Предназначение

Партнерка на США и Канаду по недвижимости, выплаты в крипто

30% recurring commission
Выплаты в USDT
Вывод каждую неделю
Комиссия до 5 лет за каждого referral

Предназначение

ИФА набор АКТГ предназначен для количественного определения АКТГ (Адренокортикотропного гормона) в плазме человека. Для диагностики in vitro.

ПРИНЦИП АНАЛИЗА

Подпись: DRG Intl ACTH ELISA [твердофазный иммуноферментный анализ] для измерения биологически активного АКТГ ( 39 амонокислотной цепи). Овечье поликлональное антитело к АКТГ человека, очищенное методом аффинной хроматографии, и мышиное моноклональное антитело к АКТГ человека являются специфичными к хорошо определяемым участкам молекулы АКТГ. Одно антитело связывается только с С – концевой частью АКТГ 34-39, оно биотинировано. Другое антитело связывается только со средними участками и N- концевой частью ACTH 1-24, оно имеет метку пероксидазы хрена для обнаружения.

В ходе анализа калибраторы, контроли и образцы пациента одновременно инкубируются с антителом с ферментной меткой и биотинированным антителом в лунках покрытых стрептавидином. После инкубации микролунки промываются для удаления несвязанных компонентов и фермент связанный с твердой фазой инкубируется с субстратом ТМБ (tetramethylbenzidine). Реакция останавливается добавлением стоп-раствора на основе кислоты и окраска содержимого лунок меняется. Интенсивность желтого окрашивания прямо пропорциональна концентрации АКТГ в образце. Строится кривая зависимости концентрации от единиц абсорбции по результатам, полученным при измерении калибраторов. Концентрации исходного АКТГ контролей и образцов пациентов определяются по этой кривой.

КОМПОНЕНТЫ

кат.№	Компонент набора	Описание	Кол-во
30 -1801	Реагент 1	биотинированное антитело к АКТГ (аффинной очистки овечьи антитела к АКТГ)	1х 2,5мл
30-1802	реагент 2	антитела к АКТГ с меткой пероксидазы хрена (мышиные моноклональные антитела к АКТГ)	1х2,5мл
30-1613	реагент А	промывочный концентрат (солевой раствор с ПАВ)	1х30мл
30-1601	микропланшета	один держатель со стрипами, покрытыми стрептавидином	12 стрипов по 8 лунок
30-1803 30-1804 30-1805 30-1806 30-1807 30-1808	калибраторы A B C D E F	лиофилизированный (кроме нулевого калибратора) синтетический h-АКТГ. Нулевой калибратор (БСА/раствор лошадиной сыворотки) в жидкой форме, готов к использованию. Все другие калибраторы состоят из синтетического АКТГ (1-39) в растворе БСА/лошадиной сыворотки *Прим.: точные концентрации указаны на этикетках флаконов*	1х4 мл (нулевой) 1х2мл остальные
30-1809 30-1810	контроли 1 & 2	лиофилизированные. 2 уровня. Синтетический h-АКТГ (1-39) в растворе БСА/лошадиной сыворотки *Прим.: точный диапазон указан на этикетках флаконов*	1 х 2мл на уровень

Дополнительно требуемые компоненты:

НЕ нашли? Не то? Что вы ищете?

• микропланшетный ридер.

• автомат для промывки лунок [если нет в наличии, приемлема промывка вручную)

• прецизионные пипетки на 25, 100 и 150 µL.

• (опционно): многоканальная пипетка на 50, 100 и 150 µL.

Предупреждения и меры предосторожности для пользователей:

Реагенты набора не содержат компонентов человеческой крови. С образцами пациентов, которые могут иметь положительную реакцию на поверхностный антиген гепатита В, HBcAg или антитела к ВИЧ, необходимо обращаться как с потенциально биологически опасными. Необходимо соблюдать обычные меры предосторожности при работе с нетестированными образцами.

Стоп-раствор состоит из 1N серной кислоты. Это сильная кислота. Обращаться с осторожностью во избежание ожогов (использовать перчатки и защиту для глаз). В случае разливания немедленно смыть большим количеством воды. Не вдыхать испарения!

Забор и хранение проб.

Определение АКТГ должно выполняться с использованием EDTA плазмы. Для парного исследования проб требуется 400 мкл ЕDTA плазмы. Отобрать цельную кровь в лавандовую (ЭДТА) трубку. Необходимо надлежащим образом отделить плазму, предпочтительно в охлаждаемой центрифуге. Хранить при -20°C или ниже. Образцы сыворотки могут храниться до 8 часов при 2-8°C. Образцы плазмы EDTA ( -20°C) стабильны до 4 мес.

Подготовка реагентов и их хранение.

1. Хранить все компоненты набора при 2-8°C за исключением концентрата для промывки и стоп-раствора после получения перед использованием.

Все реагенты кроме не-нулевых калибраторов, контроли и промывочный концентрат готовы к использованию.

Хранить все реагенты при 2-8°C, кроме промывочного концентрата, который нужно хранить при комнатной температуре до разведения во избежание появления осадка.

2. Для каждого не-нулевого калибратора (калибраторы B-F) и контролей 1 и 2, восстановить каждый флакон, добавив 2 мл дистиллированной и деионизированной воды и смешать. Дать отстояться 10 минут, затем тщательно перемешать до полного восстановления. Использовать калибраторы и контроли немедленно после восстановления. Оставшиеся калибраторы и контроли заморозить (-20oC) как можно скорее после использования. Стандарты и контроли стабильны при -20°C 6

недель после восстановления. Допускается до 3 размораживаний при условии обращения с реагентами согласно инструкций в п. «Замечания по проведению анализа».

3. Реагент A: промывочный концентрат: тщательно перемешать содержимое флакона. При наличии осадка в промывочном концентрате вследствие длительного хранения при низкой температуре, напр. 4°C, растворить осадок на водяной бане при температуре 37°C или в сушильном шкафу при постоянном помешивании. Добавить в промывочный концентрат (30 млмл дистиллированной или деионизированной воды и перемешать. Разведенный рабочий промывочный раствор стабилен 90 дней при комнатной температуре.

Процедура анализа.

1. Поместить в держатель количество лунок со стрептавидином необходимое для использования всех (6) АКТГ калибраторов, A – F калибраторов АКТГ [точные концентрации указаны на этикетке флакона], контрольных плазм, образцов пациентов.

2. Раскапать 200 мкл проб в помеченные лунки. Заморозить (-20oC) оставшиеся калибраторы и контроли как можно скорее после использования.

3. Добавить 25 мкл реагента 1 (биотинированное антитело) в каждую лунку с пробой.

4. Добавить 25 мкл реагента 2 (антитело с ферментной меткой) в те же лунки. Накрыть планшету алюминиевой фольгой или поддоном, чтобы предотвратить попадание света, поместить в орбитальный шейкер (170 +10 об/мин) на 4 часа + 30 минут при комнатной температуре(22°-28°C).

5. Сначала аспирировать жидкость, затем промыть каждую лунку 5 раз рабочим промывочным раствором (приготовленным из реагента А), используя автомат для промывки лунок. Удалить остатки влаги, положив планшету на впитывающий материал. Объем промывочного раствора должен быть достаточным для использования 0.35 мл на каждую лунку.

6. Добавить 150 мкл реагента B (TMB субстрата) в каждую лунку.

7. Избегая попадания света, поместить планшеты в орбитальный шейкер при 170 + 10 об/мин на 30 +5 минут при комнатной температуре. (22°-28°C).

8. Добавить 100 мкл стоп-раствора в каждую лунку. Осторожно перемешать.

9. Считать абсорбцию раствора в лунках в течение 10 минут, с помощью микропланшетного ридера, установленного на 450 нм против 250 мкл дистиллированной или деионизированной воды. Считывать лунки снова при 405 нм против дистиллированной или деионизированной воды.

Примечание: второе считывание рассчитано на то, чтобы расширить калибровочную кривую до значения максимального калибратора, прибл. 500pg/mL. Следовательно, значения образцов пациентов с АКТГ > 150 pg/mL могут быть определены по калибровочной кривой построенной по результатам считываний вплоть до концентрации эквивалентной максимальному калибратору при считывании на 405 нм, без учета длины волны максимальной абсорбции.

Пробы и контроли необходимо считывать при 450 нм для концентраций АКТГ до 150 pg/mL. Концентрации АКТГ выше 150 pg/mL должны интерполироваться при считывании на 405 нм.

10. Используя итоговые значения абсорбции, полученные на предыдущем этапе, построить калибровочную кривую по способу кубического сплайна -, 4- параметровой логистики, или поточечной интерполяции для вычисления концентрации АКТГ.

Замечания по проведению анализа.

• АКТГ 1-39 - крайне нестабильная молекула. Проводить исследование необходимо сразу после восстановления или оттаивания всех калибраторов, контролей, и образцов пациентов.

• Все калибраторы, контроли и образцы пациентов рекомендуется исследовать попарно. Для редакции данных и подсчета результатов используется среднее значение абсорбции.

• Образцы необходимо пипетировать в лунки не допуская появления пузырьков воздуха. Для этого

нужно использовать «обратную пипетку» согласно инструкции производителя пипеток.

• Образцы пациентов со значениями, превышающими максимальный калибратор (F), прибл. 500 pg/mL (точная концентрация указана на этикетке флакона), могут быть разведены калибратором А (нулевым) и исследованы повторно. Результат умножить на коэффициент разведения.

• Недопустимо использование реагентов из разных лотов.

• При необходимости смешайте равные объемы, достаточные для проведения исследования, реагентов 1 (биотинированное антитело) и 2 (антитело с ферментной меткой) в чистом желтом флаконе, затем добавить 50 µL смешанных антител в каждую лунку. Эти действия заменяют этап (3) и (4), затем следует инкубация в орбитальном шейкере.

График последовательности операций при проведении исследования

Подсчет результатов

Метод «Вручную»

1. По результатам считывания при 450 nm, построить калибровочную кривую используя первые пять калибраторов: калибраторы A, B, C, D и E.

По результатам считываний при 405 nm, построить вторую калибровочную кривую используя три калибратора с самыми высокими концентрациями, т. е. калибраторы D, E и F.

2. Приписать концентрацию, указанную на флаконе, каждому калибратору, в pg/mL. Нанести данные калибровочной кривой на миллиметровую бумагу с концентрацией на оси X- и соответствующей абсорбции на оси Y.

3. Соединить прямой две соседние точки. Этот математический алгоритм называется поточечным расчетом.

Концентрацию образца можно получить, отложив значение абсорбции на оси Y и найдя соответствующую концентрацию на оси X.

Образцы пациентов и контролей нужно считывать при длине волны 450 nm для концентраций ПТГ до 200 pg/mL. Концентрации ПТГ более 150 pg/mL должны интерполироваться используя данные считывания при 405 nm .

Автоматический метод:

Компьютерные программы, использующие кубический сплайн или 4 PL [4 – параметровая логистика] могут также применяться.

(Данные образцов пациента при 450 нм (считывания абсорбции в сравнении с дистиллированной или деионизированной водой))

Т. к. концентрация > 150pg/mL, рекомендуется использовать данные полученные при 405нм, см. ниже в таблице Sample Data at 405 nm.

Для образцов с результатами < 150 pg/ml рекомендуется использовать данные, полученные при

длине волны 450нм, см. графу «Sample Data at 450 nm» в таблице. Это обеспечит результаты при оптимальной чувствительности набора.

Данные представлены только в качестве иллюстрации и не должны использоваться вместо данных, полученных в ходе исследования.

Absorbance Unit

Контроль качества.

контрольная плазма должна исследоваться при каждом исследовании калибраторов и образцов пациентов.

Результаты исследования контрольных образцов на приемлемость должны оцениваться с использованием соответствующих статистических методов. Если при исследовании результаты контрольных образцов находятся вне допустимого диапазона, результаты образцов пациентов могут быть недействительны.

ОГРАНИЧЕНИЯ ПРОЦЕДУРЫ

Набор PTH ELISA не показал “эффекта крюка высокой дозы” при исследовании образцов с 20,000 pg/mL АКТГ. Образцы с уровнями АКТГ выше максимального калибратора должны быть разведены и исследованы повторно.

Ожидаемые результаты

У 83 пациентов (США) был измерен уровень АКТГ с использованием набора Sangui ACTH ELISA. Полученные значения находились в пределах от 7.9 до 66.1 pg/mL. Среднее геометрическое + 2 стандартные отклонения среднего = 8.3 to 57.8 pg/mL.

РАБОЧИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ

Точность

Были проанализированы 117 образцов пациентов, уровни АКТГ в пределах от 1.5 до 1045 pg/mL с помощью ДРГ ELISA и набора для иммунорадиометрического анализа Nichols IRMA ACTH. Получена следующая статистика (линейная регрессия):

Чувствительность,

или минимальный определяемый уровень данного набора определяется по наименьшему отдельному значению,

не равному нулю, при доверительном пределе 95%. Чувствительность DRG ACTH ELISA = 0.46 pg/mL.

Прецизионность и воспроизводимость.

Прецизионность (вариации интра-анализа) набора DRG Intl ACTH ELISA рассчитывалась по определениям 21 репликата каждого из двух образцов.

Общая прецизионность (вариация интер-анализа) DRG Intl ACTH ELISA набора рассчитывалась по данным двух образцов, полученным при 35 различных исследованиях, тремя специалистами с тремя различными лотами реагентов за период 9 недель.