УДК 575.224.23:599.323
ЕРУБАЕВА Г. К., БИГАЛИЕВ А. Б.
ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИЕ ЭФФЕКТЫ РАЗЛИЧНЫХ КОНЦЕНТРАЦИЙ НЕФТИ ПРИ ХРОНИЧЕСКОМ ВОЗДЕЙСТВИИ
(Казахский национальный университет имени аль-Фараби)
Результаты исследований показали, что хроническое ингаляционное воздействие летучих фракций нефти на крыс в разных концентрациях вызывает значимое увеличение частоты клеток с хромосомными аберрациями в костном мозге в ряду поколений (1,5 – 2,5 раза по сравнению со спонтанным уровнем). Помимо нарушений структуры хромосом, также обнаружены геномные изменения (анеуплоидия, полиплоидия).
Тенгизское месторождение, расположенное в прибрежной зоне Каспийского моря в Западном Казахстане, является одним из интенсивно разрабатываемых нефтяных место-рождений. В результате происходит загрязнение нефтью и нефтепродуктами территорий нефтепромыслов [1, 2]. Отсюда, особую актуальность приобретает оценка влияния нефтяного загрязнения природной среды на генетический аппарат живых организмов. По данным литературы компоненты нефти (углеводороды, бенз(а)пирен, фенолы, тяжелые металлы и др.) оказывают токсическое, мутагенное, канцерогенное действие, а также приводят к нарушению генетической структуры природных популяций [3, 4, 5].
Цель исследования – изучение мутагенного действия летучих фракций нефти в эксперименте на крысах в условиях хронического ингаляционного воздействия. Задача исследования – оценить мутагенную активность различных концентраций нефти по изменению частоты структурных нарушений хромосом в клетках костного мозга.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В эксперименте были использованы белые беспородные крысы (самцы и самки) весом 200-250 г в возрасте 6 месяцев. Линейные животные используются, как правило, в зависи-мости от конкретных целей и задач исследования, например, для регистрации определенного типа мутаций: DLM, наследуемые транслокации, видимые мутации, RLM и др. Цель нашего исследования – регистрация хромосомных аберраций в соматических клетках, которые не требуют исследования на линейных животных. Животные экспериментальной группы (пер-вое поколение F1) подвергались хроническому ингаляционному воздействию летучими фрак-циями нефти в концентрациях 1 мг/л; 10 мг/л; 100 мг/л 6 раз в неделю по 1 часу в течение 1, 3 и 6 месяцев. Потомство второго (F2) и третьего (F3) поколений подвергались воздействию нефти в концентрациях 10 мг/л, 100 мг/л в течение 3 и 6 месяцев. В эксперименте использо-вано 135 крыс. Выбор исследуемых концентраций нефти основан на данных литературы [6, 7]. Контрольная группа животных не подвергалась интоксикации. Использована товарная очищенная нефть. Химический состав: нормальные углеводороды - 27,72%; изо-парафины – 43,29%; арены – 10,13%; нафтены – 18,55%; олефины – 0,3109%. Цитогенетический анализ хромо-сом в клетках костного мозга крыс проводили с помощью метафазного метода. Цитологи-ческие препараты готовили по общепринятой методике [8]. Препараты окрашивали азур-эози-ном по Романовскому-Гимза, который готовили по методике и [9]. Статистическую обработку полученных данных проводили общепринятыми методами [10].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Результаты цитогенетического анализа клеток костного мозга крыс первого поколения (F1) представлены в таблице 1.
Варианты эксперимента.
Крысы, подвергавшиеся воздействию летучих фракций нефти в течение 1 месяца. В данной группе животных, подвергавшихся хроническому ингаляционному воздействию нефти в концентрациях 1 мг/л и 10 мг/л, только во втором варианте эксперимента наблюдали увеличение частоты клеток с аберрациями (1,44±0,45)% и (2,11±0,54)% по сравнению с контролем (1,45±0,36)%. При воздействии нефти в концентрации 100 мг/л частота аберрантных клеток (2,94±0,63)% превышает контрольные значения, но статистически недостоверно. В этом же варианте эксперимента (100 мг/л) наблюдается значимое увеличение частоты анеуплоидных клеток (2,80±0,56)% (Р<0,05), а также частоты полиплоидных клеток (2,52±0,52)% (Р<0,05).
Крысы, подвергавшиеся воздействию летучих фракций нефти в течение 3 месяцев. В группе животных, подвергавшихся воздействию нефти в концентрациях 1 мг/л и 10 мг/л, также наблюдается недостоверное увеличение частоты клеток с аберрациями (1,67±0,43)% и (2,59±0,54)% по сравнению с контролем (1,48±0,36)%. При концентрации (100 мг/л) обнаружено превышение частоты клеток с аберрациями (2,90±0,53), а также наблюдается достоверное увеличение частоты полиплоидных клеток (2,40±0,48)% (Р<0,05).
Крысы, подвергавшиеся воздействию летучих фракций нефти в течение 6 месяцев. В экспериментальной группе животных, подвергавшихся хроническому ингаляционному воздействию нефти в концентрации 10 мг/л, обнаружено достоверное увеличение частоты клеток с аберрациями (3,23±0,58)% (Р<0,05), а при воздействии нефти в концентрации 100 мг/л величина аберрантных клеток составила (3,59±0,60)% (Р<0,05). Обнаружено также увеличение частоты анеуплоидных клеток (2,87±0,53)% (Р<0,05). Среди анеуплоидных клеток отмечена наибольшая частота гипердиплоидных клеток (1,85±0,43)% (Р<0,05), а частота полиплоидных клеток составила (3,08±0,55)% (Р<0,05). Среди полиплоидных встречаются клетки с тетраплоидным и октоплоидным набором хромосом.
В восстановительный период (1 месяц) (группа животных, которая не подвергалась повторной интоксикации) отмечено некоторое снижение частоты аберрантных, анеуплоидных и полиплоидных клеток, но она все еще превышала уровень контроля.
Установленные нами уровни хромосомных аберраций в контрольной группе животных согласуются с данными литературы [11, 12].
В таблице 2 представлены результаты цитогенетического анализа клеток костного мозга крыс второго поколения (F2).
Крысы, подвергавшиеся воздействию летучих фракций нефти в течение 3 месяцев. В данной группе животных, подвергавшихся хроническому воздействию нефти в концентраци-ях 10 мг/л и 100 мг/л, наблюдали незначительное увеличение частоты клеток с аберрациями - (2,48±0,52)% и (2,68±0,53)% - по сравнению с контролем (1,65±0,39)%. Вместе с тем отмеча-ется достоверное увеличение частоты полиплоидных клеток (2,95±0,51)% (Р<0,05) и (2,96 ±0,48)% (Р<0,05). Увеличение частоты анеуплоидных клеток наблюдается в группе животных, подвергавшихся воздействию нефти в концентрации 100 мг/л (2,68±0,52)% (Р<0,05).
Крысы, подвергавшиеся воздействию летучих фракций нефти в течение 6 месяцев. В экспериментальной группе животных, подвергавшихся хроническому ингаляционному воздействию нефти в концентрации 10 мг/л и 100 мг/л, обнаружено достоверное увеличение
Таблица 1 - Частота клеток с аберрациями хромосом, анеуплоидных и полиплоидных клеток у крыс в первом поколении (F1) в зависимости от концентрации и продолжительности воздействия нефти
Таблица 1 - Частота клеток с аберрациями хромосом, анеуплоидных и полиплоидных клеток у крыс в первом поколении (F1) в зависимости от концентрации и продолжительности воздействия нефти
Варианты опыт
| Конц-ция нефти, мг/л
| Длит-сть воздейст
вия, мес.
| Кол-во
мета
фаз
| Частота клеток
| с аберрациями
| гиподиплоидные
| гипердиплоидные
| анеуплоидные
| полиплоидные
| число
| (М±m), %
| число
| (М±m), %
| число
| (М±m), %
| Число
| (М±m), %
| число
| (М±m), %
| Контроль
| -
| 1
3
6
| 1100
1150
1250
| 16
17
21
| 1.45±0.36
1.48±0.36
1.68±0.36
| 9
8
9
| 0.82±0.27
0.70±0.25
0.72±0.24
| 5
6
8
| 0.45±0.20
0.52±0.21
0.64±0.22
| 14
14
17
| 1.27±0.34
1.22±0.32
1.36±0.33
| 12
12
18
| 1.09±0.31
1.04±0.30
1.44±0.34
| 1 группа
| 1
| 1
3
6
| 695
900
880
| 10
15
19
| 1.44±0.45
1.67±0.43
2.16±0.49
| 6
7
8
| 0.86±0.35
0.78±0.29
0.91±0.32
| 5
8
8
| 0.72±0.32
0.89±0.31
0.91±0.32
| 11
15
16
| 1.58±0.47
1.67±0.43
1.82±0.45
| 10
16
19
| 1.44±0.45
1.78±0.44
2.16±0.49
| 2 группа
| 10
| 1
3
6
| 710
850
930
| 15
22
30
| 2.11±0.54
2.59±0.54
3.23±0.58*
| 8
8
8
| 1.13±0.40
0.94±0.33
0.86±0.30
| 5
10
12
| 0.70±0.31
1.18±0.37
1.29±0.37
| 13
18
20
| 1.83±0.50
2.12±0.49
2.15±0.48
| 12
20
22
| 1.69±0.48
2.35±0.52
2.36±0.50
| 3 группа
| 100
| 1
3
6
| 715
1000
975
| 21
29
35
| 2.94±0.63
2.90±0.53
3.59±0.60*
| 12
8
10
| 1.68±0.48
0.80±0.28
1.03±0.32
| 8
12
18
| 1.12±0.39
1.20±0.34
1.85±0.43*
| 20
20
28
| 2.80±0.56 *
2.00±0.44
2.87±0.53 *
| 18
24
30
| 2.52±0.52 *
2.40±0.48 *
3.08±0.55 *
| восстан. пер.
| 1 группа
2 группа
3 группа
| 1
1
1
| 650
730
750
| 10
14
19
| 1.54±0.30
1.92±0.45
2.53±0.47
| 4
5
5
| 0.61±0.24
0.68±0.22
0.67±0.25
| 6
6
8
| 0.92±0.21
0.82±0.26
1.07±0.28
| 10
11
13
| 1.54±0.29
1.51±0.34
1.73±0.41
| 11
15
18
| 1.69±0.41
2.05±0.46
2.40±0.59
| Примечание: * Р<0.05, при t>2.31
|
частоты клеток с аберрациями (3,29±0,50)% (Р<0,05) и (3,85±0,61)% (Р<0,05) по сравнению с контролем (1,80±0,40)%. Кроме того, во второй группе (100 мг/л) обнаружено достоверное увеличение частоты анеуплоидных клеток (3,69±0,62)% (Р<0,05) по сравнению с контролем (1,44±0,40)%. Среди анеуплоидных клеток отмечена наибольшая частота гипердиплоидных клеток (2,46±0,52)% (Р<0,05). В двух группах при концентрациях 10 мг/л и 100 мг/л также обнаружено достоверное увеличение частоты полиплоидных клеток (3,29±0,50)% (Р<0,05) и (3,85±0,59)% (Р<0,05).
В восстановительный период (1 месяц) (группа животных, которая не подвергалась повторной интоксикации) наблюдается некоторое снижение частоты аберрантных, анеуплоидных и полиплоидных клеток, все еще превышающее уровень контроля.
В таблице 3 представлены результаты цитогенетического анализа клеток костного мозга крыс третьего поколения (F3).
Крысы, подвергавшиеся воздействию летучих фракций нефти в течение 3 месяцев. В группе животных, подвергавшихся хроническому воздействию нефти в концентрациях 10 мг/л и 100 мг/л, наблюдали достоверное увеличение частоты клеток с аберрациями (3,55±0,45)%, (Р<0,01) и (3,57±0,47)%, (Р<0,01) по сравнению с контролем (1,60±0,29)%. В этих же вариантах эксперимента отмечено достоверное увеличение частоты полиплоидных клеток (1,94±0,42)% (Р<0,05) и (2,00±0,49)% (Р<0,05).
Крысы, подвергавшиеся воздействию летучих фракций нефти в течение 6 месяцев. В экспериментальной группе животных, подвергавшихся хроническому ингаляционному воздействию нефти в концентрации 10 мг/л и 100 мг/л, обнаружено достоверное увеличение частоты клеток с аберрациями
(4,00±0,55)% (Р<0,01) и (4,47±0,59)% (Р<0,01). Также обнаружено достоверное увеличение частоты анеуплоидных клеток (2,43±0,51)% (Р<0,05) и (2,77±0,52)% (Р<0,05). Среди анеуплоидных клеток отмечено достоверное увеличение частоты гипердиплоидных клеток (1,39±0,35)% (Р<0,05). В двух экспериментальных вариантах при концентрациях 10 мг/л и 100 мг/л, также обнаружено достоверное увеличение частоты полиплоидных клеток (2,00±0,31)% (Р<0,05) и (2,46±0,58)% (Р<0,05).
В восстановительный период (1 месяц) (группа животных, которая не подвергалась повторной интоксикации) наблюдали некоторое снижение частоты аберрантных, анеуплоидных и полиплоидных клеток, но превышающее контрольные значения. Причем, во второй группе частота клеток с аберрациями достоверно превышала контрольные значения и составила (3,04±0,39)% (Р<0,05).
Ранее нами было установлено, что анализ спектра структурных нарушений хромосом показал, что нефть индуцирует аберрации как хромосомного, так и хроматидного типов [13]. Помимо струк-турных нарушений хромосом наблюдали геномные изменения (анеуплоидия, полиплоидия).
Известно, что анеуплоидия может быть следствием нерасхождения хромосом, отставания хромосом или хроматид в анафазе митоза, а также элиминации из клеток поврежденных хромосом. Увеличение частоты анеуплоидных и полиплоидных клеток в костном мозге крыс свидетельствует, что компоненты нефти индуцируют также аномалии митоза [14, 15].
Проведенный сравнительный анализ чувствительности к воздействию нефти потомства, полученного от животных, которые были обработаны различными концентрациями нефти, показывает, что F2 и F3 более чувствительны к действию нефти, о чем свидетельствуют выявленные нарушения структуры и числа хромосом в костном мозге полученного потомства. Эти данные находят подтверждение в литературе [16, 17, 18].
В целом существует множество объяснений возможного воздействия ксенобиотиков, вклю-чающее как прямое воздействие на потомство, так и опосредованное - путем проникновения их через плацентарный барьер. Так, в работе , и др. при введении крысам ДМБА и БП установлена их способность проникать через плацентарный барьер как при внутривенном, так и при внутрижелудочном введении в организм беременных крыс [19].
Таблица 2 - Частота клеток с аберрациями хромосом, анеуплоидных и полиплоидных клеток у крыс второго поколения (F2) в зависимости от концентрации и продолжительности воздействия нефти
Таблица 2 - Частота клеток с аберрациями хромосом, анеуплоидных и полиплоидных клеток у крыс второго поколения (F2) в зависимости от концентрации и продолжительности воздействия нефти
Варианты опыт
| Конц-ция нефти, мг/л
| Длит-сть воздейст
вия, мес.
| Кол-во
мета
фаз
| Частота клеток
| с аберрациями
| гиподиплоидные
| гипердиплоидные
| анеуплоидные
| полиплоидные
| число
| (М±m), %
| число
| (М±m), %
| число
| (М±m), %
| число
| (М±m), %
| число
| (М±m), %
| Контроль
| -
| 3
6
| 850
835
| 14
15
| 1.65±0.39
1.80±0.40
| 5
5
| 0.59±0.24
0.60±0.23
| 5
7
| 0.59±0.24
0.84±0.30
| 10
12
| 1.18±0.35
1.44±0.40
| 12
13
| 1.41±0.39
1.56±0.42
| 1 группа
| 10
| 3
6
| 645
700
| 16
23
| 2.48±0.52
3.29±0.50*
| 7
7
| 1.08±0.38
1.00±0.33
| 8
12
| 1.24±0.35
1.71±0.42
| 15
19
| 2.33±0.51
2.71±0.52
| 19
23
| 2.95±0.51 *
3.29±0.50 *
| 2 группа
| 100
| 3
6
| 710
650
| 19
25
| 2.68±0.53
3.85±0.61*
| 10
10
| 1.41±0.37
1.54±0.45
| 9
16
| 1.27±0.29
2.46±0.52*
| 19
24
| 2.68±0.52 *
3.69±0.62 *
| 21
25
| 2.96±0.48 *
3.85±0.59 *
| Восстан. Пер.
| 1 группа
2 группа
| 1
1
| 667
700
| 14
18
| 2.10±0.51
2.57±0.48
| 6
8
| 0.90±0.36
1.14±0.40
| 8
10
| 1.20±0.41
1.43±0.38
| 14
18
| 2.10±0.55
2.57±0.51
| 15
19
| 2.25±0.43
2.71±0.53
| Примечание: * Р<0.05, при t>2.31
|
Таблица 3 - Частота клеток с аберрациями хромосом, анеуплоидных и полиплоидных клеток у крыс третьего поколения (F3) в зависимости от концентрации и продолжительности воздействия нефти
Таблица 3 - Частота клеток с аберрациями хромосом, анеуплоидных и полиплоидных клеток у крыс третьего поколения (F3) в зависимости от концентрации и продолжительности воздействия нефти
Варианты опыт
| Конц-ция нефти, мг/л
| Длит-сть воздейст
вия, мес.
| Кол-во
мета
фаз
| Частота клеток
| с аберрациями
| гиподиплоидные
| гипердиплоидные
| анеуплоидные
| полиплоидные
| число
| (М±m), %
| число
| (М±m), %
| число
| (М±m), %
| число
| (М±m), %
| число
| (М±m), %
| Контроль
| -
| 3
6
| 750
726
| 12
13
| 1.60±0.29
1.79±0.36
| 5
4
| 0.67±0.29
0.55±0.24
| 2
3
| 0.27±0.12
0.41±0.17
| 7
7
| 0.93±0.40
0.96±0.35
| 5
6
| 0.67±0.28
0.83±0.39
| 1 группа
| 10
| 3
6
| 620
700
| 22
28
| 3.55±0.45 **
4.00±0.55**
| 8
10
| 1.29±0.45
1.43±0.30
| 4
7
| 0.65±0.30
1.00±0.37
| 12
17
| 1.94±0.50
2.43±0.51 *
| 12
14
| 1.94±0.42 *
2.00±0.31 *
| 2 группа
| 100
| 3
6
| 700
649
| 25
29
| 3.57±0.47 **
4.47±0.59 **
| 6
9
| 0.86±0.30
1.39±0.27 *
| 4
9
| 0.57±0.22
1.39±0.35 *
| 10
18
| 1.43±0.47
2.77±0.52 *
| 14
16
| 2.00±0.49 *
2.46±0.58 *
| Восстан. пер.
| 1 группа
2 группа
| 1
1
| 654
690
| 18
21
| 2.75±0.42
3.04±0.39 *
| 5
6
| 0.76±0.34
0.87±0.32
| 5
3
| 0.76±0.27
0.43±0.20
| 10
9
| 1.53±0.45
1.30±0.48
| 8
12
| 1.22±0.40
1.74±0.33
| Примечание: * Р<0.05, при t>2.31 , * * Р< 0.01 , при t> 3.36
|
Таким образом, рассмотренные нами данные литературы позволяют предполагать, что и в наших опытах увеличение частоты индуцированных нефтью аберраций хромосом в клетках костного мозга крыс в ряду поколений (F2, F3), вероятно, может быть результатом либо прямого воздействия нефти, либо их возможного проникновения через плаценту матери. Безусловно, мы не можем утверждать, что действительно так оно и происходит, так как углеводороды, содержащиеся в нефти, проходят цикл метаболических процессов в организме животного. Можно полагать также, что обнаруженный мутагенный эффект нефти при загрязнении окружающей среды свидетельствует о ее потенциальной опасности для биоты и здоровья населения в зоне интенсивной добычи и переработки нефти.
ЛИТЕРАТУРА
1. Шаккузова состояние и экологические аспекты освоения Каспийского шельфа // Матер. респ. науч.-практ. конф. - Актау: АГУ им. Ш.Есенова, 2002. - С.431-435.
2. J. Gemoets, R. Lookman, G. Vanermen, D. Van Houtven, D. Berters, R. Weltens, C. Cornelis. Total petroleum hydrocarbons: characterization of physic-chemical behavior and risks. // Conference on Conta-minated Soil in cjjperation with OVAM 8-th International FZK/TNO. ICC Gent, Belgium, 2003, 12-16 may. –P.67.
3. , Абилев и окружающая среда. - Караганда: КарГУ, 19с.
4. , Чеботарев человека и мутагены внешней среды. - М.: Медицина, 19с.
5. Экологический мониторинг и анализ состояния здоровья населения нефтеносных районов Атырауской области. // Поиск, 2002. № 4. –С.116-122.
6. , Мухаметова интоксикация продуктами сернистой нефти. Патогенез, клиника и лечение. - М.: Медицина, 19с.
7. , , Квятковская изучения хронического действия химических и биологических загрязнителей. - Рига: Зинатне, 19с.
8. Красавцев хромосом в клетках костного мозга свиней // Цитология и генетика. - Киев. Т.3. №6, 1969. - С.501-505.
9. , Раджабли сельскохозяйственных и лабораторных млекопитающих. - Новосибирск: Наука, 19с.
10. Рокицкий в статистичекую генетику. - Минск: Вышейшая школа, 19с.
11. , , К Хромосомные аберрации в соматических клет-ках млекопитающих, вызванные соединениями хрома // Цитология и генетика. - Киев: Наукова думка. Т.10. №3., 1976. - С.222-224.
12. Дмитириев нестабильность у трех видов грызунов в районе химических предприятий на севере России. // Экология. –М.: Наука, 1997. №6. –С.447-451.
13. , , Сильвестрова "доза-эффект" при оценке мутагенности нефти в эксперименте. // Вестник КазНУ. Серия экологическая, 2002. №2(11). - С.161-165.
14. , Урываева полиплоидия. Пролиферация и дифференцировка. –М.: Наука, 1981. –259с.
15. , , Севанькаев анеуплоидии в культурах эмбриональных фибробластов и лейкоцитов человека // Генетика. - М.: Наука. №10., 1966. - С.120-124.
16. Токсикология химических веществ, загрязняющих окружающую среду. // Под ред. , . - М., 19с.
17. Rowler B. A., Gandley R. E., Conner E. A. Mechanisms of cell injury by environmental pollutants.// Mar. Environ. Res. 1989. V.28, №1-4. –Р.297-298.
18. , , Остроумова органических соединений жирного ряда. // Итоги науки и техники. Сер. Токсикология, Т.12, - М.: ВИНИТИ, 1981. - С.65-116.
19. , , Иванов-Голицын трансплацентарного проникновения канцерогенных полициклических углеводородов у крыс и мышей. // Тез. докл. конф. «Лабораторные животные в медицинск. исследованиях» - М., 1974. –С.152-153.
***
Îñû çåðòòåóëåðäi» í¸òèæåñiíäå åãåóº½éðûºòàðäû» ¸ð ò¾ðëi êîíöåíòðàöèÿäà¹û ì½íàé áóëàðûíû» ôðàêöèÿëàðûìåí ¾çຠìåðçiì òûíûñ àëóûíà áàéëàíûñòû îëàðäû» ½ðïàºòàðûíû» ñ¾éåê ìàéû êëåòêàëàðûíäà õðîìîñîìàëûº àáåððàöèÿëàð жиілігіні» àðòàòûíû àíûºòàë¹àí (ñïîíòàíäûº äå»ãåéìåí ñàëûñòûð¹àíäà 1,5 – 2,5 åñå). Õðîìîñîìàëûº àáåððàöèÿëàð ïàéäà áîëóûìåí ºàòàð æàñóøàëàðäà ãåíîìäûº ¼çãåðiñòåð äå áàéºàë¹àí (àíåóïëîèäèÿ, ïîëèïëîèäèÿ).
***
At this article is showed the effect of naphtha different concentration by chronically inhalation of rats on a generation the frequency of chromosomal aberrations of bone marrow cells is increased (time then spontaneous level). The chromosomal aberrations part and the genomes changes (the aneuploidy and poliploidy cells) are founded also.
|
