Вітак Назарій
Київський національний університет імені Тараса Шевченка
(Біологія, фізіологія, біохімія)
Виявлення диференціальної експресії гену CPNE6 у гліобластомі
у порівнянні з нормальним головним мозком.
ВСТУП
Гліобластоми (астроцитоми четвертого ступеня злоякісності) – найбільш небезпечні гліальні пухлини головного мозку. Дуже часто при їх хірургічному видаленні спостерігаються рецидиви – утворення вторинних пухлин. Саме через це постає проблема ранньої діагностики гліобластом. Один зі шляхів розв’язання цієї проблеми – порівняння профілів експресії генів у пухлинній тканині та у нормальній тканині головного мозку і визначення білків, специфічних для пухлини, тобто маркерів, які дозволили б діагностувати гліобластоми та прогнозувати динаміку їх розвитку.
На даний час для дослідження генної експресії широко застосовують метод SAGE – серійний аналіз генної експресії. Суть методу полягає в підрахунку кількості специфічних унікальних послідовностей мРНК – так званих тагів, кожен з яких відповідає одному транскрипту. За результатами досліджень конструюють бібліотеки. Важливим етапом є перевірка експериментальних даних іншим методом – при цьому зростає достовірність отриманої інформації, що дозволяє створити панель маркерів для діагностики гліобластом, в тому числі й для застосування в Україні. Ми проаналізували створені за допомогою методу SAGE бібліотеки з всесвітньої мережі Інтернет та обрали для порівняння експресії ген нейронального копіну 6 (CPNE6), експресія якого знижена у гліобластомах. Продукт гену CPNE6 належить до класу вторинних посередників сигнальної трансдукції в клітині. Для перевірки застосовували метод зворотно-транскрипційної полімеразної ланцюгової реакції (ЗТ-ПЛР). Аналізували матеріал, отриманий при оперативному видаленні гліобластом.
ОСНОВНА ЧАСТИНА
Для проведення роботи було використано зразки гліобластом і зразки тканини, що прилягала до пухлини, але не була зміненою, – ці зразки використовувались в якості нормальної тканини головного мозку (контролю). Матеріал було надано Інститутом нейрохірургії ім. . Після хірургічного видалення тканини піддавались швидкому заморожуванню в рідкому азоті.
З отриманих тканин виділяли тотальну РНК, використовуючи гуанідин-ізоціанатний метод, запропонований Хомчинським (Chomczynski) і Сашші (Sacchi). Для дослідження було взято десять зразків нормального головного мозку (№№ 155, 198, 255, 376, 379, 478, 480, 484, 498, 505) і дванадцять зразків гліобластом (№№ 000, 483, 487, 492, 501, 502, 503, 504, 508, 510, 512). Після виділення тотальної РНК її зберігали при температурі – 70 ºС.
Наступним кроком був синтез одноланцюгової кДНК на основі виділеної РНК. Для синтезу брали 5 мкг РНК. Для аналізу якості синтезу було проведено полімеразну ланцюгову реакцію (ПЛР) із праймерами до гену бета-актину. ПЛР проводилась за таких умов: денатурація 94 ºС, 30 секунд; реасоціація праймерів 56 ºС, 40 секунд; елонгація 72 ºС, 40 секунд. Результати перевіряли методом електрофорезу в 1,3% агарозному гелі.
Як видно з рис. 1, кДНК не синтезувались на РНК із зразків деяких гліобластом (№ 000) і зразків нормального мозку (№ 000), тому в подальшому використовувались дев’ять зразків нормального мозку і одинадцять зразків гліобластом.
Наступним кроком був підбір праймерів для ПЛР гену CPNE6. Їх підбирали відносно послідовності мРНК цих генів з подальшою перевіркою програмою «Oligo-dT». Послідовності праймерів наведені в таблиці 1.
Таблиця 1. Послідовність праймерів гену CPNE6.
Forward | AGT AGA GCG CAC AGA GGT GCT T |
Reverse | CAC TGT CAT AGT CCT GGC AGA T |
Після цього було проведено ПЛР гену CPNE6 за таких умов: денатурація 94 ºС, 30 секунд; реасоціація праймерів 64 ºС, 60 секунд; елонгація 72 ºС, 60 секунд. Для підтвердження було проведено повторну ПЛР за аналогічних умов. Результати було перевірено методом електрофорезу в 1,3% агарозному гелі. Отримані результати наведено на рис. 2.
Рис. 2. ПЛР на матриці кДНК з праймерами до гену CPNE6.
CPNE6 був обраний нами для перевірки як ген, що зменшує свою експресію. Як показали проведені досліди, цей ген дійсно експресується у нормальному головному мозку (у 8 зразках із 9 – 88,9%), а в гліобластомах його експресія відсутня (у 8 зразках із 10 – 80%). Прояв слабких смужок у зразках гліобластом (№№ 000, 487, 492) можна пояснити виходячи із того, що гліобластоми є дифузними пухлинами, і тому дуже часто в тілі пухлини поряд із раковими клітинами присутні і нормальні, причому інколи в досить великій кількості.
Оскільки в сучасних публікаціях доволі мало інформації про роль цього гену у розвитку раку, то можна висунути декілька гіпотез щодо ролі CPNE6 в канцерогенезу.
Гіпотеза 1. Зважаючи на низький рівень експресії у нормальному головному мозку людини і відсутність експресії у гліобластомах можна припустити, що продукт експресії гену CPNE6 – нейрональний копін 6 – є супресором злоякісної трансформації. Для перевірки цієї гіпотези необхідно з'ясувати, який ефект викликає продукт цього гену у трансфікованих клітинних лініях, а також дослідним шляхом визначити, які наслідки викликає блокування експресії цього гену
Гіпотеза 2. Після малігніфікації тканини відбувається зміна експресійного профілю: одні гени збільшують свою експресію, інші – зменшують, інколи до повної відсутності. Отже, можна припустити, що зниження експресії пов'язано із процесами малігніфікації гліальних клітин. Для перевірки цієї гіпотези важливим є з'ясування черговості появи двох подій: а) зниження експресії CPNE6 і б) малігніфікація тканини. Якщо переродження гліальних клітин передує зниженню експресії, то це свідчить про те, що відсутність експресії цього гену є наслідком канцерогенезу.
ВИСНОВКИ
1. Проаналізовано профілі експресії нормальної тканини головного мозку та гліобластоми, визначено гени, що суттєво змінюють свою експресію в пухлині порівняно з нормою, та окреслено спектр потенційних маркерів для діагностики гліобластом.
2. Продемонстровано зниження експресії гену CPNE6 у гліобластомах в порівнянні з нормальним мозком, що свідчить про можливу роль цього гену у процесах розвитку гліобластом, а також про потенційну можливість застосовувати білок-продукт цього гену у складі діагностикуму.
