф пропорциональна концентрации люминесцирующего вещества (С).

Для определения концентрации вещества по его люминесценции применяют графический метод, основанный на построении калибровочного графика в координатах Iф (C). Для построения калибровочного графика измеряют интенсивность люминесценции серии растворов данного вещества с известной концентрацией. Полученный график должен представлять собой прямую линию, тангенс угла наклона которой равен:

tga = 2.3 × I0 × K × jкв. × e × l

Измерив Iф исследуемого раствора, можно по калибровочному графику определить концентрацию вещества.

Существует несколько факторов, осложняющих точное измерение Iф или её применение для определения концентрации. Главные из них: «паразитный» («рассеянный») свет, экранировка возбуждающего света другими молекулами, реабсорбция исследуемыми молекулами или другими веществами, светорассеяние и неравномерное распределение молекул по объёму, миграция энергии и тушение флуоресценции.

«Паразитный», или «рассеянный» свет, включает в себя излучение источника в спектральной области регистрации флуоресценции, присутствующее в возбуждающем пучке вследствие несовершенства систем его выделения и попадающее на детектор, люминесценцию кюветы и растворителя.

Эффект экранировки возбуждающего света – поглощение части возбуждающего света посторонними молекулами, в результате чего уменьшается количество фотонов, поглощаемых исследуемым веществом, и тем самым снижается Iф.

Если известны значение D исследуемого вещества и общая оптическая плотность (Dоб.) образца при длине волны возбуждения, то регистрируемую величину интенсивности флуоресценции можно поправить на эффект экранировки:

Iф’ = I0 × K × jкв. ×Dоб.) × (D / Dоб.), (3)

где

Iф’ - интенсивность флуоресценции при наличии экранировки.

Поправочный коэффициент, на который требуется умножить регистрируемую интенсивность флуоресценции вещества в смеси, находится из соотношения:

dэ = (Iф / Iф’ ) = – D) / (1 – 10 – Dоб.)) × (Dоб. / D), (4)

Реабсорбция заключается во вторичном поглощении квантов флуоресценции. Это явление может быть обусловлено исследуемыми молекулами (собственная реабсорбция) и в этом случае наблюдается лишь в области перекрывания спектра поглощения со спектром флуоресценции. При наличии собственной реабсорбции коротковолновая часть регистрируемого спектра флуоресценции будет заниженной, и к тому же его максимум окажется сдвинутым в длинноволновую область по сравнению с истинным спектром излучения. В многокомпонентных образцах кванты флуоресценции исследуемого вещества могут поглощаться молекулами других соединений, и это также сопровождается ослаблением свечения. Характер изменений формы спектра флуоресценции, в этом случае, полностью определяется формой спектра поглощения других веществ. Эффект реабсорбции увеличивается с возрастанием оптической плотности образца в области регистрации флуоресценции.

Так же, как и в случае эффекта экранировки, эффект реабсорбции можно учесть. Если известно значение оптической плотности исследуемого вещества при длине волны возбуждения флуоресценции (D) и значение оптической плотности образца при длине волны испускания флуоресценции (Dф), то регистрируемую величину интенсивности флуоресценции можно поправить на эффект реабсорбции:

Iф’’ = I0 × K × jкв. ×– (D + Dф) ) × (D / (D + Dф )), (5)

где

Iф’’ - интенсивность флуоресценции при наличии реабсорбции.

Поправочный коэффициент, на который требуется умножить регистрируемую интенсивность флуоресценции вещества в смеси, находится из соотношения:

dр = (Iф / Iф’’ ) = – D) / (1 – 10 – (D + Dф))) × ((D + Dф ) / D ), (6)

Особенности измерения флуоресценции биологических объектов.

1. Интенсивность люминесценции биологических объектов часто бывает довольно низкой. Это объясняется малой величиной квантовых выходов люминесценции, низкой концентрацией люминесцирующих веществ, экранирующим эффектом других компонентов. Измерение слабой люминесценции осложнено «паразитной» люминесценцией кювет, оптики, примесей и т. д. Для преодоления этих трудностей требуется аппаратура с повышенной чувствительностью, хорошая фокусировка света на образец, правильный выбор условий измерения и тщательный контроль на флуоресценцию кювет и растворителя.

2. При изучении люминесценции исследуемый образец подвергается воздействию интенсивного возбуждающего света, что может приводить к значительным изменениям фотохимически активных веществ в излучающей системе. Чем выше интенсивность возбуждающего света, тем лучше условия для измерения люминесценции, но зато тем сильнее разрушительное действие возбуждающего света. Выход из этого противоречия может быть найден при сочетании нескольких приёмов:

1) уменьшением яркости возбуждающего света на объекте за счёт увеличения площади пятна;

2) повышением чувствительности приёмника света и светосилы прибора;

3) увеличением скорости измерений;

4) понижением температуры.

Объект должен освещаться возбуждающим светом только в самый момент измерения, а в остальное время возбуждающий свет должен быть перекрыт специальной шторкой. В тех случаях, когда измерения люминесценции можно производить в одной точке, открывать возбуждающий свет следует только в момент отсчёта.

3. При измерениях люминесценции всегда приходиться считаться с сильным светорассеянием, свойственным биологическим объектам. Интенсивность возбуждающего света обычно на несколько порядков превышает интенсивность люминесценции, поэтому при сильном светорассеянии измерения люминесценции невозможны, даже если незначительная часть возбуждающего света пропускается в спектральной области люминесценции. Поэтому необходимо производить контроль на рассеянный свет, производя измерения с растворителем или же используя в качестве контроля какой-нибудь сильно рассеивающий, но не люминесцирующий объект (например, окись магния).

Светорассеяние не только затрудняет измерение люминесценции, но и осложняет анализ спектров вследствии увеличения оптического пути света в рассеивающем образце (как возбуждающего, так и света флуоресценции). Это приводит к появлению всех эффектов, характерных для объектов с высокой оптической плотностью: к возрастанию интенсивности люминесценции, к увеличению экранирующего эффекта и к усилению реабсорбции. Основными путями уменьшения нежелательных эффектов могут быть:

1) измерение в тонких слоях и при малых концентрациях;

2) выбор оптимальной области возбуждения;

3) уменьшение светорассеяния.

При замораживании светорассеяние сильно увеличивается. Поэтому при охлаждении образца наблюдается скачкообразное увеличение интенсивности люминесценции при температуре замерзания растворителя. Одновременно усиливается проявление всех других эффектов, связанных со светорассеянием.

4. Неравномерное распределение исследуемых молекул по объёму приводит к уменьшению оптической плотности (эффект «сита»). По этой причине неоднородные объекты флуоресцируют слабее однородных даже при условии одинаковой средней концентрации вещества. Исключить влияние этого эффекта иногда удаётся с помощью соответствующего подбора длин волн возбуждения.

Экспериментальная часть

Цель работы: практическое освоение аппаратуры и методов качественного и количественного флуориметрического анализа биомолекул и их смесей.

Приборы, принадлежности и реактивы

1) Спектрофлуориметр Hitachi MPF-4.

2) Спектрофотометр СФ-46.

3) Кювета для измерения флуоресценции (кварцевая кювета с двумя перпендикулярными прозрачными гранями и длиной оптического пути 1 см), кварцевые кюветы для измерения оптической плотности на спектрофотометре с длиной оптического пути 1 см.

4) Растворы исследуемых веществ.

Задание

1. Качественный флуориметрический анализ.

1. Ознакомиться (с помощью преподавателя) с устройством и принципом работы спектрофлуориметра.

Получить у преподавателя стандартный раствор исследуемого вещества с известной концентрацией (опытный образец) и растворитель (холостой раствор).

3. Измерить на спектрофлуориметре спектр испускания флуоресценции опытного образца.

Для этого на монохроматоре возбуждения флуоресценции выставить длину волны (Excitation wavelength), соответствующую наиболее длинноволновому максимуму в спектре поглощения исследуемого вещества. Установить щель монохроматора возбуждения (Excitation Slit) на значение 5 нм.

На монохроматоре испускания флуоресценции выставить длину волны (Emission wavelength) на 5-10 нм больше, чем выбранная длина волны возбуждения флуоресценции (установленная длина волны должна быть кратна 10). Установить щель монохроматора испускания (Emission Slit) на значение 5 нм.

Установить значение переключателя чувствительности (Sample Sensitivity) в положение «10».

Установить необходимую скорость регистрации спектра (Scan Speed).

Поместить кювету с исследуемым образцом в кюветное отделение прибора.

Открыть шторку прибора (положение «.»).

Замечание. Категорически запрещается открывать кюветное отделение прибора при открытой шторке!

Сканировать монохроматор испускания в диапазоне длин волн от выбранной начальной длины волны испускания до 800 нм.

Закрыть шторку прибора (положение «S»).

4. На полученном спектре найти полосу испускания для которой наблюдается наибольшая интенсивность флуоресценции. Определить в ней значение интенсивности и спектрального положения максимума. Полученное значение интенсивности флуоресценции должно лежать в интервале от 0,3 до 1,0 В по шкале регистрирующего устройства. При значениях, отличающихся от этого диапазона, необходимо подобрать соответствующее положение переключателя Sample Sensitivity и заново отсканировать спектр.

5. Измерить на спектрофлуориметре спектр возбуждения флуоресценции опытного образца.

Для этого на монохроматоре испускания флуоресценции выставить длину волны (Emission wavelength), соответствующую наиболее интенсивному максимуму в спектре испускания флуоресценции исследуемого вещества. Установить щель монохроматора испускания (Emission Slit) на значение 5 нм.

На монохроматоре возбуждения выставить длину волны (Excitation wavelength) 200 нм. Установить щель монохроматора возбуждения (Excitation Slit) на значение 5 нм.

Установить значение переключателя чувствительности (Sample Sensitivity) в положение, подобранное при регистрации спектра испускания.

Установить необходимую скорость регистрации спектра (Scan Speed).

Открыть шторку прибора (положение «.»).

Замечание. Категорически запрещается открывать кюветное отделение прибора при открытой шторке!

Сканировать монохроматор возбуждения от 200 нм до длины волны, которая будет на 10 нм меньше, чем выбранная длина волны испускания флуоресценции.

Закрыть шторку прибора (положение «S»).

Извлечь кювету с опытным образцом из кюветного отделения прибора.

6. Измерить спектры возбуждения и испускания флуоресценции для холостого раствора при тех же условиях, что и опытный раствор.

7. Найти разность значений интенсивности флуоресценции опытного и холостого раствора для спектров возбуждения и испускания флуоресценции исследуемого вещества при каждой длине волны.

8. Нормировать полученные разностные спектры. Для этого необходимо определить в каждом спектре максимальное значение интенсивности флуоресценции. Затем разделить значения интенсивности флуоресценции данного спектра при каждой длине волны на интенсивность его максимального значения.

9. На рисунке 1 построить в одной системе координат нормированные спектры возбуждения и испускания флуоресценции исследуемого вещества. Сделать все необходимые обозначения и подписи.

10. На полученных спектрах определить количество максимумов, интенсивность максимумов, спектральное положение максимумов, полуширину полос флуоресценции, определить «стоксов» сдвиг для исследуемого образца в данном растворителе.

Сформулировать и записать выводы по данному заданию.

2. Исследование спектра испускания флуоресценции при различных длинах волн возбуждения.

Для исследования использовать опытный образец из задания 1. На спектрофлуориметре измерить спектры испускания флуоресценции опытного образца при длинах волн возбуждения, соответствующих максимумам в спектре возбуждения исследуемого соединения (использовать полученные результаты и условия измерения из задания 1). Определить на полученных спектрах интенсивность и длину волны в максимумах полос испускания. Данные занести в таблицу 1.

Таблица 1.

lвозб.	lисп.	Iисп.

Примечание. lвозб — длина волны возбуждения флуоресценции, lисп. , Iисп. - длина волны испускания и интенсивность флуоресценции опытного образца.

Сделать предположение о количестве люминесцирующих компонентов в исследуемом образце. Сформулировать и записать выводы по данному заданию.

3. Количественный флуориметрический анализ.

1. Получить у преподавателя исходный раствор исследуемого вещества с известной концентрацией (маточный раствор), раствор того же вещества с неизвестной концентрацией (задача) и растворитель.

Из маточного раствора и растворителя приготовить серию разведений с концентрациями в диапазоне от исходной до 0,01 мкМ (не менее 9 растворов с разными концентрациями равномерно захватывающими этот диапазон). Используя данные полученные в задании 1, выбрать аналитические длины волн возбуждения и испускания флуоресценции для исследуемого вещества. Длины волн должны быть выбраны таким образом, чтобы они не попадали на область перекрывания этих спектров. Измерить интенсивность флуоресценции приготовленных разведений, задачи и растворителя при фиксированных длинах волн возбуждения и испускания.

Для этого на монохроматоре возбуждения флуоресценции (Excitation wavelength) выставить выбранную аналитическую длину волны возбуждения флуоресценции. Установить щель монохроматора возбуждения (Excitation Slit) на значение 10 нм.

На монохроматоре испускания флуоресценции (Emission wavelength) выставить выбранную аналитическую длину волны испускания флуоресценции. Установить щель монохроматора испускания (Emission Slit) на значение 10 нм.

Установить значение переключателя чувствительности (Sample Sensitivity) в положение «30».

Поместить кювету с исследуемым образцом в кюветное отделение прибора.

Открыть шторку прибора (положение «.»).

Замечание. Категорически запрещается открывать кюветное отделение прибора при открытой шторке!

Регистрировать интенсивность флуоресценции в течение одной минуты.

Закрыть шторку прибора (положение «S»).

На полученной кинетике измерить среднее значение интенсивности флуоресценции образца. Если среднее значение интенсивности флуоресценции получается больше 1 В по шкале регистрирующего устройства, то повторить регистрацию при положении переключателя чувствительности (Sample Sensitivity) равном «3» (уменьшение чувствительности в 10 раз).

Определить среднее значение и стандартное отклонение интенсивности флуоресценции для каждого образца (опытный раствор) и растворителя (холостой раствор). Найти разность значений между каждым опытным и холостым раствором. Данные занести в таблицу 2.

Таблица 2.

С	Iср.	s	I

Примечание. С — концентрация исследуемого вещества, Iср. и s — средняя интенсивность и стандартное отклонение интенсивности флуоресценции образца.

I – разность интенсивностей флуоресценции опытного и холостого раствора.

На рисунке 2 построить зависимость интенсивности флуоресценции (I) от концентрации (C) исследуемого вещества. Около каждой точки указать разброс экспериментальных данных (s ). Сделать все необходимые обозначения и подписи. Найти на графике линейный участок зависимости интенсивности флуоресценции от концентрации. Применить к этому участку метод линейной регрессии. Найти уравнение регрессионной кривой. Используя найденное уравнение, определить неизвестную концентрацию исследуемого вещества (задача). Определить коэффициент чувствительности и порог чувствительности флуориметрического определения данного вещества. Сформулировать и записать выводы по данному заданию.

4. Количественный флуориметрический анализ при наличии эффектов внутреннего фильтра.

Получить у преподавателя раствор исследуемого вещества с неизвестной концентрацией (задача - чистый раствор), смесь исследуемого вещества с примесью (задача — смесь), раствор примеси и растворитель. На спектрофлуориметре измерить интенсивность флуоресценции трёх исследуемых растворов и растворителя при фиксированных длинах волн возбуждения и испускания (использовать длины волн и установки прибора подобранные для данного вещества в задании 3). Данные занести в таблицу 3. На спектрофотометре измерить оптическую плотность чистого раствора и смеси при длинах волн, которые использовались при измерении флуоресценции этих растворов. Данные занести в таблицу 3.

Таблица 3.

Образец	Dвозб.	Dисп.	I
Чистый раствор
Смесь
Примесь

Примечание. Dвозб., Dисп. - оптические плотности при длинах волн возбуждения и испускания флуоресценции. I – разность интенсивностей флуоресценции опытного и холостого раствора.

По формулам (4) и (6) рассчитать поправочные коэффициенты на экранировку и реабсорбцию. Произвести корректировку значений интенсивности флуоресценции смеси с учётом обоих полученных коэффициентов. Определить неизвестную концентрацию исследуемого вещества в чистом растворе и в смеси с учётом поправки (для расчёта использовать калибровочную кривую из задания 3). Сравнить полученные значения. На спектрофотометре измерить спектр поглощения раствора, содержащего примесь относительно растворителя. Измерения провести в диапазоне длин волн от 350 до 650 нм с шагом 10 нм. Нормировать полученный спектр поглощения. Для этого необходимо определить в спектре максимальное значение оптической плотности. Затем при каждой длине волны разделить оптическую плотность на её максимальное значение. На рисунке 3 в одной системе координат построить нормированные спектры возбуждения и испускания флуоресценции исследуемого вещества (использовать данные рисунка 1) и поглощения примеси. Определить диапазоны длин волн при которых наблюдается перекрывание спектров возбуждения и испускания флуоресценции со спектром поглощения примеси. Сделать предположения о влиянии эффектов экранировки и реабсорбции на флуоресценцию исследуемого вещества. Сформулировать и записать выводы по данному заданию.