Методические рекомендации по применению набора реагентов для обнаружения ДНК микобактерий туберкулеза (Mycobacterium tuberculosis complex) методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией «АмплиСенс® MTC-FL»

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

по применению набора реагентов

для обнаружения ДНК микобактерий туберкулеза
(Mycobacterium tuberculosis complex) методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией

«АмплиСенс® MTC-FL»

Формат FEP

АмплиСенсÒ

Федеральное бюджетное учреждение науки «Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии», Российская Федерация, город Москва, улица Новогиреевская, дом 3а

ОГЛАВЛЕНИЕ

НАЗНАЧЕНИЕ.. 3

МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ.. 3

ДЕТЕКЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ С ПОМОЩЬЮ ФЛУОРЕСЦЕНТНОГО ПЦР-ДЕТЕКТОРА АLA-1/4 (BioSan, Латвия) С ВЕРСИЕЙ ПРОГРАММНОГО ОБЕСПЕЧЕНИЯ 4.10. 5

ДЕТЕКЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ С ПОМОЩЬЮ ФЛУОРЕСЦЕНТНОГО ПЦР ДЕТЕКТОРА АLА-1/4 (BioSan, Латвия) С ВЕРСИЕЙ ПРОГРАММНОГО ОБЕСПЕЧЕНИЯ 5.1.0 И ВЫШЕ.. 8

ДЕТЕКЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ С ПОМОЩЬЮ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫХ ПЦР ДЕТЕКТОРОВ «ДЖИН» 2-Х КАНАЛЬНОГО (С ВЕРСИЕЙ ПРОГРАММНОГО ОБЕСПЕЧЕНИЯ 3.3I) И «ДЖИН-4» 4-Х КАНАЛЬНОГО (С ВЕРСИЕЙ ПРОГРАММНОГО ОБЕСПЕЧЕНИЯ 4.4I) («ДНК-Технология», Россия) 11

НАЗНАЧЕНИЕ

Методические рекомендации описывают порядок действий при использовании набора реагентов «АмплиСенс® МТС-FL» вариант FEP, предназначенного для обнаружения ДНК микобактерий туберкулеза (МБТ) – Mycobacterium tuberculosis complex (MTC), в разных видах клинического материала, культурах микроорганизмов и объектах окружающей среды методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией совместно с детекторами конечной флуоресценции:

- трехканальным и четырехканальным ALA-1/4 (Biosan, Латвия),

- двухканальным и четырехканальным детектором «Джин» («ДНК-технология», Россия).

Соответствие названий флуорофоров и каналов детекции

Канал для флуорофора	Название канала детекции для разных моделей приборов[1]
канал для флуорофора FAM	FAM/Специфика
канал для флуорофора JOE	HEX/ВК

МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ

ВНИМАНИЕ! В соответствии с Директивой Европейского Союза 67/548/EEC следующие реагенты подлежат маркировке, как содержащие опасные вещества, а также требуют указания факторов риска (R) и мер предосторожности (S):

Наименование реагента	Наименование комплекта, в который входит реагент	Наименование опасного (в соответствии с директивой 67/548/EEC) вещества	Код опасности, перечень факторов риска (R) и мер предосторожности (S) в соответствии с директивой 67/548/EEC	по ГН 2.2.5.1313-03[2]
ПДК макс разовая/ среднесменная (мг/м3)	основная опасность	класс опасности	автоматический контроль над содержанием вещества в воздухе рабочей зоны
Буфер для лизирующего реагента	«ДНК-сорб-С»	Гуанидин хлорид	Harmful[3] R:22-36/38 S:22	Нет данных
Раствор для лизиса	«РИБО-преп»	Гуанидин тиоцианат	Harmful2 R:20/21//53 S:13-61	Нет данных
Лизирующий раствор	«ДНК-сорб-В»
Раствор для отмывки 1	«ДНК-сорб-В», «ДНК-сорб-С»
Раствор для преципитации	«РИБО-преп»	Изопропанол	Highly flammable2 Irritant2 R: S:7-16-24/25-26	50/10	Пары	Класс опас-ности 3	Hе требу-ется
Раствор для отмывки 2	«ДНК-сорб-В», «ДНК-сорб-С»	Этанол	Highly flammable2 R:11 S:7-16	2000/ 1000	Пары	Класс опас-ности 4	не требу-ется
Раствор для отмывки 3	«РИБО-преп»
Раствор для отмывки 4	«РИБО-преп»

Расшифровка обозначений факторов риска (R) и мер предосторожности (S).

R11: легко воспламеняется.

R20/21/22: опасен при проглатывании, контакте с кожей или вдыхании.

R22: опасен при проглатывании.

R32: при контакте с кислотой образует токсичный газ.

R36: раздражает слизистую глаз.

R36/38: оказывает раздражающее действие при попадании в глаза и на кожу.

R52/53: опасен для водных организмов, может вызывать долговременное нежелательное воздействие на водную среду.

R67: пары вещества могут вызывать сонливость и головокружение.

S7: держать емкость плотно закрытой.

S13: держать вдали от пищевых продуктов и напитков, продуктов для животных.

S16: держать вдали от источников огня, не курить.

S22: не вдыхать порошок.

S24/25: избегать контакта с кожей и глазами.

S26: в случае попадания в глаза, немедленно промыть большим количеством воды и обратиться за медицинской помощью.

S61: избегать попадания в окружающую среду.

ВНИМАНИЕ! При работе с легковоспламеняющимися веществами соблюдать правила пожарной безопасности для учреждений здравоохранения ППБО 07-91 от 30.08.91.

ДЕТЕКЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ С ПОМОЩЬЮ ФЛУОРЕСЦЕНТНОГО ПЦР-ДЕТЕКТОРА АLA-1/4 (BioSan, Латвия) С ВЕРСИЕЙ ПРОГРАММНОГО ОБЕСПЕЧЕНИЯ 4.10

Настройка теста

Для детекции и учета результатов используются следующие настройки теста:

- Наименование теста - МТС.

- Канал FAM - ДНК M. tuberculosis complex, канал HEX – ВКО STI-87.

- Пороговые значения для канала FAM должны составлять: нижний порог
п- = 1,8, верхний порог п+ = 2,2; для канала HEX > 2,5.

Настройки теста можно просмотреть и изменить, выбрав опцию Список тестов в главном меню Настройки. После ввода указанных значений, следует нажать кнопку Сохранить.

Проведение детекции

1. Включить прибор и запустить на компьютере, присоединенном к прибору, программное обеспечение ALA_1 (версия 4.1).

2. Выбрать в меню Протокол опцию Создать новый. Выбрать тип ротора (36 х 0,5 или 48 х 0,2). Выбрать в меню тест МТС. Ввести последовательность исследуемых и контрольных образцов, а также образцов Фон в колонке Образец (для обозначения фоновых пробирок в графе Образец используется сочетание клавиш Ctrl + F). Закрыть окно редактирования протокола детекции.

3. Поставить пробирки в ячейки предварительно снятого ротора прибора АLА-1/4 согласно заданной последовательности, установить ротор в модуль прибора, закрепить его фиксатором и закрыть крышку. Запустить измерение, нажав на значок детекции (вверху экрана) или выбрав в меню Протокол опцию Детекция. По окончании детекции на экран будет выведена таблица результатов. По окончании детекции сохранить полученные данные.

Примечание - Если в одном протоколе проводится детекция более 36 образцов, то после окончания детекции партии изобразцов необходимо извлечь ротор, поместить в него следующую группу образцов, поставить ротор в прибор и для продолжения детекции нажать кнопку Продолжить в окне программы.

Обработка и анализ данных

Интерпретация результатов

Полученные данные интерпретируются автоматически с помощью программного обеспечения ПО 4.1. Результаты в таблице представляются с помощью следующих обозначений:

Первый столбец (канал 1, FAM):

- для образцов, в которых значение сигнала > 2,2 в графе 1 таблицы результатов указывается МТС – обнаружено (на лиловом фоне);

- для образцов, в которых значение сигнала < 2,2 в графе 1 таблицы результатов, указывается МТС – не обнаружено (на голубом фоне);

- для образцов, в которых значение сигнала > 1,8, но < 2,2 в графе 1 таблицы результатов, указывается МТС–нд (на коричневом фоне).

Второй столбец (канал 2, HEX):

- для образцов, в которых значение сигнала > 2,5 в графе 2 таблицы результатов, указывается ВКО +;

- для образцов, в которых значение сигнала < 2,5 в графе 2 таблицы результатов, указывается ВКО –.

Учет результатов

Учет результатов в контрольных образцах:

Результат считается достоверным только при соответствии значений положительного и отрицательных контролей амплификации и выделения ДНК приведенным в табл. 1.

Таблица 1

Результаты постановки контролей различных этапов ПЦР-анализа

Контроль	Контролируемый этап ПЦР-анализа	Результат автоматической интерпретации
ОК	Выделение ДНК, ПЦР	МТС – не обнаружено (FAM) ВКО + (HEX)
К+	ПЦР	МТС – обнаружено (FAM) ВКО + (HEX)
К-	ПЦР	МТС – не обнаружено (FAM) ВКО – (HEX)

Интерпретация результатов клинических образцов

FAM	HEX	Валидность результата	Форма выдачи ответа
МТС – обнаружено	ВКО +/ ВКО –	валидный	M.tuberculosis complex обнаружена
МТС – не обнаружено	ВКО +	валидный	M.tuberculosis complex не обнаружена
МТС – не обнаружено / МТС–нд	ВКО –	невалидный	не валидный
МТС–нд	ВКО –	невалидный	сомнительный, рекомендуется перезабор материала

В случае получения:

- значений МТС – обнаружено по каналу FAM и ВКО + или ВКО – по каналу HEX - результат валидный - M. tuberculosis complex обнаружена.

- значений МТС – не обнаружено по каналу FAM и ВКО + по каналу HEX - результат валидный - M. tuberculosis complex не обнаружена.

- результатов МТС – не обнаружено или МТС–нд по каналу FAM и ВКО – по каналу HEX свидетельствует о невалидном результате. Требуется переамплификация образца, в случае повторного получения аналогичного результата, необходимо повторить анализ образца, начиная с этапа экстракции ДНК. Если валидный результат не получен, то образец обозначается как невалидный и рекомендуется повторное взятие материала.

- Результата МТС–нд по каналу FAM и ВКО + - по каналу HEX - результат невалидный. Требуется переамплификация образца, в случае повторного получения аналогичного результата, необходимо повторить анализ образца, начиная с этапа выделения. Если валидный результат не получен, то образец интерпретируется как сомнительный и рекомендуется повторное взятие материала.

Пример полученных результатов на приборе ALA-1/4, версия ПО 4.1.

Образец №1, содержит ДНК МТС, образец №2 не содержит ДНК МТС, образец №3 требует перестановки.

ДЕТЕКЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ С ПОМОЩЬЮ ФЛУОРЕСЦЕНТНОГО ПЦР ДЕТЕКТОРА АLА-1/4 (BioSan, Латвия) С ВЕРСИЕЙ ПРОГРАММНОГО ОБЕСПЕЧЕНИЯ 5.1.0 И ВЫШЕ

Настройка теста

Для детекции и учета результатов используются следующие настройки теста:

- Наименование теста - МТС,

- Канал FAM - ДНК M. tuberculosis complex, канал HEX – ВКО STI-87.

- Пороговые значения для канала FAM должны составлять: нижний порог
п- = 1,8, верхний порог п+ = 2,2; для канала HEX > 2,5.

Настройки теста можно просмотреть и изменить, выбрав опцию Список тестов в главном меню Настройки. После ввода указанных значений, следует нажать кнопку Сохранить.

Проведение детекции

1. Включить прибор и запустить программу ALA_1 на компьютере, присоединенном к прибору.

2. Тест для обнаружения Mycobacterium tuberculosis complex может быть предустановлен в программе АLА_1 если используется версия программы v.5.1.0 и выше.

3. Проверить наличие теста МТС в списке настроенных тестов программы АLА_1. Для этого выбрать в основном меню программы Настройки → Настройка тестов. В появившемся окне Окно настройки тестов в таблице список тестов найти тест МТС.

4. Если тест МТС не был предустановлен в программе АLА_1, то для проведения детекции и учета результатов необходимо создать новый тест или импортировать его через архивный файл в список тестов, используемых на программе ALA_1.

ВНИМАНИЕ! Импорт или создание новых тестов в программе ALA_1 возможно только для пользователей с правами администратора.

Вариант 1. Импортировать новый тест. Импорт новых тестов в программе ALA_1 осуществляется через выбор основного меню Настройки → Импорт тестов. Далее выбрать архивный файл в формате *.zip и импортировать его в программу.

Вариант 2. Создать новый тест.

- Выбрать в основном меню программы Настройки → Настройка тестов. В появившемся окне Окно настройки тестов добавить название нового теста МТС кнопкой Добавить в таблице Список тестов.

- В поле Каналы для данной реакционной смеси и их обозначения задать каналы детекции: FAM и HEX. Для этого в таблице Список каналов выбрать канал FAM и нажать стрелку Добавить. Выбранный канал появится в таблице Каналы и обозначения, под таблицей в поле Обозначения задать обозначения по этому каналу МТС, в поле пороги для «+» и «-» задать «2,2» и «1,8» соответственно. Далее для канала HEX («ВКО») установить значение порога >2,5. Далее в поле Введите/измените тип теста выбрать тип теста Общий.

- Отметить контроли, использующиеся в этом тесте: ОК (отрицательный контроль выделения), К+ (положительный контроль амплификации), К– (отрицательный контроль амплификации). Выбрать алгоритмы интерпретации для контролей по умолчанию.

- В поле Таблица интерпретации результатов нажать кнопку Создать. Программой ALA_1 будет автоматически создана таблица возможных вариантов сочетаний результатов детекции для всех каналов и итоговый результат для каждого из этих вариантов. Продолжением этой таблицы являются возможные варианты сочетаний результатов контролей. Результаты детекции клинических образцов и контролей будут выдаваться после измерения в соответствии с этой таблицей. Сохранение теста и закрытие окна осуществляется кнопкой ОК.

5. Создать протокол измерения.

- В основном окне программы нажать кнопку Новый протокол. В появившемся окне Окно настройки протокола выбрать тест МТС из списка доступных тестов и нажать стрелку Добавить. Выбранный тест появится в списке Тесты протокола.

- В поле Количество образцов задать количество исследуемых образцов без контрольных образцов и образцов Фон, нажать кнопку Добавить. В поле Количество фоновых пробирок выбрать их необходимое количество.

- В Таблице имён образцов, фоновых пробирок и контролей задать имена образцов, добавить необходимое количество контролей. В поле Тип ротора выбрать ротор, который будет использоваться в данном протоколе. Сохранение протокола и закрытие окна осуществляется кнопкой ОК.

6. Поставить пробирки в ячейки модуля прибора АLА-1/4 в соответствии с заданной последовательностью. Запустить измерение, нажав на кнопку Измерить в панели активных кнопок (вверху экрана). Результат измерения выдаётся программой после завершения измерения протокола в окне Окно результатов.

Обработка и анализ данных

Интерпретация результатов

Полученные данные интерпретируются программой ALA_1 с версией программного обеспечения 5.1.0 и выше автоматически.

Учет результатов

Результат считается достоверным только при соответствии значений положительных и отрицательных контролей амплификации и выделения ДНК приведенным в табл. 2.

Таблица 2

Результаты постановки контролей различных этапов ПЦР-исследования

Контроль	Контролируемый этап ПЦР-исследования	Результат, отображаемый прибором
ОК	Выделение ДНК	Не обнаружено
К+	ПЦР	ОБНАРУЖЕНО (МТС)
К–	ПЦР	Невалидный

Интерпретация результатов клинических образцов

В случае получения:

- значения ОБНАРУЖЕНО (МТС) - результат валидный - M. tuberculosis complex обнаружена.

- значения Не обнаружено - результат валидный - M. tuberculosis complex не обнаружена.

- значения Невалидный свидетельствует о невалидном результате. Требуется переамплификация образца, в случае повторного получения аналогичного результата, необходимо повторить анализ образца, начиная с этапа экстракции ДНК. Если валидный результат не получен, то образец обозначается как невалидный и рекомендуется повторное взятие материала.

- значения Сомнительный - результат невалидный. Требуется переамплификация образца, в случае повторного получения аналогичного результата, необходимо повторить анализ образца, начиная с этапа экстракции ДНК. Если валидный результат не получен, то образец интерпретируется как сомнительный и рекомендуется повторное взятие материала.

Пример полученных результатов на приборе ALA-1/4, версия ПО 5.1.0

Образец №1, содержит ДНК МТС, образец №2 не содержит ДНК МТС, образец №3 требует перестановки.

ДЕТЕКЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ С ПОМОЩЬЮ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫХ ПЦР ДЕТЕКТОРОВ «ДЖИН» 2-Х КАНАЛЬНОГО (С ВЕРСИЕЙ ПРОГРАММНОГО ОБЕСПЕЧЕНИЯ 3.3I) И «ДЖИН-4» 4-Х КАНАЛЬНОГО (С ВЕРСИЕЙ ПРОГРАММНОГО ОБЕСПЕЧЕНИЯ 4.4I) («ДНК-Технология», Россия)

Настройка теста

Для детекции и учета результатов используются следующие настройки теста:

- Наименование теста - «МТС»

- Канал Fam - ДНК M. tuberculosis complex, канал Hex – ВКО STI-87.

- Пороговые значения для канала Fam должны составлять нижний порог
«п-» = 1,9, верхний порог «п+» = 2,1, для канала Hex > 2,5.

Настройки теста можно просмотреть, выбрав в меню «Настройки» опцию «Список тестов». Если значения изменены, требуется восстановить начальные значения, указанные выше, и сохранить изменения при выходе из программы.

Проведение детекции

1. Включить прибор и запустить программное обеспечение.

2. Задать протокол измерения. Ввести количество измеряемых образцов (включая образцы «Фон»), выбрать тест МТС в списке опции Тест, нажать OK, и ввести названия детектируемых образцов (в колонке Образец).

3. Для контрольных образцов «Фон» использовать обозначение ФОН.

4. Поставить пробирки в ячейки модуля прибора «Джин» или «Джин-4» согласно заданной последовательности (по 12 образцов на каждый цикл детекции), закрыть крышку прибора. Запустить измерение, нажав на значок (вверху экрана). По окончании измерения вынуть пробирки и нажать OK.

Обработка и анализ данных

Интерпретация результатов

Полученные данные интерпретируются автоматически с помощью программного обеспечения прибора. Результаты в таблице представляются с помощью следующих обозначений для программного обеспечения ПО 3.3i/ ПО 4.4i соответственно:

- для образцов, в которых значение сигнала > 2,1 в столбце Специфика/Fam и > 2,5 в столбце ВК/Hex таблицы результатов, указывается «+» (на красном фоне);

- для образцов, в которых значение сигнала < 1,9 в столбце Специфика/Fam и > 2,5 в столбце ВК/Hex таблицы результатов, указывается «–» (на зеленом фоне);

- для образцов, в которых значение сигнала < 1,9 или > 1,9, но < 2,1 в столбце Специфика/Fam и < 2,5 в столбце ВК/Hex таблицы результатов, указывается «нд» (на оранжевом фоне).

Учет результатов

Результат считается достоверным только при соответствии значений положительного и отрицательных контролей амплификации и выделения ДНК приведенным в табл. 3.

Таблица 3

Результаты постановки контролей различных этапов ПЦР-исследования

Контроль	Контролируемый этап ПЦР-иследования	Результат, отображаемый прибором
ОК	Выделение ДНК, ПЦР	«-»
К+	ПЦР	«+»
К–	ПЦР	«нд»

Интерпретация результатов клинических образцов

Fam	Hex	Валидность результата	Форма выдачи ответа
+	+/-	валидный	M.tuberculosis complex обнаружена
-	+	валидный	M.tuberculosis complex не обнаружена
-/нд	-	невалидный	не валидный
нд	+	невалидный	сомнительный, рекомендуется перезабор материала

В случае получения:

- результата «+» - результат валидный - M. tuberculosis complex обнаружена.

- результата «-» - результат валидный - M. tuberculosis complex не обнаружена.

- результата «нд» - результат невалидный. Требуется переамплификация образца, в случае повторного получения аналогичного результата, необходимо повторить анализ образца, начиная с этапа экстракции ДНК. Если валидный результат не получен, то образец обозначается как невалидный и рекомендуется повторное взятие материала.

Пример полученных результатов на приборе «Джин-4», версия 3.3i

Пример полученных результатов на приборе «Джин-4», версия 4.4i

Образец №1, содержит ДНК МТС, образец №2 не содержит ДНК МТС, образец №3 требует перестановки.

Лист вносимых изменений

Редакция	Место внесения изменений	Суть вносимых изменений
18.08.10	По тексту	Исправлены стилистические ошибки
24.10.11 VV	По тексту	Исправления по шаблону
Добавлен раздел «Меры предосторожности», включающий таблицу реагентов, подлежащих маркировке как содержащие опасные вещества
27.02.12 IvI	Нижний колонтитул	«Кат. №» и «дата изменения» заменены на соответствующие символы
07.06.12 ВО	Титульная страница	Добавлен знак IVD, знак и адрес производителя
Нижний колонтитул	Вариант FEP заменено на Формат FEP
15.08.12 IvI	Титульная страница	Добавлены подпись и печать директора ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии
31.07.13 РЕ	Назначение	Добавлена таблица «Соответствие названий флуорофоров и каналов детекции»
По тексту	Названия каналов детекции приведены в соответствие с протоколом № 20 от 26.02.13

[1] Название каналов детекции для соответствующего детектора см. в соответствующем разделе методических рекомендаций к набору реагентов.

[2] Данные ГН 2.2.5.1313-03 «Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны». Класс опасности по ГОСТ 12.1.007-76. ССБТ. «Вредные вещества. Классификация. Общие требования безопасности».

[3] Использованы данные о коде опасности, факторах риска (R) и мерах предосторожности (S) фирмы Sigma-Aldrich (harmful - вредный для здоровья, highly flammable – легковоспламеняющийся, irritant - вызывающий раздражение).