Методические рекомендации по изучению дисциплины

Титульный лист методических рекомендаций и указаний; методических рекомендаций; методических указаний

Форма Ф СО ПГУ 7.18.3/40

Министерство образования и науки Республики Казахстан

Павлодарский государственный университет им. С. Торайгырова

Кафедра биотехнологии

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИЗУЧЕНИЮ ДИСЦИПЛИНЫ

«Культура клеток высших растений»

для студентов специальности 050701 Биотехнология

Павлодар

Лист утверждения методических рекомендаций и указаний; методических рекомендаций; методических указаний		Форма Ф СО ПГУ 7.18.3/41
		УТВЕРЖДАЮ Проректор по УР _________ «___»____________20__г.

Составитель: старший преподаватель _______________

Кафедра Биотехнологии

Методические рекомендации и указания

по изучению дисциплины

«Культура клеток высших растений»

для студентов специальностей 050701 Биотехнология

Рекомендовано на заседании кафедры

«___»__________20__г., протокол №__

Заведующий кафедрой _________ С.«___» ______20__г.

Одобрено УМС Агротехнологического факультета

«___»______________20__г., протокол №____

Председатель УМС _________ Жагипарова М. Е. «___» ______20__г.

Одобрено:

Начальник ОПиМОУП __________ «___» _______20__г.

Одобрена учебно-методическим советом университета

«___»______________20__г. Протокол №____

Тема №1. Введение

1.Культура клеток и тканей как основа биотехнологии растений. Культура клеток, тканей и органов растений: предмет, задачи.

2. История развития методов культивирования изолированных клеток, тканей и органов растений.

3. Изучение культуры клеток, тканей и органов растений для решения фундаментальных проблем биологии.

Культура клеток – это выращивание in vitro изолированных клеток, тканей органов на искусственной питательной среде в асептических условиях. Эффективное культивирование растительных клеток началось в 30-е годы благодаря работам Филиппа Уайта и Роже Готре.

Живая растительная клетка на подходящей питательной среде проявляет свойство тотипотентности и дает целый организм – растение регенерант. Тотипотентность – это свойство клеток полностью реализовать свой генетический потенциал с образованием целого растения. Растение с развитыми побегами и корнями, сформировавшееся in vitro, называется регенерантом.

Теоретические и методические принципы культивирования клеток растений закрепляются лабораторными занятиями №№ 1,2 «Техника работы в лаборатории. Приготовление маточных растворов», «Приготовление жидкой и агаризованной питательной среды Мурасиге – Скуга».

Для самостоятельной работы предлагается тема: «Каллусные культуры. Использование каллусных тканей в фундаментальных исследованиях биотехнологии».

Литература:

Основная:

1.Егорова биотехнологии. М., Академия, 2003.

2. А. Биотехнология высших растений. СПб., изд. С.-Петербургского ун-та, 2003.

3. Валиханова растений. Алматы, Тонжик, 2005.

Дополнительная:

1.Бутенко клеток высших растений n vitro и биотехнология на их основе. М., ФБК-ПРЕСС, 1999.

2.Дмитриева регуляции морфогенеза и дифференциации в культуре клеток и тканей растений. // Культура клеток растений.  М.: Наука, 1981. 

Тема №2. Методы культивирования in vitro клеток и тканей высших растений

2.1.

1.Условия септики при выполнении работ по культивированию растительных объектов in vitro, методы и приемы стерилизации растительного материала при введении в культуру.

2.Питательные среды, регуляторы роста растений и их применение для культивирования растительных клеток и тканей in vitro.

3. Влияние физических факторов на физиологическое состояние изолированных клеток и тканей растений.

Питательные среды для культивирования клеток имеют сложный состав: макро - и микроэлементы, углеводы, витамины, аминокислоты, фитогормоны. При соблюдении условий стерильности успех в культивировании клеток определяется, прежде всего, составом питательной среды. Внешними факторами, влияющими на культивирование клеток, являются температура, свет, осмотическое давление, аэрация. Приготовление питательных сред для культивирования изолированных клеток и тканей провести на примере среды Мурасиге-Скуга.

Для закрепления теоретического материала проводится лабораторное занятие № 2 «Приготовление жидкой и агаризованной питательной среды Мурасиге-Скуга».

2.2

1.Каллусные культуры. Роль каллусной ткани в интактном растении.

2.Молекулярно-физиологические основы процесса дедифференциации клеток.

3. Типы каллусных культур и их характеристика. Субкультивирование каллусов. Показатели роста каллусных культур. Использование каллусных тканей в фундаментальных исследованиях биотехнологии.

4.Суспензионные культуры. Основные преимущества культивирования клеточных суспензий. Способы получения суспензионных культур. Типы клеточных суспензий. Факторы, влияющие на степень их эгрегированности. Основные параметры суспензионных культур. Способы культивирования клеточных суспензий.

Для закрепления теоретического материала проводятся лабораторное занятие № 3 «Подготовка растительного материала и изоляция эксплантов», №4 «Посадка и культивирование эксплантов на агаризованной среде» для получение каллуса из паренхимной ткани корнеплода моркови на среде МС.

Для самостоятельной работы предлагаются темы:

-каллусные культуры. Использование каллусных тканей в фундаментальных исследованиях биотехнологии;

- основные параметры суспензионных культур. Способы культивирования клеточных суспензий.

2.3

1.Культивирование одиночных клеток. Методы изолирования одиночных клеток.

2.Методы выращивания in vitro одиночных клеток (метод культуры няньки, метод плейтинг, метод микрокультуры).

3.Фактор кондиционирования.

4.Культура гаплоидных клеток

5.Получение гаплоидных растений.

6.Основные пути андрогенеза. Факторы, влияющие на эффективность андрогенеза.

7.Метод культуры пыльников и метод культуры микроспор, их преимущества и недостатки.

8.Андрогенез in vitro, способы идентификации гаплоидов.

9.Культуры изолированных протопластов.

10. Условия и способы культивирования протопластов. Методы слияния протопластов.

11. Механизм слияния протопластов. Техника клеточной инженерии основана на технике протопластирования. Протопласт – это клетка без клеточной стенки, окруженная цитоплазматической мембраной. Протопласт получают, обрабатывая клетку ферментами, которые гидролизуют полимеры в клеточной стенке.

Для самостоятельной работы предлагается тема: «Изучение культуры отдельных клеток для доказательства тотипотентности растительной клетки».

Литература

Основная:

1.Егорова биотехнологии. М., Академия, 2003.

2. А. Биотехнология высших растений. СПб., изд. С.-Петербургского ун-та, 2003.

3. , Жаринов А.И. Прикладная биотехнология. ВГТА, 2001.

4. Валиханова растений. Алматы, Тонжик, 2005.

5. Комов . Учебник для студ. вузов по направлению Биотехнология. М., Дрофа,2004.

Дополнительная:

1., Самуилов . Учебное пособие для вузов в 8 кн. М., Высшая школа, 1987. Электронный учебник.

2.Урманцева каллусных тканей на твердых средах. // Методы культивирования клеток. Л.: Наука, 1988

Тема № 3. Биотехнология клеток высших растений in vitro

3.1

1.Основные перестройки, происходящие пи переводе клеток растений в культуру in vitro.

2.Сравнительная характеристика соматических клеток высших растений и клеток, культивируемых в условиях in vitro.

3.Морфологическая и генетическая гетерогенности популяций длительно культивируемых клеток высших растений.

4.Сохранение эпигенетических способностей растения донора. Синхронность клеточных культур.

5.Рост клеток в культуре in vitro. Характеристика фаз ростового цикла. Способы синхронизации клеточных культур

3.2

1.Дифференцировка клеток в культуре un vitro. Типы дифференцировки. Молекулярно-физиологические основы процесса дифференциации. Основные типы дифференцировки.

2.Гистогенез. Физиологические аспекты стимуляции флоэмо - и ксилемогенеза.

3.Морфогенез. Прямой и непрямой морфогенез.

В целях закрепления теоретического материала проводятся лабораторное занятие № 5 «Регенерация растений из каллусной ткани», № 6 «Индукция органогенеза и соматического эмбриогенеза» для регуляции, индукции процессов морфогенеза и органогенеза в культуре клеток и тканей путем введения фитогормонов.

Для самостоятельной работы предлагаются темы:

- морфофизиологическая характеристика ризогенеза, флорального и стеблевого органогенеза;

- факторы, определяющие возможность и направленность процесса органогенеза;

- соматический эмбриогенез;

- регенерация растений.

Литература:

Основная:

1.Егорова биотехнологии. М., Академия, 2003.

2. А. Биотехнология высших растений. СПб., изд. С.-Петербургского ун-та, 2003.

3. Валиханова растений. Алматы, Тонжик, 2005.

4. , Жаринов А.И. Прикладная биотехнология. ВГТА, 2001.

5. Комов . Учебник для студ. вузов по направлению Биотехнология. М., Дрофа,2004.

Дополнительная:

1.Биотехнология сельскохозяйственных растений. Москва,1997.

2. , , А. Гистология, цитология и эмбриология. М.,Медицина,2004.

3. , Челомбитько . СПб., СпецЛит : СПХФА, 2003.

4. , , Гаврилова и практика иммуноферментного анализа. М., Высш. шк., 1991. Электронный учебник.

5. , Самуилов . Учебное пособие для вузов в 8 кн. М., Высшая школа, 1987. Электронный учебник.

11. Бутенко клеток высших растений in vitro и биотехнологии на их основе. М., ФБК-ПРЕСС, 1999г. Электронный учебник.

Тема №4. Биотехнологии на основе культивируемых клеток, тканей и органов растений

4.1

1. Клеточные технологии для получения экономически важных веществ растительного происхождения.

2. Вторичные метаболиты растений.

3. Преимущества клеточных культур по сравнению с традиционным растительным сырьем.

4. Факторы, влияющие на накопление вторичных метаболитов культивируемых клеток.

Растения содержат разнообразные вещества вторичного метаболизма, которые широко используются в медицине и народном хозяйстве. Клетки in vitro способны синтезировать эти вещества и независимо от факторов окружающей среды служить их источником круглый год. Культивируемые клетки способны осуществлять биотрансформацию, то есть синтезировать некоторые вещества из дешевых и доступных предшественников. Факторами, влияющими на накопление клетками in vitro вторичных веществ, являются генотип растения, состав питательной среды, условия культивирования.

Биотехнологическое производство экономически важных веществ растений основано преимущественно на суспензионной культуре, которые выращиваются в многолитровых ферментерах. Однако такие особенности растительных клеток, как наличие жесткой и хрупкой стенки, большой вакуоли, различные размеры на разных тапах роста, осложняют их культивирование в таких ферментерах. Для клеток, которые секретируют нужные метаболиты в питательную среду, применяют иммобилизацию в основном путем обволакивания инетрными субстратами либо путем адсорбции на этот субстрат. Иммобилизованные клетки увеличивают выход вторичных веществ и дольше культивируются. Из омывающего клетки питательного раствора извлекают искомые продукты.

Доя создания клеточной технологии необходимо получение продуктивной и стабильной в генетическом отношении клеточной линии. Продуктивность клеток стимулируется мутагенезом и клеточной селекцией. Важно, чтобы клетки не утратили свой биосинтетический потенциал при переносе из условий лабораторного эксперимента в небольших колбах в условия промышленного выращивания в объемных ферментерах. Технологии промышленного культивирования клеток требуют развития фундаментальных знаний по биологии клетки и биосинтезу вторичных веществ, а также больших капиталовложений на первых порах.

Для самостоятельной работы предлагается выполнить реферат на тему: «Клеточные технологии для получения экономически важных веществ растительного происхождения».

Для самостоятельной работы предлагаются темы:

- ферментерное выращивание биомассы клеток-продуцентов, конструктивные особенности биореакторов;

- режимы культивирования растительных клеток в биореакторах;

- типы работ по созданию промышленных технологий для получения биологически активных веществ с помощью культивируемых клеток растений;

- преимущества и перспективы использования иммобилизованных растительных клеток в биотехнологических производствах;

- основные направления использования культивируемых растительных клеток для биотрансформации.

4.2

1.Биотехнология клонального микроразмножения и оздоровления растений. 2.Преимущества клонального микроразмножения в сравнении с традиционными методами вегетативного размножения растений.

3.Области применения микроразмножения.

4.Требования к объектам, используемым для клонального микроразмножения растений in vitro.

5.Способы микроклонирования растений.

6.Характеристики основных этапов микроразмножения.

7. Физиологические особенности регенерантов и необходимость в создании особых условий их адаптации ex vitro.

8.Факторы, влияющие на эффективность процесса микроклонального размножения растений.

9.Методы получения безвирусного посадочного материала, возможности и перспективы их использования.

Клональное микроразмножение – это массовое бесполое размножение растений в культуре клеток, при котором возникшие растения генетические идентичны исходному экземпляру. Клональное микроразмножение имеет ряд преимуществ по сравнению с обычными методами вегетативного размножения, среди которых наиболее значимыми являются высокий коэффициент размножения и возможность оздоровления от вирусов и патогенных микроорганизмов.

Методы клонального микроразмножения основаны на индукции развития пазушных меристем растений un vitro и на индукции возникновения у эксплантов или каллусов почек и эмбриоидов.

Тема закрепляется лабораторной работой № 7 «Микроклональное размножение растений и получение оздоровленного посадочного материал» с целью освоения методик микрочеренкования, культуры апикальных меристем картофеля, ИФА.

Для самостоятельной работы предлагаются тема: «Преимущества клонального микроразмножения в сравнении с традиционными методами вегетативного размножения растений».

4.3

1.Культуры изолированных клеток и тканей в селекции и генетической инженерии растений.

2.Использование метода эмбриокультуры для преодоления in vitro прогамной и постгамной несовместимости при скрещивании таксономически отдаленных партнеров.

3. Культивирование незрелых гибридных зародышей.

4.Экспериментальная гаплоидия. Основные преимущества и направления использования гаплоидов в генетической и селекционной работах. 5.Сомаклональная вариабельность растительных клеток и ее использование в биотехнологии.

6.Мутагенез и клеточная селекция растений в культуре in vitro.

7. Гибридизация соматических клеток (межвидовая и межродовая) и ее роль в селекционном процессе.

Отдаленная гибридизация – традиционный метод селекции, позволяющий обогащать генофонд культурных растений полезными генами дикорастущих видов. Однако из-за прогамной и постгамной несовместимости возникает проблема нескрещиваемости.

Прогамная несовместимость означает невозможность осуществления самого процесса оплодотворения по морфологическим, физиологическим и генетическим причинам. Прогамная несовместимость успешно преодолевается путем оплодотворения in vitro. Оплодотворение in vitro применяется не только для получения отдаленных гибридов, но и для исследования физиологии пыльцы и процессов оплодотворения.

Постгамная несовместимость проявляется после оплодотворения и выражается в генетически обусловленной несовместимости гибридного зародыша и окружающих тканей, вследствие чего зародыш погибает на самых ранних этапах эмбриогенеза. Однако, если своевременно изолировать его и поместить на питательную среду, он нормально развивается. При этом зародыш дает полноценное гибридное растение. Успешное культивирование недоразвитых изолированных зародышей зависит от стадии эмбриогенеза и состава питательной среды. Таким образом, культивирование зародышей in vitro, то есть эмбриокультура, является методом преодоления постгамной несовместимости, а также ускоряет селекционный процесс путем прерывания состояния покоя семян. Сокращения цикла размножения растений. Кроме того, культура зародышей позволяет решать теоретические вопросы эмбриологии.

Гаплоиды – организмы, соматические клетки которых содержат одинарный набор хромосом (n), то есть половину полного набора (2n), свойственного виду. Гаплоиды можно получать in vitro, культивируя клетки мужского либо женского гаметофита. Возникновение in vitro в культуре пыльника и пыльцы спорофита из микроспоры называется андрогенезом. Микроспоры проходят сложный путь развития, формируя эмбриоид либо каллус, поэтому растения - регенеранты могут быть гаплоидными, диплоидными, полиплоидными. Факторами, влияющими на выход андрогенных гаплоидных растений, являются генотип растения, стадия развития микроспоры, состав питательной среды и различные стрессовые воздействия, в частности температурные. В культуре пыльников и пыльцы выход гаплоидных растений – регенерантов, особенно у злаков, низок, и среди них бывает много альбиносов. Тем не менее, этим методом получены гаплоидные растения многих сельскохозяйственных культур и на их основе выведены ценные сорта

Клетки растений in vitro претерпевают морфологические, генетические, биохимические, физиологические изменения. Одни из них наследуются, другие - нет. Основой наследственной, или генетической, изменчивости являются мутации на генном, хромосомном и геномном уровнях, изменения внеядерных генов. Кроме того, по наследству передаются и эпигенетические изменения (изменения генной активности в онтогенезе при неизменном сохранении всего генома). Клеточная селекция – это процесс возрастающего доминирования в культуре клеток определенного типа. Преимущество клеточной селекции in vitro состоит в том, что она позволяет экспериментировать с миллионами клеток, каждая из которых может дать регенерант. В культуре клеток растений, используя селективные условия, можно отобрать клетки, устойчивые к патотоксинам, гербицидам, антибиотикам, аналогам аминокислот и нуклеотидов, к высоким концентрациям солей и тяжелых металлов и другим стрессовым факторам.

Прямая селекция состоит в отборе устойчивых клеток, выживающих на среде с селективным фактором. Непрямая селекции заключается в создании благоприятных условий для делящихся клеток дикого типа, мутантные клетки при этом не размножаются. Однако клетки дикого типа при делении включают в свою ДНК добавленный в среду аналог тимидина и поэтому вскоре погибают. Мутантные клетки, перенесенные на другую питательную среду, размножаются и дают устойчивые линии. Для получения мутантов в каждом случае необходимо разработать схему селекции и доказать генетическую природу измененных клеточных линий. Отбор устойчивых клеток проводится из различных культур (каллус на агаре, суспензия, протопласты). Отбор клеток может быть одноступенчатым (одна высокая концентрация селективного фактора) и многоступенчатая (постепенное повышение концентрации селективного фактора). Последним методом получаются более стабильные клеточные линии.

Стабильность признака устойчивости – важный момент в клеточной селекции. Получение стабильных линий – длительный процесс, потому что для закрепления устойчивости требуется многократное культивирование на селективной среде (4-6 раз), на среде без селективного фактора (2-3 раза) и снова на селективной среде. В таких условиях выживают лишь те линии клеток, у которых устойчивость имеет генетический характер. Однако механизмы устойчивости на уровне клетки и целого растения различны, и поэтому не всегда из устойчивых клеток вырастают устойчивые растения – регенеранты. Методом клеточной селекции получены сорта пшеницы, ячменя, риса, томатов, огурцов, устойчивые к гербицидам, засолению почвы и действию тяжелых металлов. Получены клеточные линии картофеля, моркови, риса, дурмана и других растений, способных к сверхсинтезу ряда аминокислот.

Сомаклональные варианты – это растения–регенеранты, отклоняющиеся от родительского типа, возникающие в результате генетической изменчивости in vitro. Причины сомаклональной изменчивости многообразны: кариотипические, амплификация или редукция генов, транспозоны, генные перестройки в связи с дифференциацией, соматический кроссинговер. На сомаклональную изменчивость влияет генотип, состав среды, продолжительность культивирования. Она имеет практическое значение в селекции как источник генетического разнообразия растений.

Для самостоятельной работы предлагаются темы:

- основные преимущества и направления использования гаплоидов в генетической и селекционной работах;

- сомаклональная вариабельность растительных клеток и ее использование в биотехнологии;

- мутагенез и клеточная селекция растений в культуре in vitro;

- гибридизация соматических клеток (межвидовая и межродовая) и ее роль в селекционном процессе.

- гибридизация;

- перенос клеточных органелл.

4.4

1.Генетическая трансформация растений

2.Характеристики методов введения экзогенного генетического материала в растительные клетки.

3. Генетическая трансформация растений in vitro с помощью Agrobacterium spp.

4.Баллистический метод генетической трансформации растений.

Для самостоятельной работы предлагается тема:

- основные напраления в создании трансгенных растений.

4.5

1.Использование культур растительных клеток для сохранения генофонда высших растений.

2.Необходимость и проблемы сохранения генофонда растений.

3.Особенности методов сохранения растительных культур in vitro.

4.Характеристика пересадочных коллекций. Депонирование культур клеток, тканей и органов растений.

5.Основные этапы технологии криоконсервации растительных

объектов.

Для решения теоретических и практических задач биотехнологии нужны надежные методы хранения культуры клеток.

Существуют два способа хранения клеток:

1) замедление ростовых процессов в них;

2) криосохранение – хранение в замороженном состоянии в жидком азоте при температуре -196°С.

Трудности криосохранения связаны с особенностями растительных клеток, отличающихся большими размерами, сильной вакуолизацией и большим содержанием воды. Приз замораживании клетки погибают от образования льда внутри и снаружи клеток, механического повреждения мембран, а также от осмотического стресса, вызванного сильным обезвоживанием клетки. Для криосохранения требуется особая подготовка культуры, использование криопротекторов, программное замораживание и быстрое оттаивание. Подготовка культуры сводится к обогащению клетками меристематического типа и, в случае суспензии, увеличению ее плотности. Криопротекторы – вещества, снижающие точку замерзания воды в клетке путем ее связывания и тем самым защищающие клетку от механического и осмотического стресса. Тип криопротектора и его центрация подбираются для каждого вида клетки. Важно найти оптимальную программу замораживания. Более успешным является программированное замораживание, т. е. замораживание с определенной скоростью снижения температуры. После быстрого оттаивания и удаления протектора проверяется жизнеспособность клеток. Рекультивированные после хранения в жидком азоте клеточные культуры в основном идентичны исходным и пригодны для биотехнологического использования. Они сохраняют свой биосинтетический и морфогенетический потенциал. Из каллусных клеток, меристемы. Пыльцы удалось регенерировать растения у целого ряда видов. Криосохранение клеток является способом сохранения генофонда и служит для создания банков генов.

Литература

Основная:

1.Егорова биотехнологии. М., Академия, 2003.

2. А. Биотехнология высших растений. СПб., изд. С.-Петербургского ун-та, 2003.

3.Глик, Б. Молекулярная биотехнология: принципы и применения. М., Мир, 2002.

4. , Жаринов А.И. Прикладная биотехнология. ВГТА, 2001.

5.Геном, клонирование, происхождение человека. Фрязино, Век 2, 2004.

6. Валиханова растений. Алматы, Тонжик, 2005.

7. Комов . Учебник для студ. вузов по направлению Биотехнология. М., Дрофа,2004.

Дополнительная:

1. Тасекеев, ология и экология. Алматы: НЦ НТИ РК, 2008.

2. Плакунов В. К. Основы энзимологии. М., Логос, 2002.

3.Биотехнология сельскохозяйственных растений. Москва,1997.

4. Биохимия растений. Ростов н/ Д., Феникс, 2004.

5. Биохимия и молекулярная биология. Минск, Книжный Дом, 2004.

6. Кузнецов я растений. М., Высш. шк., 2005.

7. , Челомбитько . СПб., СпецЛит : СПХФА, 2003.

8. , Самуилов . Учебное пособие для вузов в 8 кн. М., Высшая школа, 1987. Электронный учебник.

9. Бутенко клеток высших растений in vitro и биотехнологии на их основе. М., ФБК-ПРЕСС, 1999г. Электронный учебник.

10.Уотсон Дж.. Туз Дж., Рекомбинатные ДНК. М: МИР,1986.

11.Пирузян генетической инженерии растений. М: Наука,1988.