О. В. ЕСЫРЕВ
КЛЕТОЧНЫЕ ПУТИ ПРОВЕДЕНИЯ СИГНАЛОВ ЦИТОКИНОВ. УСПЕХИ И ПЕРСПЕКТИВЫ МЕДИЦИНСКОЙ БИОТЕХНОЛОГИИ ЦИТОКИНОВ
(Алматинский Университет Технологии и Бизнеса, г. Алматы, Республика Казахстан)
Цитокины представлены группой молекул, которые проводят внутриклеточные сигналы используя многие сигнальные пути. Обсуждается Jak - STAT путь, как главный сигнальный путь, наряду с этим обсуждаются и другие пути. Jak-STAT путь является самым коротким цитозоль-в-ядро сигнализирующим путем. Цитокины наряду с влиянием на процессы пролиферации и дифференцировки участвуют в регуляции естественной гибели (апоптоза) клеток иммунной системы. Обсуждаются медицинские аспекты использования цитокинов для лечения разнообразных заболеваний
Введение. В настоящее время укрепляется понимание того, что основные клеточные функции - рост, старение, трансформации - обеспечиваются сложной сетью биохимических сигнальных путей, проводящих внешние сигналы внутрь клетки и, благодаря каскаду реакций осуществляемых сигнальными белками, проводящих их к специфическим мишеням в цитоплазме или ядре /1, 2, 3, 4/.
Связываясь с рецепторами сигнальные молекулы, список которых обширен (к примеру, цитокины, факторы роста, пептидные и стероидные гормоны, нейромедиаторы и антигены) открывают расходящиеся сигнальные пути.
Передача сигналов от рецепторов на геном - одна из наиболее актуальных и интенсивно развивающихся областей клеточной и молекулярной биологии. Особое внимание уделяется сведениям о веществах, которые обеспечивают или блокируют частично или полностью передачу сигнала.
Цель настоящего обзора состоит в освещении некоторых последних данных в сигнализации и, в частности, в сигнализации цитокинов и обсуждении их практического применения.
Прогресс в изучении биохимии клетки, молекулярной биологии и иммунологии послужил основой современных революционных преобразований в области терапии. Именно здесь для борьбы с разнообразными патологическими случаями все в большей степени используются биологические вещества. Биотехнология, традиционная микробиологическая и фармацевтическая промышленность составляют производственную базу для получения таких веществ, в том числе новых вакцин, лекарственных препаратов и биологических материалов.
Ras-Raf-MAP киназный путь. В так называемых Ras-зависимых сигнальных путях ключевую роль играет продукт протоонкогена c-ras-белок Ras. Этот белок активируется и от него расходятся многие сигнальные пути. Суперсемейство Ras включает большое число молекул вовлекающихся в клеточную пролиферацию, дифференциацию, реорганизацию цитоскелета, апоптоз, транспортирования белков и везикул в ядро /1, 2, 5, 6/. В состав семейства Ras входят H-Ras, K-Ras, N-Ras и другие гомологичные белки, также такие как R-Ras, TC 21, Rap и Ral. Не вдаваясь в детали функционирования Ras-зависимых сигнальных путей в упрощенном виде схему данных путей можно представить следующим образом.
Благодаря собственной GTPазной активности и действию факторов обмена гуаниннуклеотидов (включает белки Sos-h, Cdc25 и Sos2) и активатора GTPазы (GAP) (включает p120GAP и нейрофибромин NF1GAP) белок Ras циклически переходит из GTP-связанной активной формы в GDP-связанную неактивную и обратно.
Активированный RasGTP связывается с серин/треонин протеин киназой Raf-1, и захватывает эту киназу в плазматическую мембрану, что способствует ее активации. Далее запускается каскад реакций Raf-1, активированный взаимодействием с Ras, фосфорилирует треонин/тирозин киназу МЕК (МАРКК-киназа митогенактивируемой протеин киназы), субстратом которой является конечное звено киназного каскада митогенактивируемая протеин киназа - МАР-киназа.
МАР-киназа - полифункциональный фермент, способный проникать в ядро и фосфорилировать по серину и треонину продукты протоонкогенов c-mic, c-jun, c-fos, белки ATF-2, NF-IL6, p62TcF, превращает их в факторы транскрипции.
Анализ полученных данных позволяет сделать вывод о том, что такая каскадная последовательность реакций во многих случаях действует как включатель, определяющий регуляцию генной экспрессии, требующуюся для решения клетки делиться или дифференцироваться.
Известно, что в наиболее распространенных опухолях и лейкозах усилена мощность Ras-зависимых сигнальных путей и, как следствие этого, наблюдается гиперпродукция протоонкогенов mic, jun, fos-конечных звеньев этих сигнальных путей. Не случайно продукт протоонкогена c-ras белок p21 Ras привлекает внимание исследователей как возможная мишень для противоопухолевых препаратов.
SH2- и SH3-домены. В последние годы получены доказательства, что отдельные сигнальные белки узнают собственных партнеров с помощью так называемых SH2- и SH3-доменов /2/. Они являются некаталитическими доменами в молекулах цитоплазматических протеинтирозин киназ семейства Src, в липидкиназах, протеинфосфатазах, адапторных белках и факторах транскрипции и способны избирательно и с высоким сродством связываться с фосфотирозиновыми участками мембранных рецепторов и других сигнальных белков.
В результате функционирования SH2-доменов происходит физическое связывание звеньев сигнального пути в единую цепь и взаимодействие между различными сигнальными путями. Поскольку многие компоненты сигнальных путей обладают протеин киназной активностью, то при их объединении происходит резкое усиление сигнала и включение биохимических механизмов усиления ответной реакции клетки.
SH3-домены обеспечивают взаимодействие между белками, локализованными на мембранах или в цитоскелете, подведение сигнальных белков к их субстратам и регуляцию активности ферментов.
Это можно иллюстрировать тем, что адапторный белок Grb2 своим SH2-доменом связывается с рецепторами факторов роста, а SH3- домен соединяется с активатором G белков Sos-h, притягивая его к плазматической мембране и G белки и запуская тем самым целую сеть Ras-зависимых сигнальных путей.
С открытием SH2-доменов сигнальных белков появились новые возможности для воздействия на систему Ras с целью блокады передачи митогенных сигналов от рецепторов факторов роста или цитокинов к Ras белкам. Возможна блокада короткими олигопептидами, комплементарными SH2-доменам адапторных белков Grb2, Grk, Nck, Shc или фосфотирозиновым мотивам их рецепторных лигандов передачи сигнала от рецепторов к Ras белкам. Подобного рода олигопептиды могут выступить в качестве новых противоопухолевых лекарств.
Согласно литературным данным сдвоенные SH2-домены Т-протеинтирозин киназы Zap70 могут рассматриваться в качестве мишени специфичных для Т-клеток иммунодепрессантов, не оказывающих побочного цитотоксического действия на клетку другого происхождения. Такими депрессантами могут быть олигопептиды, комплементарные иммунотирозин активирующим мотивам Т-клеточного рецептора антигенов или SH2-доменам Zap70 киназы. Есть основания утверждать, что углубления знаний о структуре и функциональных свойствах SH2- и SH3-доменов будет способствовать поиску новых эффективных нетоксических противоопухолевых и иммуномодулирующих лекарственных средств /2/.
Кроме того, было отмечено блокирование передачи сигнала при направленной мутации SH2-доменов или фосфотирозиновых участков их лигандов. Эти наблюдения позволяют предположить возможность коррекции работы сигнальных путей, поврежденных при некоторых генетических заболеваниях человека.
STAT белки. В 1990 году открыт однокаскадный путь, когда сигнал от рецептора непосредственно активирует транскрипционные факторы в ядре. Это STAT белки (signal transducers and activators of transcription). Они локализованы в цитоплазме. К настоящему моменту охарактеризовано семь STAT белков: STAT1, STAT2, STAT3, STAT4, STAT5a, STAT5b и STAT6 /2, 6/.
Следует напомнить, что эти белки соединяются с фосфорилированными цепями рецепторов цитокинов с помощью своих SH2 доменов. Поскольку имеет место различие в STAT белках, то отмечается и различие в аминокислотных последовательностях их SH2-доменов.
После соединения с рецепторами STAT белки сами становятся мишенями для фосфорилирования цитоплазматическими Jak киназами по их функционально важному С-терминальному тирозину. Затем они диссоцируют от рецептора и объединяются в форму гомо - или гетеродимеров, связываясь с собственными SH2-доменами или других STAT белков. В результате возникает большой набор STAT димеров, каждый из которых проникает в ядро, где прямо связывается с ДНК в регуляторных районах генов-мишеней и становится фактором транскрипции, модулируя экспрессию генов.
Этим достигается специфичность сигнализации, осуществляемой через разные рецепторы цитокинов. Важно понимать, что открытие STAT белков является, по сути, только началом в изучении этого сигнального пути и его механизмов регуляции и коррекции нарушений при заболеваниях.
Представлены первые данные, указывающие на роль STAT белков в опухолевой трансформации клеток и на возможность для STAT3 действовать как онкоген.
Цитокины. Цитокины представляют группу разнообразных молекул, которые проводят внутриклеточные сигналы /6,7/. Согласно последним экспериментальным данным большую часть цитокинов можно разделить на две группы: тип I и тип II цитокины. Цитокины типа I включают многие интерлейкины и колонии-стимулирующие факторы, такие как IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-11, IL-12, IL-13, GM-CSF и гранулоцит-колонии стимулирующий фактор. Кроме того, сюда входят нейтрофильный фактор, фактор ингибирования лейкемии, кардиотрофин-1, онкостатин М, гормон роста, пролактин, эритропоэтин, тромбопоэтин, лептин, фактор стволовых клеток и Т-хелпер 1 и Т-хелпер 2 цитокины. Цитокины типа II включают INF (INF-a/b и INF-g) и IL-10 /6/.
Их функция состоит в регуляции деления и дифференцировки кроветворных клеток, межклеточных взаимодействий, иммунных ответов. Цитокины обычно синтезируются в очагах воспаления. Цитокины осуществляют свои регуляторные функции, стимулируя через протеинтирозин киназы Src-семейства как Ras-зависимые, так и Ras-независимые сигнальные пути. В целом цитокины используют сложные сигнальные пути, однако, особое внимание, как главный сигнальный путь для цитокинов вызывает Jak-STAT система. Тирозивные мотивы рецепторов многих цитокинов после фосфорилирования становятся специфическими местами связывания SH2-доменов Jak киназ /8/.
Получено доказательство, что в дополнение к Ras-Raf-MAP-киназному и Jak-STAT пути цитокин IL-2 активирует другие сигнальные пути, включая пути сопряженные с фосфатидилинозитол 3-киназой (PI3K). Активация PI3K интерлейкином-2 важна для активации р70S6 киназы и Akt. К возможным эффекторам Akt относят р70S6 киназу, которая обладает выраженным антиапоптическим действием /3/. Jak-STAT путь является очень быстрым цитозоль-в-ядро сигнальным путем быстро проводящим экстраклеточные сигналы в ядро /2/.
Этот краткий экскурс в проблематику цитокинов позволяет заключить, что сигнализирование этими агентами складывается из активации различных сигнальных путей. Однако недостаточно ясно в настоящее время как достигается специфичность действия индивидуальных цитокинов и как различные сигнальные пути интегрируют друг с другом.
Цитокины являются регуляторами различных процессов в иммунной системе и апоптоза (генетически программируемая клеточная смерть), в частности.
Иммунные ответы подчиняются тем же закономерностям, что и процессы идущие с участием классических гормонов и рецепторов. В связи с этим важно изучение механизмов иммуномодуляции и расширение круга препаратов, тестируемых на иммуномодулирующую активность.
Апоптоз - распространенная форма клеточной гибели эукариот, встречающаяся среди различных систем организма и, в том числе, среди клеток иммунной системы. Апоптоз - это реакция также каскадная и сигнальная, поскольку контрабаллансом апоптозу являются процессы клеточной пролиферации, то неудивительно, что отклонения от нормы в апоптических процессах могут иметь патологические последствия. Клинические проявления апоптической недостаточности обнаруживаются при злокачественных перерождениях, болезни Альцгеймера, СПИДе и ревматоидных артритах.
Появились данные о том, что IL-2 подавлял процесс клеточной гибели тимоцитов, причем этот эффект, по всей видимости, обусловлен протеин киназой С, поскольку ингибитор киназы GF109203Х отменял супрессию апоптоза. IL-2 также угнетал также специфический апоптоз, индуцированный g-облучением зрелых Т-клеток памяти. Это свойство IL-2 может найти терапевтическое применение у больных, получающих химио - или радиотерапию, и у больных СПИДом, иммунодефицит которых связан с потерей антигенспецифических клеток памяти. IL-2 препятствовал так же апоптозу в лейкемических клетках человека.
Дефекты IL-2 и его рецептора были найдены при множественном склерозе, ревматоидном артрите. Терапевтическое применение IL-2 состоит в использовании активированных клеток против опухолевого роста.
Лишение интерлейкина-3 клеток и IL-3-зависимых линий приводило к развитию апоптоза. При удалении IL-6 некоторые миелоидные линии погибали по типу апоптоза, добавление же экзогенного IL-6 предотвращало клеточную гибель. IL-12 предотвращал апоптоз Th-1-лимфоцитов больных СПИДом. IL-4, как и IL-2 также предотвращали вызванный глюкокортикоидами апоптоз тимоцитов. Кроме того, терапевтический потенциал IL-4 связан с его возможностью, восстанавливать клеточный и гуморальный иммунитет.
Таким образом, отсутствие интерлейкинов в культуре или недостаток их in vivo приводит к программированной гибели клеток разных типов.
Другой представитель цитокинов g-интерферон оказался эффективным в лечении ряда заболеваний, таких как опухоли, септический шок. Показано также участие интерферонов в процессе апоптоза.
Недавно синтезировано оригинальное семейство гистаминсодержащих соединений, имитирующих действие цитокинов и значительно повышающих специфичность клеточного ответа /9/. Пептидомиметик L-Glu-Hist из данного семейства оказался потенциальным иммунотерапевтическим агентом. Как выяснилось, данный агент играет специфическую роль физиологического агониста, вызывая различные виды клеточных ответов, в том числе пролиферацию лимфоцитов.
Хорошо известна серия антагонистов, которые антогонизируют эффект цитокинов на рецепторном уровне и ингибируют вызванную определенным цитокином сигнальную трансдукцию и могут поэтому быть кандидатами для иммунофармакологического воздействия на течение заболеваний, например астмы /10/.
В этом отношении также вызывает интерес антагонист рецептора IL-2 и растворимые рецепторы IL-2 и IL-4. Для иммунофармакологического вмешательства важны также антитела. Человеческие анти-IL-5 и анти-TNF антитела уже предложены в клинику. Кроме того, ряд цитокинов имеют антиаллергические, антивоспалительные активности: в качестве примера - g-IFN является IL-4-антагонистом; IL-12 индуцирует дифференциацию Тн1-тип Т-лимфоцитов; g-IFN, IL-10, TGF-b, IL-6,IL-1, IL-2 и фактор некроза опухоли-a выявляют активный антивоспалительный эффект.
Растворимый рецептор IL-1, являющийся антагонистом рецептора IL-1 и растворимый рецептор IL-4 были идентифицированы как потенциальные иммунорегуляторные агенты для лечения астмы /10/. В терапевтических целях IL-1 используется не только благодаря его возможности стимулировать продукцию антител, но и как ранозаживляющее вещество, стимулятор гемопоэза и адъювант при вакцинации.
В настоящее время становится ясным, что терапия цитокинами и родственными факторами представляет собой один из подходов к лечению заболеваний, особенно в онкологии. Безусловно, иммунотерапия не может быть лечебным средством онкологических заболеваний, но вместе с удобным антиканцерным лечением она будет важным инструментом в наборе онколога. При терапевтическом применении цитокинов следует учитывать чувствительность клеток к возникновению апоптоза и возможность возникновения влияния на этот процесс. Понимание молекулярных процессов регулирования апоптоза будет существенно помогать развитию терапевтических мер лечения апоптоз-связанных заболеваний /11/.
В качестве принципиального положения из выше сказанного о цитокинах следует то, что для достижения положительных результатов в терапии онкозаболеваний лучшим инструментом послужит комбинация традиционных терапий с цитокинами, ингибиторами проведения сигнала, клеточными адъювантами и эффекторами.
Заключение. По современным представлениям медико-биологический подход к лечению болезней человека и перевод улучшения здоровья на биотехнологический путь являются неотвратимыми тенденциями. Большинство из имеющихся в арсенале веществ модулирующих проведение сигнала в клетках получено микробным синтезом. Работы, которые могут представлять интерес с позиций создания биотехнологических препаратов должны быть связаны с всесторонним исследованием структуры, свойств и механизмов действия сигнальных молекул и, в первую очередь, сигнальных белков.
Что касается цитокинов, то углубленное изучение цитокинов, их рецепторов и механизмов их действия позволит разработать подходы к лечению самых различных болезней, в том числе рака, аутоиммунных заболеваний, хронических инфекций, СПИДа, а также предотвращению отторжения трансплантанта при пересадке органов.
ЛИТЕРАТУРА
1. J. Gomez e. a., Dual role of Ras and Rho proteins: At the cutting edge of life and death. Immunology and Cell Biology, 1998, V. 76, №2, P.125-134.
2. A. K.Белоусова, Молекулярные основы специфического взаимодействия сигнальных белков. Успехи современной биологии, 1999, том 119, №4, с. 345-358.
3. M. A. Красильников, Сигнальные пути, регулируемые фосфатидилинозит-3-киназной и их значение для роста, выживаемости и злокачественной трансформации клеток. Биохимия, 2000, том 65, вып. 1, с. 68-78.
4. M. Rincon e. a., Do T cells care about the mitogen-activated protein kinase signalling pathways?. Immunology and Cell Biology, 2000, V. 78, №2, P.166-175.
5. D. A. Lauffenburger, Cell signaling pathways as control modules: Complexity for simplicity?. PNAS, 2000, V. 97, №10, P..
6. W. J. Leonard, J-X Lin, Cytokine receptor signaling pathways. J Allergy Clin Immunol, 2000,V.105, №5, P.877-888.
7. M. R. Wilson, Apoptotic signal transduction: emerging pathways. Biochem. Cell Biol., 1998, V.76, №3, P.573-582.
8. M. B. Робинсон, B. A. Труфакин, Апоптоз и цитокины. Успехи современной биологии, 1999, том 119, №4, с. 359-367.
9. M. A. Бабижаев и др., Передача клеточного сигнала и модуляция свободнорадикального окисления новым пептидомиметиком L-глутамилгистамином. Биохимия, 1999, том 64, вып. 5, с. 612-627.
10. L. J. Rosenwasser, New immunopharmacologic approaches to asthma: Role of cytokine antagonism. J Allergy Clin Immunol, 2000,V.105, №2, P.586-592.
11. I. D. Davis, An overview of cancer immunotherapy. Immunology and Cell Biology, 2000, V. 78, №3, P.179-195.
SUMMARY
Cytokines represent a group of molecules that transmit intercellular signals. Cytokines use multiple signaling pathways. The major signaling pathway Jak-STAT is discussed, although other pathways are reviewed. The Jak-STAT pathway is a very rapid cytosol-to-nuclear signaling pathway. Cytokines are shown to participate in regulating the natural (programmed) death (apoptosis) of immune system` cells along with their influence on proliferation and differentiation. Medical aspects related to cytokine treatment of diverse diseases are discussed.
|
