Структурно-функциональные свойства эритроцитарных мембран при дислипопротеинемиях (стр. 2 )

Определение фракционного и субфракционного составов липопротеинов сыворотки крови было проведено с помощью метода малоуглового рентгеновского рассеяния, предложенного и соавт. [1997]. Нами учитывались концентрации липопротеинов 6 основных подклассов (2 субфракции ЛПВП, 2 субфракции ЛПНП и 2 субфракции ЛПОНП) и величина таких интегральных показателей как общий холестерин и общие триацилглицериды. Также были рассчитаны отношение общих фосфолипидов к общему холестерину и индекс атерогенности. Индекс атерогенности рассчитывался как отношение (ОХС-ХС ЛПВП)/ХС ЛПВП, где ОХС – общий холестерин, а ХС ЛПВП – холестерин липопротеинов высокой плотности. При этом больные с нарушенным липидным обменом были распределены по типу ДЛП по классификации, предложенной D. Fredricson. IIa тип ДЛП регистрировали, если в сыворотке крови значения содержания ХС ЛПНП превышали 175 мг/дл при нормальных величинах концентрации ТГ, IIб тип – если было повышено содержание ХС ЛПНП и ТГ (свыше 175 мг/дл для лиц моложе 40 лет и свыше 210 мг/дл для пациентов 40 лет и старше), IV тип – если значения ХС ЛПНП были в пределах нормы, а концентрация ТГ была повышенной.

Мембраны эритроцитов выделяли путем гипоосмотического гемолиза [Dodge J.T. et al. 1963]. В полученной взвеси мембран определяли микробиуретовым методом содержание белка.

Липиды мембран эритроцитов экстрагировали хлороформ-метаноловой смесью по методу J. Folch et al. [1957]. Общее содержание липидов в мембране эритроцитов определяли методом [1987]. Препаративное разделение общих липидов проводили методом тонкослойной хроматографии [Финдлей Дж. Б., , 1990] в системе растворителей гептан : диэтиловый эфир : этилацетат (в соотношении 80:20:1,5) на пластинках “Sorbfil” (Россия). Разделение фракций фосфолипидов мембран эритроцитов методом тонкослойной хроматографии [, 1982] осуществляли в системе хлороформ : метанол : вода (в соотношении 32:12,5:2) на пластинках “Sorbfil”(Россия). Идентификацию фракций липидов осуществляли с использованием соответствующих стандартов (фирма “Sigma”, США). Количественную оценку хроматограмм проводили с помощью разработанной компьютерной программы.

Характеристика структурных свойств липидной фазы мембран эритроцитов проводилась с использованием измерения собственной флуоресценции теней эритроцитов и определения спектральных характеристик взаимодействия мембран с флуоресцентным зондом пирен на спектрофлуориметре “Hitachi-MPF-4” (Япония). Микровязкостные свойства мембраны в области анулярных и общих липидов оценивали по степени эксимеризации пирена, вычисляя отношение интенсивности флуоресценции эксимеров и мономеров (J470/J370) при длине волны возбуждающего света (lв) 285 и 340 нм, соответственно. Полярность окружения молекул пирена оценивали по отношению J370/J390 при lв=340 нм [, 1989]. Рассчитывали показатель миграции энергии с триптофановых остатков на пирен по формуле, предложенной и [1980].

Определение активности Na+,K+-АТФазы в мембранах эритроцитов определяли методом, разработанным и соавт. [1984] и основанном на накоплении неорганического фосфора (Рi) в среде, содержащей АТФ, в результате его гидролиза под действием АТФазы. Содержание Рi определяли по методу Р.S. Chen et al. [1956].

В рамках диссертационной работы был выполнен экспериментальный блок, связанный с исследованием структурной организации эритроцитарных мембран у крыс в условиях инкубации взвеси теней эритроцитов с липопротеинами основных классов (ЛПНП, ЛПОНП, ЛПВП), а также их апобелками (аполипопротеинами А-I, С и Е) in vitro. Липопротеины выделяли из сыворотки крови крыс с помощью изоплотностного ультрацентрифугирования в растворе KBr [Hatch F.T., Lees R.S., 1968]. Для получения аполипопротеинов проводили делипидирование липопротеинов охлажденной смесью хлороформ-метанол (2:1) с последующей многократной отмывкой эфиром. Фракции, содержащие аполипопротен A-I, С и Е, очищали с помощью ионообменной хроматографии с использованием ионообменника «DEAE-Toyopeare 650 М-TSK» (Япония) [Laemli U.K., 1970]. Инкубацию теней эритроцитов с липопротеинами и их апобелками проводили при 37°С в течение 20 мин с последующим однократным отмыванием и исследованием структурных свойств мембран эритроцитов с помощью флуоресцентного зонда пирен. Параллельно каждой опытной пробе ставилась контрольная проба, содержавшая тени эритроцитов того же животного с инкубационной средой (10 мМ трис-HCl буфер, рН 7.4).

Полученные в ходе исследования данные обрабатывали с использованием методов статистического анализа. Проверка на нормальность распределения была осуществлена с помощью критерия Колмогорова-Смирнова. Для проверки гипотезы о значимости различий законов распределения исследуемых признаков для отдельных групп пациентов был применен критерий Манна-Уитни (U-тест) для несвязанных выборок, для обработки результатов экспериментальных данных – критерий Вилкоксона для попарносвязанных выборок. Для выявления функциональных взаимосвязей между группами изученных параметров использовали вычисление коэффициента ранговой корреляции Спирмена. Распределение общей группы больных по категориям было осуществлено с помощью кластерного анализа методом К-средних.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

На сегодняшний день имеется немало данных, свидетельствующих о том, что зрелые эритроциты обновляют свой липидный состав благодаря взаимодействию с ЛПВП, ЛПНП и ЛПОНП [Quarford S.H., 1970; Faergeman O., Havel R.J., 1975; Poon R., 1981; Hollan S. et al., 1995, 1996; Broncel M. et al., 2005]. Подтверждением наличия обменных процессов между плазменными липопротеинами и мембраной эритроцитов является и установление факта дезорганизации липидного бислоя красных кровяных клеток у больных с дислипопротеинемиями.

Многочисленные данные литературы говорят о широкой распространенности нарушений липидного обмена у больных сахарным диабета как типа 1, так и типа 2, связанных прежде всего с нарушением гормональной регуляции метаболических процессов [Manzato E. et al., 1989; Hanefeld M., 1994; Деменкова, 2001; , , 2001; и соавт., 2003; Vergès B., 2005; Lapolla A. et al., 2006]. Согласно данным наших исследований, у больных СД 1 липопротеиновый спектр сыворотки крови характеризовался повышением концентрации общего ХС, изменением субфракционного состава ЛПВП и повышением индекса атерогенности. При этом выраженность метаболических нарушений у пациентов с СД 1 зависела от длительности диабета, стадии компенсации углеводного обмена и наличия сосудистых осложнений: было отмечено выраженное повышение содержания общего ХС у пациентов с течением заболевания более 5 лет или с сосудистыми осложнениями II и III стадии (рис. 1.). Пациенты с СД 2 характеризовались более выраженными и разнообразными отклонениями показателей липидного обмена: повышение содержания общего холестерина и триацилглицеридов в сыворотке крови наряду со снижением концентрации ХС ЛПВП (табл. 2).

Механизмы развития гиперхолестеринемии, как было указано выше, при сахарном диабете связаны с нарушением гормональной регуляции. При этом инсулярная недостаточность проявляется не только в нарушении углеводного и жирового обмена, но и активацией контринсулярных гормонов. Гипертриглицеридемия сопряжена с повышением содержания ЛПОНП. У пациентов, страдающих СД типа 2, в сыворотке крови было обнаружено увеличение концентрации всех подфракций ЛПОНП (табл. 2). Так, содержание ЛПОНП1 у больных СД 2 превышало соответствующий показатель у здоровых доноров в 1,8 раз (р<0,01), а концентрация ЛПОНП2 был выше в 2,2 раза (р<0,001) (табл. 2).

Как полагают исследователи, повышение образования ЛПОНП в печени происходит благодаря увеличенному поступлению жирных кислот [Cummings M. H., 1995], а также отсутствию ингибирующего влияния инсулина на продукцию и формирование ЛПОНП [Reaven G. M., 1981; Tobey T. A., 1981; Malmström R., 1997]. Кроме того, обсуждается возможность увеличения синтеза жирных кислот в печени de novo [Shimomura I., 2000; Tobe K., 2001].

Таблица 2

Результаты исследования липопротеинового спектра сыворотки

крови у больных сахарным диабетом типа 1 и 2, Me(Q1-Q3)

Показатель	Здоровые доноры	Больные сахарным диабетом типа 1	Больные сахарным диабетом типа 2
ЛПВП, мг/дл	292,98 (246,29-334,75)	236,89 (183,22-305,14) p1>0,05	295,17 (234,25-358,76) p1>0,05; p2>0,05
ЛПВП3, мг/дл	130,68 (62,06-182,31)	91,73 (64,41-135,47) p1>0,05	126,94 (98,30-225,12) p1>0,05; p2<0,05
ЛПВП2, мг/дл	161,86 (123,54-203,81)	111,46 (56,48-148,00) p1<0,05	115,85 (51,56-167,08) p1<0,05; p2>0,05
ЛПНП, мг/дл	457,06 (356,93-513,69)	435,71 (324,62-612,80) p1>0,05	533,31 (428,62-586,60) p1>0,05; p2>0,05
ЛПНП2-3, мг/дл	246,66 (200,16-290,94)	316,76 (210,41-411,35) p1<0,05	328,55 (264,78-364,41) p1<0,05; p2>0,05
ЛППП, мг/дл	214,20 (144,77-241,75)	189,97 (84,98-192,82) p1>0,05	197,51 (98,41-267,76) p1>0,05; p2>0,05
ЛПОНП, мг/дл	53,47 (42,24-115,01)	53,45 (22,62-100,16) p1>0,05	124,85 (67,79-246,87) p1<0,01; p2<0,01
ЛПОНП2, мг/дл	44,39 (26,59-97,23)	47,94 (15,99-84,55) p1>0,05	96,02 (57,09-200,86) p1<0,05; p2<0,001
ЛПОНП1, мг/дл	15,20 (9,56-22,44)	13,35 (6,62-25,50) p1>0,05	27,43 (18,35-36,78) p1<0,05; p2<0,01
Общий холестерин, мг/дл	169,63 (153,95-190,51)	258,06 (193,05-306,42) p1<0,05	303,80 (264,89-353,31) p1<0,001; p2<0,01
Общие триглицериды, мг/дл	150,39 (128,69-170,16)	119,38 (70,90-188,48) p1>0,05	213,67 (166,51-247,55) p1<0,001; p2<0,01
ХС/ФЛ	0,911 (0,882-0,957)	0,960 (0,941-1,027) p1<0,01	0,960 (0,923-1,008) p1<0,01; p2>0,05
ХС ЛПВП, мг/дл	57,87 (48,48-61,73)	43,91 (29,26-56,81) p1<0,05	48,13 (38,68-59,59) p1<0,05; p2>0,05
Индекс атерогенности	1,92 (1,81-2,04)	4,87 (3,39-6,29) p1<0,01	5,37 (3,99-7,61) p1<0,01; p2>0,05
апоЛПВП, мг/дл	143,83 (129,55-179,94)	111,15 (92,15-168,25) p1>0,05	150,46 (131,57-204,20) p1>0,05; p2<0,05
апоЛПНП, мг/дл	77,53 (63,85-96,62)	88,96 (64,14-105,94) p1>0,05	96,42 (77,44-106,97) p1>0,05; p2>0,05
апоЛПОНП, мг/дл	5,51 (3,47-12,37)	3,82 (1,85-10,26) p1>0,05	12,17 (6,49-26,95) p1<0,05; p2<0,01

Примечание. Здесь, и в табл. 3: p1 – уровень значимости различий по сравнению со значениями у здоровых доноров; p2 – уровень значимости различий по сравнению со значениями у пациентов сахарным диабетом типа 1. ЛПНП – липопротеины низкой плотности, ЛПОНП – липопротеины очень низкой плотности, ЛПВП – липопротеины высокой плотности, ХС ЛПВП – холестерин липопротеинов высокой плотности