На правах рукописи

ПУТИ ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ

НАТИВНЫХ И ГЕНЕТИЧЕСКИ МОДИФИЦИРОВАННЫХ МОНОНУКЛЕАРОВ ПУПОВИННОЙ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА

В РЕГЕНЕРИРУЮЩЕЙ ПЕЧЕНИ КРЫС

03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Казань - 2010

Работа выполнена в ГОУ ВПО «Казанский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор,

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

доктор медицинских наук, ассистент

Ведущая организация: Самарский государственный медицинский университет

Защита диссертации состоится «____» _____________________ 2010г.

в «___» часов на заседании диссертационного совета Д 208.034.01 при ГОУ ВПО «Казанский государственный медицинский университет» ( Казань, ул. Бутлерова, 49)

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Казанского государственного медицинского университета ( Казань, корпус Б).

Автореферат разослан «____»____________________2010 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

доктор медицинских наук, профессор

Введение

Актуальность темы

По данным статистики, пять процентов взрослого населения планеты страдает хроническими гепатитами различной этиологии (вирусные, аутоиммунные, метаболические), более половины которых заканчиваются циррозом. В свою очередь цирроз печени занимает первое место среди причин смерти от болезней органов пищеварения. И хотя клетки печени обладают чрезвычайно высоким потенциалом к самообновлению, в случаях, когда пролиферация гепатоцитов подавлена вирусной инфекцией или химическими агентами, а также когда повреждение печени носит хронический характер, т. е. происходит перманентный процесс репаративной регенерации, внутритканевые источники регенерации печени могут быть исчерпаны [Wiemann, 2002]. Единственным эффективным методом лечения цирроза на сегодняшний день является трансплантация печени. Однако доступность донорских органов не соответствует реальной потребности, к тому же существует риск отторжения трансплантированного органа, и неизбежная необходимость пожизненного приёма иммуносупрессивных препаратов.

НЕ нашли? Не то? Что вы ищете?

В качестве альтернативы трансплантации печени могут быть разработаны и внедрены методы регенеративной медицины и, в частности, трансплантация стволовых/прогениторных клеток. Возможность образования гепатоцитов из стволовых клеток костного мозга впервые была показана в работе Петерсена и соавторов еще в 1999 году [Petersen, 1999]. В то же время миграция, хоуминг и возможности дифференцировки клеток пуповинной крови в печени ещё не исследованы в полной мере. Безусловно, именно пуповинная кровь может стать перспективным источником стволовых клеток для трансплантации, так как обладает такими преимуществами, как абсолютно нетравматичный и безопасный как для матери, так и для ребенка способ получения, а также высокая способность клеток к пролиферации и их низкая иммуногенность [Crdoso,1994, Rocha, 2000, Barker, 2001]. Большинство исследований, в которых изучалось участие кроветворных клеток в регенерации печени, было выполнено на моделях токсического повреждения органа, работ же, посвященных участию гемопоэтических стволовых клеток в восстановлении печени после частичной гепатэктомии, практически нет.

Механизм образования гепатоцитов из гемопоэтических стволовых клеток до сих пор является предметом бурного обсуждения. Предполагается, что возможна как прямая дифференцировка стволовых клеток [Terai, 2003, Ishikawa, 2006], так и слияние зрелых клеток миелоидной линии с резидентными гепатоцитами [Vassilopoulos, 2003, Wang, 2003, Alvarez-Dolado, 2003]. В результате слияния образуются гибридные клетки, которые экспрессируют специфические печёночные маркеры, но до конца не ясно, обладают ли они полным спектром функциональной активности гепатоцитов.

В клеточной медицине возможно применение как аллогенных, так и аутологичных клеток для лечения ряда заболеваний печени. Однако существуют болезни печени, например наследственные метаболические нарушения, такие как болезнь Вильсона-Коновалова, наследственные гликогенозы, в отношении которых применение аутологичных стволовых клеток очень ограничено. В таком случае весьма перспективным направлением станет разработка методов генетической модификации стволовых и прогениторных клеток и трансплантация «генетически вылеченных» клеток таким больным. В ходе разработки методов трансплантации генетически модифицированных клеток, необходимо выяснить, влияет ли генетическая модификация на свойства гемопоэтических стволовых клеток и их способность мигрировать в орган-мишень и дифференцироваться в клетки печени.

Цель и задачи исследования

Целью данного исследования стало изучение хоуминга и дифференцировки нативных и генетически модифицированных мононуклеаров пуповинной крови человека при регенерации печени после частичной гепатэктомии у крыс.

В соответствии с этой целью были поставлены следующие конкретные задачи:

1. Изучить активацию стволового компартмента в печени крыс после частичной гепатэктомии и трансплантации им нативных мононуклеаров пуповинной крови человека.

2. Исследовать миграцию и пути дифференцировки нативных мононуклеаров пуповинной крови человека, трансплантированных крысам после частичной гепатэктомии.

3. Изучить возможность миофибропластической трансдифференцировки мононуклеаров пуповинной крови человека, трансплантированных крысам после частичной гепатэктомии.

4. Определить влияние генетической модификации на жизнеспособность клеток пуповинной крови человека и их способность мигрировать в регенерирующую печень крыс после трансплантации.

5. Изучить возможность участия трансплантированных генетически модифицированных мононуклеаров пуповинной крови человека в регенерации печени крыс после частичной гепатэктомии.

6. Выяснить, являются ли трансплантированные нативные и генетически модифицированные мононуклеары пуповинной крови человека функционально активными в печени крыс.

Объект и методы исследования

Эксперименты проведены на 30-ти белых беспородных крысах-самцах, которым провели операцию частичной гепатэктомии по методике Хиггенса и Андерсона [Higgins, 1931]. Для получения результатов исследования были использованы различные экспериментальные подходы. Генетический метод позволил провести генетическую модификацию клеток пуповинной крови человека для трансплантации. Иммуногистохимический подход позволил с помощью специфических маркеров судить о реакции различных клеточных типов печени, об их пролиферации и активации стволовых клеток в ходе регенерации печени крыс после частичной гепатэктомии и трансплантации мононуклеаров пуповинной крови человека. Морфометрический подход позволил количественно оценить число C-kit-позитивных клеток.

Достоверность полученных данных и их научная новизна

Достоверность полученных данных достигнута использованием достаточного и представительного объёма экспериментальных исследований, конкретной постановкой и решением поставленных задач.

Автор видит новизну полученных результатов в том, что впервые:

· показано, что трансплантация мононуклеаров пуповинной крови человека меняет характер активации стволового компартмента в печени: в этом случае не происходит вовлечения в регенерацию синусоидных клеток, необходимых для её паракринной регуляции;

· установлено, что после трансплантации клеток пуповинной крови человека в печени крыс, регенерирующей после частичной гепатэктомии, появляются клетки, несущие антигены человека и имеющие фенотип гепатоцитов, холангиоцитов и синусоидных клеток печени;

· на основе иммуногистохимического анализа получены доказательства того, что трансплантированные мононуклеары пуповинной крови человека не подвергаются трансдифференцировке в миофибробласты в печени крыс;

· показано, что генетическая модификация не влияет на способность мононуклеаров пуповинной крови мигрировать, встраиваться и дифференцироваться в паренхиматозные и непаренхиматозные клеточные типы печени крыс;

· установлено, что трансплантированные нативные и генетически модифицированные клетки пуповинной крови человека являются функционально активными в печени крыс.

Теоретическая и практическая значимость

Результаты работы позволили по-новому оценить и понять закономерности изменения микроструктуры железы в ходе регенерации печени крыс после частичной гепатэктомии и трансплантации мононуклеаров пуповинной крови человека. Проведенные исследования способствовали выявлению новых фактов как о характере, так и о последовательности клеточных реакций, возникающих в ходе регенерации печени после частичной гепатэктомии, и участии в этих процессах гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови человека. Результаты работы изменяют представления о возможной роли трансплантации гемопоэтических стволовых клеток в развитии фиброза печени. Теоретически значимым является установление способности нативных и генетически модифицированных клеток пуповинной крови человека замещать различные клеточные типы в регенерирующей печени крыс. Полученные результаты могут быть использованы для дальнейшего изучения проблемы регенерации печени и участия гемопоэтических стволовых клеток в этом процессе. Результаты проведенных исследований позволяют на основе разработанных методических подходов создать принципиально новую схему клеточной и гено-клеточной терапии наследственных заболеваний, связанных с нарушением экспрессии генов в печени, когда в качестве материала для трансплантации будут использованы не донорские гепатоциты с ограниченным сроком жизни, а аутологичные генетически «вылеченные» стволовые клетки. В ходе выполнения работы разработаны методические подходы для генетической модификации мононуклеаров пуповинной крови.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

1. После частичной гепатэктомии и трансплантации фракции мононуклеаров пуповинной крови человека крысам гепатоциты, синусоидные клетки и холангиоциты экспрессируют антигены человека: антиген главного комплекса гистосовместимости человека – свидетельствующий о миграции и встраивании трансплантированных клеток; специфический антиген гепатоцитов человека и альфа-фетопротеин – свидетельствующие об их функциональной активности.

2. Генетическая модификация мононуклеаров пуповинной крови человека путем электропорации не влияет на их жизнеспособность и потенцию к слиянию или дифференцировке в клетки протоковых структур, синусоидов и паренхимы печени крыс.

Сведения об апробации результатов диссертации

Результаты исследований доложены и обсуждены на ежегодных Всероссийских научно-практических конференциях «Молодые ученые в медицине» (Казань, ), Всероссийской школе-конференции «Аутологичные стволовые и прогениторные клетки: экспериментальные и клинические достижения» (Москва, 2008), 167-м международном симпозиуме Фальк (Mайнц, Германия, 2008), IV Международной Пироговской научной медицинской конференции (Москва, 2009), Всероссийской научной школе-конференции «Аутологичные стволовые клетки: экспериментальные и клинические исследования» (Москва, 2009), Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Актуальные проблемы современной науки и образования» (Уфа, 2010), 45-м Ежегодном собрании Европейской Ассоциации Изучения Печени (EASL) (Вена, Австрия, 2010).

Сведения о публикациях по теме диссертации

По теме диссертации опубликовано 22 научные работы, в том числе три статьи в ведущих научных рецензируемых журналах, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией для опубликования основных результатов диссертаций. Общий объем публикаций – 3,4 условно-печатных листа, в т. ч. авторский вклад –1,7 условно-печатных листа.

Личный вклад соискателя

Приведенные в работе данные получены при личном участии соискателя на всех этапах работы. Соискателем составлен план, поставлены задачи, определены этапы исследования. Автор провел подбор и анализ литературы, определил и применил наиболее адекватные условия проведения эксперимента. Автором проведено 30 операций частичной гепатэктомии на белых беспородных крысах-самцах. Им лично проведены забор материала (регенерирующая печень) и его последующая заливка в парафин, нарезаны парафиновые срезы. В ходе исследования соискатель провел 910 иммуногистохимических окрашиваний срезов, с которых им было получено 1098 фотографии. Теоретическое обобщение материалов исследования, оформление, публикации результатов исследования, формулирование выводов и рекомендаций также проведены лично диссертантом.

Внедрение результатов работы

Протокол электропорации мононуклеаров пуповинной крови человека включен в работу лаборатории Регионального центра коллективного пользования физико-химических исследований веществ и материалов (РЦКП ФХИ) при Казанском (Приволжском) федеральном университете. Результаты проведенного исследования внедрены в работу ГМУ «Республиканская клиническая больница» (г. Казань), а также включен в дополнительную образовательную программу «Молекулярная и клеточная медицина» и в учебный процесс на кафедре нормальной анатомии и кафедре гистологии Казанского государственного медицинского университета.

Структура и объём диссертации

Диссертация состоит из введения, литературного обзора, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 132-х страницах машинописного текста, иллюстрирована 7-ю таблицами, 37-ю рисунками. Список использованных источников включает 246 наименований, из которых 20 отечественных и 226 зарубежных источников.

Объект и методы исследования

Получение мононуклеаров пуповинной крови человека *1

Пуповинная кровь была забрана специально обученным персоналом роддома по инструкции Банка стволовых клеток Казанского медицинского университета (лицензия №1 от 01.01.2001). Сразу после рождения ребенка и отсечения пуповины кровь собирали в стандартную систему для взятия донорской крови. Выделение фракции мононуклеаров из пуповинной крови человека проводили методом седиментации в градиенте плотности фиколла [Hawley, 2004]. Подсчет количества и определение жизнеспособности ядросодержащих клеток осуществляли путем окрашивания трипановым синим. Концентрацию ядросодержащих клеток определяли по формуле (А*250*В/С, где А – число подсчитанных ядросодержащих клеток, В – разведение, С – число подсчитанных квадратов). Процент жизнеспособности рассчитывали как отношение числа жизнеспособных (неокрашенных) клеток к общему количеству ядросодержащих клеток. Во всех полученных образцах количество жизнеспособных клеток было не менее 97%.

Генетическая модификация мононуклеаров пуповинной крови *2

Генетическую модификацию мононуклеаров пуповинной крови человека проводили методом электропорации [Von Levetzow G., 2006]. При пропускании электрического разряда через среду, содержащую смесь клеток и ДНК, происходит образование пор в клеточной стенке и транслокация генетического материала [Shigekawa, 1988]. В качестве трейсерной метки был использован усиленный зеленый флуоресцентный белок - ЕGFP. В работе использовали прибор Gene Pulser Xcell Total System (BioRad, USA) с фирменными кюветами с зазором электродов 0,4 см. Полученные результаты выявили наилучший результат электропорации клеток пуповинной крови человека при вольтаже 300 В, ёмкости 1500 мкФ.

Объект исследования и экспериментальная модель

Исследование проведено на 30-ти белых беспородных крысах-самцах весом 180-220 г, находящихся на стандартном рационе вивария. _________________________________________________________

1* Автор выражает благодарность и , совместно с которыми был выполнен данный фрагмент работы.

2* Автор выражает благодарность , совместно с которым был выполнен данный фрагмент работы.

Протокол исследования с использованием лабораторных животных соответствует требованиям, предъявляемым Республиканским Комитетом по Этическим вопросам при проведении клинических испытаний-исследований лекарственных средств при МЗ РТ (протокол от 21.02.06, № 1 от 01.01.2001).

Операция частичной гепатэктомии проведена по методике, описанной Хиггенсом и Андерсоном (Higgins GM, Anderson RM. 1931). Одной опытной группе (9 крыс) проводили классическую гепатэктомию. Другой опытной группе (9 крыс) после удаления долей печени в селезенку вводили по 3 млн. ядросодержащих клеток пуповинной крови человека в 500 мкл среды RPMI. Третьей группе (9 крыс) после операции частичной гепатэктомии в селезенку вводили по 6х105 ядросодержащих клеток пуповинной крови человека, трансфецированных геном ЕGFP, в 500 мкл среды RPMI. Контрольной группе животных (3 крысы) после операции частичной гепатэктомии в селезенку вводили 500 мкл физиологического раствора. Удаленные во время операции доли печени использовали в качестве контроля. Объем удаленных долей составлял 68% от общей массы печени.

Методы исследования

Животных забивали под эфирным наркозом декапитацией через 2, 5, 7 суток после операции. После забоя извлекали печень для морфологического исследования. Ткань печени фиксировали в формалине и заливали в парафин по стандартной методике. Окрашивание проводили с антителами к рецептору фактора стволовых клеток (С-kit) (клон T595, “Novocastra”, UK), антигену лейкоцитов человека (HLA-ABC) (клон W6/32, Dako, Denmark), a-гладкомышечному актину (a-ГМА) (клон 1A4, DAKO, Denmark), усиленному зеленому флуоресцентному белку (EGFP) (клон GSN24, Sigma, USA), цитокератину 19 (клон BA17, Dako, Denmark), специфическому антигену гепатоцитов человека (HSA) (клон OCH1E5, Novokastra, UK), альфа-фетопротеину (AFP) (клон С3, Dako, Denmark). Также было проведено двойное иммуногистохимическое окрашивание для выявления экспрессии С-kit и десмина (клон D33, DAKO, Denmark), EGFP и цитокератина 19. Далее гистологические срезы изучали под микроскопом (Leica, Германия) с последующим фотографированием.

Также было проведено морфометрическое исследование числа С-kit-позитивных клеток после частичной гепатэктомии и трансплантации клеток пуповинной крови человека и без таковой. Морфометрическое исследование было произведено тремя исследователями с помощью морфометрической окулярной сетки на микроскопе Микмед-5 при увеличении х400.*3

Результаты исследования и их обсуждение

Большинство исследователей регенерации печени считает, что активации стволовых клеток после частичной гепатэктомии не происходит [Michalopoulos, 2007]. Мы проводили исследование срезов печени крыс после классической частичной гепатэктомии на экспрессию рецептора к фактору стволовых клеток C-kit, который считается наиболее удачным маркером для выделения стволовых клеток. Через двое суток после операции в печени мы обнаруживали экспрессию С-kit в синусоидных клетках, которая достигала максимума к пятым суткам и составляла 8-10 клеток в поле зрения. Слабую экспрессию C-kit наблюдали и в гепатоцитах через двое суток, далее число.

C-kit+ клеток увеличивалось вплоть до пятых суток и составляло 4-5 клеток в поле зрения. При этом двойное иммуногистохимическое окрашивание опытных срезов печени антителами к С-kit и десмину показало, что на всех сроках после частичной гепатэктомии экспрессирующие С-kit синусоидные клетки относятся к популяции перисинусоидальных клеток.

В образцах печени крыс после частичной гепатэктомии и трансплантации мононуклеаров пуповинной крови человека С-kit экспрессировался гепатоцитами и мелкими клетками с округлым ядром и узким ободком цитоплазмы уже на ранних экспериментальных сроках. Максимальное

_________________________________________________________

3 * Автор выражает благодарность и , совместно с которыми был выполнен данный фрагмент работы.

количество С-kit-позитивных гепатоцитов наблюдали через 5 суток после операции и составляло 4-5 клеток в поле зрения, на 7 сутки происходило постепенное снижение числа этих клеток. При этом С-kit-позитивных синусоидных клеток на срезах печени крыс после частичной гепатэктомии и трансплантации стволовых клеток пуповинной крови мы практически не наблюдали.

Очевидно, что трансплантация клеток мононуклеарной фракции пуповинной крови после частичной гепатэктомии меняет характер активации стволового компартмента. Можно предложить несколько объяснений этому феномену. Во-первых, возможно, что в случае трансплантации мононуклеаров пуповинной крови человека нет необходимости в паракринных влияниях со стороны перисинусоидальных клеток печени для активации регенераторного ответа гепатоцитов. Достижение печенью массы, необходимой для выполнения ее функции как органа, обеспечивается в этом случае не перисинусоидальными клетками, а стволовыми клетками пуповинной крови человека, трансплантированными крысам. Во-вторых, клетки пуповинной крови человека, мигрировавшие в регенерирующую печень крысы, могут сами дифференцироваться в гепатоциты.

Распределение мононуклеаров пуповинной крови в печени крыс

Для выявления возможности миграции и распределения клеток человека в печени крыс целесообразно использовать маркеры клеток человека, например HLA-ABC, который является антигеном главного комплекса гистосовместимости и широко представлен практически всеми ядросодержащими клетками организма человека. Уже на вторые экспериментальные сутки HLA-ABC присутствовал в синусоидных клетках и гепатоцитах. На пятые сутки нами были обнаружены также небольшие HLA-позитивные клетки, находящиеся в структуре портальных трактов, вблизи желчных протоков. Более того, на 7 сутки HLA-ABC позитивные холангиоциты находились в структуре мелких новообразующихся протоков. Обнаруженные нами клетки, экспрессирующие HLA–ABC и расположенные в синусоидах печени, имели веретенообразную форму и по форме напоминали перисинусоидальные клетки. Ранее было показано образование миофибробластов после трансплантации клеток костного мозга, на основании чего авторами был сделан вывод о том, что такая трансплантация способствует развитию фиброза [Forbes, 2004, Russo, 2006].

Оценка возможности дифференцировки трансплантированных клеток в миофибробласты

Идеальным инструментом для выявления миофибробластов является иммуногистохимическая окраска с антителами к a-гладкомышечному актину (a-ГМА). По результатам нашего исследования экспрессия a-ГМА была обнаружена только в гладкомышечных клетках стенки сосудов на всех экспериментальных сроках. При этом ни на одном исследованном срезе нам не удалось выявить иммуногистохимическую экспрессию a-ГМА в синусоидах печени. Экспрессия a-ГМА не обнаружена также и в портальных трактах. Таким образом, нами не было обнаружено дифференцировки трансплантированных клеток в миофибробласты. А значит результаты, полученные Forbes и Russo –нельзя экстраполировать на все случаи регенерации печени на фоне стволовых/прогениторных клеток.

Генетическая модификация мононуклеаров пуповинной крови

Существующие на сегодняшний день методы генетической модификации эукариотических клеток включают в себя методы вирусной, химической и физической трансфекции. В нашем исследовании мы исключили возможность использования вирусной трансфекции, основными недостатками применения которой является возможность инфицирования [Baum, 1996, Frey, 1998]. Более того, некоторые вирусные векторы не применимы для лечения заболеваний, требующих стабильной интеграции в геном клеток-мишеней, а эффективность других векторов очень низкая [Corrias, 1998].

С целью выявления оптимальных условий для генетической модификации стволовых клеток пуповинной крови нами были оценены следующие методы химической и физической трансфекции: трансфекционные реагенты для липофильной трансфекции Escort V (Sigma) и TransFast (Promega), и физический метод трансфекции – электропорация.

Эффективность трансфекции определяли по экспрессии трэйсерного гена – ЕGFP. Экспрессию выявляли как с помощью проточной цитометрии, так и по подсчету светящихся клеток при флуоресцентной микроскопии мазков клеток. Во всех проведённых методах процент выхода трансфецированных клеток находился в диапазоне от 20 до 30%, и обнаружить какую-либо разницу или преимущества какого-либо из апробированных методов нам не удалось. В то же время, мы считаем, что наиболее приемлемым для дальнейшего использования является метод электропорации. Основным преимуществом электропорации является сведение биологической вредности к минимуму по сравнению с вирус-опосредованной и химической передачей гена, а также стабильность достигнутой трансфекции.

При исследовании экспериментальных образцов печени методом флуоресцентной микроскопии установлено, что трансплантированные в селезенку генетически модифицированные клетки пуповинной крови человека довольно быстро попадают в печень крысы после частичной гепатэктомии. Уже на 2 сутки после операции было выявлено интенсивное свечение зеленого флуоресцирующего протеина в клетках экспериментальных образцов. На всех последующих исследованных сроках, т. е. на 5 и 7 сутки, интенсивность свечения EGFP в печени не исчезала и не снижалась. Для того, что бы уточнить морфологию «зеленых» клеток, обнаруженных при флуоресцентной микроскопии, мы провели иммуногистохимическое окрашивание срезов с антителами к EGFP.

По данным иммуногистохимического окрашивания в печени крыс после частичной гепатэктомии и трансплантации мононуклеаров пуповинной крови человека на всех исследованных сроках были обнаружены ЕGFP+ клетки. На ранних экспериментальных сроках, т. е. на вторые сутки, эти клетки имели фенотип гепатобластов и гепатоцитов и располагались вокруг портальных трактов. В это же время были обнаружены и позитивные синусоидные клетки. Кроме того, на пятые экспериментальные сутки в печени крыс после частичной гепатэктомии и трансплантации генетически модифицированных мононуклеаров пуповинной крови человека появлялись холангиоциты, экспрессирующие ЕGFP. Эти клетки находились в структуре мелких новообразующихся протоков. Полученные результаты распределения генетически модифицированных клеток человека в регенерирующей печени крыс напрямую коррелируют с результатами иммуногистохимической окраски с антителами к HLA-ABC.

Одним из открытых вопросов до сих пор остается вопрос о механизмах восстановления поврежденного органа трансплантированными столовыми клетками: происходит это путем слияния или прямой трансдифференцировки? Обнаруженные нами уже на вторые сутки EGFP+ гепатобласты, находящиеся вокруг портальных трактов и желчных протоков, навели нас на мысль о том, что эти гепатобласты являются промежуточной формой в дифференцировке гепатоцитов и холангиоцитов из гемопоэтических стволовых клеток. На более поздних сроках количество ЕGFP+ гепатобластов уменьшалось, но при этом увеличивается количество клеток с фенотипом гепатоцитов и появлялись ЕGFP+ холангиоциты. При этом результаты иммуногистохимического окрашивания антителами к СК19 выявило не только положительно окрашенные холангиоциты на всех исследованных сроках, но также и мелкие СК19+ клетки с фенотипом гепатобластов. Известно, что зрелые гепатоциты не экспрессируют СК19, но ранее была показана его экспрессия гепатобластами в ходе внутриутробного развития [Киясов, 2007].

Более того, двойное окрашивание с антителами к СК19 и EGFP выявило и холангиоциты, и единичные гепатобласты, экспрессирующие оба этих маркера, что свидетельствует о том, что эти клетки являются потомками трансплантированных гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови человека. По-видимому, обнаруженные нами СК19+/EGFP+ гепатобласты трансдифференцируются в зрелые гепатоциты и холангиоциты и восстанавливают поврежденную структуру печени, повторяя процессы, происходящие в ходе внутриутробного развития печени. В некоторых исследования уже была продемонстрирована дифференцировка клеток костного мозга в гепатоциты через промежуточную форму незрелого гепатобласта [Ishikawa,2006, Terai, 2003].

Полученные нами экспериментальные данные не оставляют сомнений, что генетически модифицированные стволовые клетки пуповинной крови человека, так же как и нативные клетки, мигрируют в печень крысы и дифференцируются в гепатобласты, гепатоциты, синусоидные клетки и холангиоциты. Открытым остается вопрос, являются ли эти клетки функционально активными или они лишь фенотипически подобны тем или иным клеткам печени крыс? Установленная нами экспрессия α-фетопротеина человека (показателя секреторной активности гепатобластов) и специфического антигена гепатоцитов человека в печени крыс обеих экспериментальных групп не только подтверждает их происхождение из трансплантированных клеток пуповинной крови человека, но и говорит о зрелости этих клеток и сохранении их функциональной активности.

Выводы

1. После частичной гепатэктомии и трансплантации мононуклеаров пуповинной крови человека не происходит вовлечения синусоидных клеток печени в активацию регионального стволового компартмента в отличие от такового после классической частичной гепатэктомии.

2. Трансплантированные в селезенку мононуклеары пуповинной крови человека мигрируют в печень крыс после частичной гепатэктомии и приобретают фенотип гепатоцитов, синусоидных клеток и холангиоцитов.

3. В печени крыс после частичной гепатэктомии и трансплантации мононуклеаров пуповинной крови человека не происходит дифференцировки трансплантированных клеток в миофибробласты.

4. Трансфекция не влияет на способность клеток пуповинной крови человека мигрировать в печень крыс после частичной гепатэктомии и дифференцироваться в паренхиматозные и непаренхиматозные клетки печени.

5. Гепатобласты, экспрессирующие маркеры клеток человека в печени крыс после частичной гепатэктомии и трансплантации мононуклеаров пуповинной крови человека, могут быть промежуточной формой дифференцировки трансплантированных клеток в клеточные типы, регенерирующей печени крыс.

6. Гепатобласты и гепатоциты, экспрессирующие маркеры клеток человека в печени крыс после трансплантации как генетически модифицированных, так и нативных клеток, являются функционально активными.

Практические рекомендации

Рекомендовать внедрение в практику генетических лабораторий протокол электропорации мононуклеаров пуповинной крови человека. Рекомендовать проведение дополнительных доклинических испытаний на других моделях регенерации печени с трансплантацией нативных и генетически модифицированных клеток пуповинной крови человека. Для выявления клеток, несущих ген EGFP, кроме иммунофлуоресцентной микроскопии рекомендуется также применение высокочувствительного метода иммуногистохимии с антителами к данному белку.

Список научных работ, опубликованных по теме диссертации

1. Gazizov I. M. Expression of C-kit in liver after partial hepatectomy in rats / Gazizov IM, Kaligin MS, Pevnev GO, Burganova GR, Gumerova AA, Kiassov AP.// Abstracts of International symposium II Falk Gastro-Cоnference, Dresden (Germany), 2007. - С. 14.

2. Гумерова клеток Ито в гистогенезе и регенерации печени/ , , // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия, Том 2, №4. – 2007. - С. 39-46.

3. Андреева модифицированные гемопоэтические стволовые клетки пуповинной крови человека в регенерации печени после частичной гепатэктомии у крыс/ , // Тезисы доклада. Вестник РГМУ. - 2008. - №2(61). - С. 262

4. Экспрессия рецептора фактора стволовых клеток C-kit в регенерирующей печени после частичной гепатэктомии/ , , // Морфологические ведомости. – 2008. - №1-2. - С.23-27.

5. Калигин рецептора фактора стволовых клеток (С-kit) в ходе развития внутренних органов человека/ , , // Морфологические ведомости. – 2008. - №1-2. - С. 63-66.

6. Сравнение эффективности различных методов трансфекции плазмидными векторами стволовых клеток пуповинной крови для клеточной терапии/ , , // Материалы XII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молодые ученые в медицине», Казань. – 2008. – С. 202-203.

7. Андреева эффект трансплантации генетически модифицированных клеток пуповинной крови человека G93A мышам/ , , // Материалы XII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молодые ученые в медицине», Казань. – 2008. – С. 190-191.

8. Rizvanov A. A. Human umbilical cord blood cells transfected with VEGF and L(1)CAM do not differentiate into neurons but transform into vascular endothelial cells and secrete neuro-trophic factors to support neuro-genesis-a novel approach in stem cell therapy/ AA. Rizvanov , A. P. Kiyasov, I. M. Gazizov , T. S. Yilmaz, M.S. Каligin, D. I. Andreeva, A. K., Shafigullina, D. S. Guseva, S. L. Kiselev, A. Palotás, R. R. Islamov// J. Neurochem Int. – 20– С.389-394.

9. Андреева и дифференцировка трансфецированных гемопоэтических клеток пуповинной крови человека в печени крыс/ , , // Материалы Всероссийской конференции с международным участием «Инновационные технологии в трансплантации органов, тканей и клеток», Самара. – 2008. – С.138-140.

10. Роль генетически модифицированных стволовых клеток пуповинной крови человека в регенерации печени на модели частичной гепатэктомии у крыс/ , , // Материалы Всероссийской школы-конференции «Аутологичные стволовые и прогениторные клетки: экспериментальные и клинические достижения», МоскваС. 26.

11. Andreeva D. Can hepatocytes originate from umbilical cord blood stem cells?/ D. Andreeva, T. Ilmaz, A. Gumerova, A. Kiassov // Abstracts of International symposium III Falk Gastro-Cоnference, Mainz, 2008. - С. 2.

12. Gazizov I. M. Perisinusoidal cells expressing stem cell properties after partial hepatectomy in rats/ I. M. Gazizov, M. S. Kaligin, D. I. Andreeva, A. A.Gumerova, A.P. Kiassov // Abstracts of International symposium III Falk Gastro-Cоnference, Mainz, 2008. - С. 35.

13. Киясов или регенеративная медицина в терапии наиболее значимой соматической патологии/ , Д. И. Т. С. Йылмаз, Андреева// Практическая медицина№8 - С.17-22.

14. Андреева трансплантации клеток пуповинной крови человека на активацию стволового компартмента в печени крыс после частичной гепатэктомии./ , , // Материалы XIV Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молодые ученые в медицине», КазаньС. 159-160.

15. Андреева дифференцировки трансфецированных мононуклеаров пуповинной крови человека в печени крыс после частичной гепатэктомии/ , , // Материалы Всероссийской школы-конференции «Аутологичные стволовые и прогениторные клетки: экспериментальные и клинические достижения», Москва. – 2009. - С.11.

16. Газизов стволового компартмента в печени крыс после частичной гепатэктомии и трансплантации клеток пуповинной крови человека// , , // Материалы Всероссийской школы-конференции «Аутологичные стволовые и прогениторные клетки: экспериментальные и клинические достижения», Москва. – 2009. - С.16.

17. Gumerova A. A. Hepatic stellate cell can be livers stem cells and source of hepatocytes regeneration // Gumerova A. A., Kiassov A. P., Titova M. A., Abdulkhakov S. R., Gazizov IM, Каligin M. S, Yilmaz T. S.// Abstracts of 44 Annual Meeting of the European Assoiation for the Study of the Liver, Copenhagen (Denmark). J. Hepatology. – 2009. – С. 307.

18. Andreeva D. I. Differentiation of transfected human umbilical cord blood cells in the regenerating liver of rats / D. I. Andreeva, I. M. Gazizov, M. S. Каligin, T. S. Yilmaz, A. A. Gumerova, A. P. Kiassov, A. A. Rizvanov// Abstracts of 45 Annual Meeting of the European Assoiation for the Study of the Liver, Vienna (Austria). J. Hepatology– С. 353-354.

19. Gazizov I. M. Cord blood mononuclear cells can be a source of hepatocytes and Kupfer cells restoration after partial hepatectomy in rats/ I. M. Gazizov, D. I. Andreeva, A. V. Tabanakova, M. S. Каligin, T. S. Yilmaz, A. A. Gumerova, A. P. Kiassov// Abstracts of 45 Annual Meeting of the European Assoiation for the Study of the Liver, Vienna (Austria). J. Hepatology– С.362.

20. Gumerova A. A. Hepatocytes and hepatic stellate cells have properties of stem/progenitor cells during prenatal development and liver regeneration/ A. A. Gumerova, A. P. Kiassov, М.С. M. S. Каligin, I. M. Gazizov, М.А. Titova, D. I. Andreeva, S. R. Abdulkhakov, T. S. Yilmaz, М.О. Mavlikeev// Abstracts of 45 Annual Meeting of the European Assoiation for the Study of the Liver, Vienna (Austria). J. Hepatology– С.364.

21. Андреева трансфецированных мононуклеаров пуповинной крови человека в эпителиальные клетки регенерирующей печени крыс/ , , // Материалы XV Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молодые ученые в медицине», КазаньС. 266.

22. Андреева дифференцировки мононуклеаров пуповинной крови человека в регенерирующей печени крыс/ , , // Материалы Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Актуальные проблемы современной науки и образования», Уфа. – 2010. – С.483-487.