7.5.3. На втором этапе интерпретации оценивают результаты контроля гибридизации (Кгибр+, Кгибр-):
7.5.3.1. Результат контрольной реакции (Кгибр - отрицательный контроль гибридизации) оценивают как отрицательный, если величина ОП в лунке меньше или равна 0,2.
7.5.3.2. Результат контрольной реакции (Кгибр+ положительный контроль гибридизации) оценивают как положительный, если величина ОП в лунке больше 0,2 и по крайней мере вдвое больше ОП отрицательного контроля гибридизации (п.7.5.3.1.).
7.5.4. На третьем этапе интерпретации оценивают результаты исследования:
7.5.4.1. Если величина ОП в лунке с пробой (опыт) больше 0,2 и как минимум вдвое превышает отрицательный контроль ПЦР (п.7.5.2.1.), то результат исследования можно интерпретировать как положительный в том случае, если при этом величина ОП в лунке с контролем ингибирования пробы больше 0,2 и как минимум вдвое превышает отрицательный контроль ПЦР (п.7.5.2.1.).
7.5.4.2. Если величина ОП в лунке с пробой (опыт) меньше или равна 0,2, то результат исследования можно интерпретировать как отрицательный в том случае, если при этом величина ОП в лунке ингибирования пробы составляет как минимум 50% от величины ОП в лунке с положительным контролем ПЦР (п.7.5.2.2.).
7.5.4.3. Иные результаты исследования (отличные от п. п. 7.5.4.1. и 7.5.4.2.) интерпретации не подлежат. В этом случае необходимо повторить анализ, изменив условия/метод выделения ДНК.
Чувствительность метода идентификации ДНК животного происхождения с помощью набора SureFood® Animal-ID находится в пределах от 0,1% до 0,5% в зависимости от исследуемого сырья согласно инструкции, прилагаемой к набору.
8. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВИДОВОЙ ПРИНАДЛЕЖНОСТИ ВЫДЕЛЕННОЙ ДНК С ПОМОЩЬЮ НАБОРОВ Species Ident RT
8.1. Выделение ДНК.
Основной принцип выделения ДНК заключается в экстрагировании ДНК, присутствующей в образце, а затем одновременной или последующей очистке ДНК от ингибиторов ПЦР.
Выделение/очистку ДНК проводят по ГОСТ Р .
8.2. Подготовка к проведению реакции Real Time ПЦР
1. Непосредственно перед применением размораживают необходимое количество пробирок с готовой реакционной смесью из расчета 2×N+4, где N – количество исследуемых образцов, экстрагированную из исследуемого материала ДНК, а также отрицательные и положительные контрольные образцы, затем перемешивают на аппарате для встряхивания (п.6.1) в течение 3-5 секунд и откручивают для сброса капель.
2. Помещают пробирки с реакционной смесью в штатив. Маркируют пробирки в соответствии с протоколом исследования в верхней части стенки пробирки. Не следует наносить маркировку на крышку пробирок.
3. Вносят последовательно в пробирки по 2 мм³ «ОК», экстракта ДНК каждого из исследуемых образцов и, в последнюю очередь, «ПК» в соответствии с маркировкой. Содержимое пробирок кратковременно перемешивают на аппарате для встряхивания (п.6.1) и центрифугировать 10-30 секунд.
4. Помещают пробирки в амплификатор в соответствии с порядком исследования изложенным в таб. 7.
Таблица 7. Порядок исследования образцов[§§]
№ следования (№ ячейки) | Образцы |
1 | ОК – отрицательный контроль |
2 | ОК – отрицательный контроль |
3 | ПК – положительный контроль |
4 | ПК – положительный контроль |
5 | Исследуемый образец 1 |
6 | Исследуемый образец 1 |
7 | Исследуемый образец 2 |
8 | Исследуемый образец 2 |
… | … |
95 | Исследуемый образец «n» |
96 | Исследуемый образец «n» |
8.3. Проведение реакции Real Time ПЦР
Включают прибор для проведения Real Time ПЦР в соответствии с инструкцией по эксплуатации и задают программу амплификации:
Стадия 1 Reps (Повторов) – 1 95 °С – 5:00 | Стадия 2 Reps (Повторов) – 35 95 °С – 0:20 | 60 °С – 0:40 |
Объем смеси – 30 мм³.
Измерение сигнала – стадия 2, шаг 2.
Параметры детектора: краситель – FAM; гаситель – None.
пассивный свидетель – ROX (для амплификаторов ABI Prism серии 7***).
По окончании программы амплификации отработанные пробирки утилизируют в соответствии с рекомендациями по организации ПЦР лаборатории.
8.4. Интерпретация результатов
1. Реакция на «ПК»: пороговый цикл Ct(FAM) «ПК» должен быть менее 30 циклов. Получение пороговых циклов для «ПК» больше указанных свидетельствует об ухудшении качества реактивов или неправильной подготовке к проведению реакции.
2. Реакция на «ОК»: результат должен быть отрицательным. В случае получения положительной реакции для «ОК» результаты определения образцов считаются недействительными.
Результаты анализа исследуемых образцов применяются для анализа только при выполнении ВСЕХ вышеперечисленных условий для контрольных образцов.
3. Исследуемые образцы: результат считают положительным, если пороговый цикл Ct(FAM) образца не превышает 33 цикла. В случае отсутствия реакции, результат считают отрицательным.
Пример кинетических кривых на рис. 1.
|
Рисунок 1. Кривая флуоресценции накопленных продуктов ПЦР, полученная в ходе ПЦР в реальном времени: 1 – точка начала log-фазы ПЦР и соответствующее ей количество выполненных циклов; 2 – кривая амплификации, свидетельствующая о наличии искомой видоспецифической ДНК. 3 – кривая амплификации, свидетельствующая об отсутствии искомой видоспецифической ДНК. |
При выявлении несоответствия видового состава исследованного продукта заявленному на этикетке, необходимо проведение экспертной оценки факта фальсификации в организациях, уполномоченных на проведение подобных экспертиз.
Чувствительность метода идентификации ДНК животного происхождения с помощью набора Species Ident RT находится в пределах от 0,1% до 0,5% в зависимости от исследуемого сырья согласно инструкции, прилагаемой к набору.
9. ТРЕБОВАНИЯ БИОЛОГИЧЕСКОЙ БЕЗОПАСНОСТИ ПРИ ВЫПОЛНЕНИИ РАБОТ
Требования биологический безопасности определяются в соответствии с МУ 1.3.1888-04 Организация работы при исследованиях методом ПЦР материала, инфицированного патогенными биологическими агентами III-IV групп патогенности.
Пример проведения расчетов при идентификации сырьевого состава мясной продукции методом ПЦР-ИФА с использованием набора SureFood® Animal-ID
Исследовали: 3 пробы пищевой продукции (многокомпонентные мясные изделия);
в пробе №1 – проводится идентификация 1 вида животного (индейки);
в пробе №2 – 2-х видов животных (курицы и утки);
в пробе №3 – 6 видов животных (говядины, свинины, баранины, козлятины, курицы и утки).
1. Амплификация выделенной ДНК методом ПЦР
1.1. Рассчитывали количество реакций:
Количество реакции (N) = 2 ´ 3 проб + 2 контроля ПЦР + 1 = 9
Z3
Z3 = 1, дополнительная реакция для пробы №3, так как по п. 7.4.2.1. настоящих МР для пробы №3 потребовалось 7 лунок.
1.2. В общей пробирке типа Эппендорф вместимостью 0,5 мл готовили ПЦР-смесь «master-mix»: вносили 18´9 = 162 мкл смеси для ПЦР (код G) и 0,1´9 = 0,9 мкл Taq-полимеразы. Перемешивали на аппарате для встряхивания типа «Вортекс». Резервную дозу не готовили, так как общее количество реакции N меньше 10.
1.3. Приготовили 9 пробирок типа Эппендорф для ПЦР вместимость 0,2 мл и разместили их в штативе. В каждую пробирку добавляли 18 мкл ПЦР-смеси «master-mix» из общей пробирки.
1.4. Добавляли в соответствующие пробирки по 2 мкл контрольной ДНК (код D), выделенной ДНК из образцов и раствора без ДНК-мишени (код Е) (см. табл.8).
Таблица 8. Приготовление реакционной смеси.
Реактивы | Контроль ПЦР | Проба №1 | Проба № 2 | Проба № 3 | |||||
Кпцр+ | Кпцр- | ингиб. | опыт | ингиб. | опыт | ингиб. | опыт | опыт (доп.) | |
ПЦР-семсь «master-mix» | 18 | 18 | 18 | 18 | 18 | 18 | 18 | 18 | 18 |
Контрольная ДНК (код D) | 2 | - | 2 | - | 2 | - | 2 | - | - |
ДНК, выделенная из образца | - | - | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 |
Раствор без ДНК (код Е) | - | 2 | - | - | - | - | - | - | - |
Контроль эффективности ПЦР | Контроль контаминации | Контроль ингибирования | ДНК, выделенная из образца | Контроль ингибирования | ДНК, выделенная из образца | Контроль ингибирования | ДНК, выделенная из образца | ДНК, выделенная из образца, дополнительная реакция | |
Номер пробирки | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 |
1.5. Амплификацию проводили согласно условиям, представленным а таблице 4 настоящих МР.
2. Проведение иммуноферментного анализа для детекции продуктов ПЦР
2.1. Подготовка реактивов к проведению детекции продуктов ПЦР.
2.1.1. Рассчитывали количество гибридизационных зондов (табл.9) в зависимости их использования по п.7.4.4.1. настоящих МР:
Таблица 9. Количество гибридизационных зондов, необходимое для проведения исследования
Контроль гибриди-зации | Контроль ПЦР | Проба №1 | Проба №2 | Проба №3 | Всего зонда, мм3 | ||||||||||||
Кгибр+ | Кгибр- | Кпцр+ | Кпцр- | Ингиб. | Опыт 1 | Ингиб. | Опыт 1 | Опыт 2 | Ингиб. | Опыт 1 | Опыт 2 | Опыт 3 | Опыт 4 | Опыт 5 | Опыт 6 | ||
Зонд А (индейка) | 50 мм3 | 50 мм3 | 50 мм3 | 50 мм3 | 200 | ||||||||||||
Зонд А (курица) | 50 мм3 | 50 мм3 | 50 мм3 | 150 | |||||||||||||
Зонд А (утка) | 50 мм3 | 50 мм3 | 100 | ||||||||||||||
Зонд А (говядина) | 50 мм3 | 50 мм3 | 100 | ||||||||||||||
Зонд А (свинина) | 50 мм3 | 50 | |||||||||||||||
Зонд А (баранина) | 50 мм3 | 50 | |||||||||||||||
Зонд А (козлятина) | 50 мм3 | 50 | |||||||||||||||
Зонд В | 50 мм3 | 50 | |||||||||||||||
Зонд С | 50 мм3 | 50 |
2.1.2. Разбавили гибридизационные зонды А, В, С гибридизирующим буфером (код 4) в отношении 1:100 согласно таблице 10.
|
Из за большого объема этот материал размещен на нескольких страницах:
1 2 3 4 5 6 |
