Министерство образования и науки Республики Казахстан
Евразийский национальный университет имени
УДК 577.12:577.122 На правах рукописи
ЖЫЛКИБАЕВ АСЫЛБЕК АЙТАНУЛЫ
Изучение динамики импорта веществ в ядро клеток млекопитающих посредством mTOR комплекса
6D060700 – «Биология»
Краткая аннотация
диссертации на соискание ученой степени
доктора философии (PhD)
Научные консультанты:
академик НАН РК, д. б.н., профессор
PhD, профессор
Республика Казахстан
Астана, 2014
Работа была выполнена на базе НИИ Клеточной биологии и биотехнологии Евразийского национального университета им. (Астана, РК) и Онкологического центра им. , Техасского университета (Хьюстон, Техас, США)
Научные консультанты:
академик НАН РК, д. б.н., профессор Берсимбай Рахметкажы Искендирович,
PhD, профессор Сарбасов Дос Джурмаханбетович
Рецензенты:
– кандидат биологических наук по специальности 03.00.04 – биотехнология, доцент кафедры микробиологии и биотехнологии КазАТУ им. С. Сейфуллина (г. Астана).
Масалимов Жаксылык Каирбекович – кандидат биологических наук по специальности 03.00.04 - биохимия, PhD по специальности 03.00.01 - биология, доцент кафедры Управления и инжиниринга в сфере охраны окружающей среды ЕНУ им. (г. Астана).
Защита состоится « 19 » декабря 2014 года в 12.00 часов на заседании диссертационного «6D060700 – Биология» при Евразийском национальном университете им. , главный корпус, зал заседаний Диссертационного совета, ауд. 302.
С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Евразийского национального университета им.
АННОТАЦИЯ
диссертации Жылкибаева Асылбека Айтанулы по теме «Изучение динамики импорта веществ в ядро клеток млекопитающих посредством mTOR комплекса» на соискание ученой степени доктора философии (PhD) по специальности «6D060700 - Биология»
Актуальность темы. Одной из актуальных задач современной клеточной биологии является регулирование сигнальных путей ядерно-цитоплазматических взаимодействий. Сигнальные пути, регулирующие транспорт белков через мембрану ядра играют важную роль в процессе взаимодействия ядра и цитоплазмы, а также обеспечения морфо-функционального единства клетки.
Известно, что mТОR комплекс интегрирует различные сигналы окружающей среды (наличие питательных веществ, содержание гормонов, факторов роста, цитокинов и т. д.) с целью регулирования клеточного роста и гомеостаза при благоприятных условиях. При неблагоприятных условиях он способствует катаболическим процессам клетки.
Связь между дисфункцией mTOR сигнального путь и патологиями, возникающими в клетке, подчеркивает важность данного сигнального пути в поддержании клеточного гомеостаза. Индукция активности PI3K-mTOR сигнального пути часто характеризуется развитием опухолевых процессов в организме человека и животных. В связи с этим ингибиторы mTOR комплекса активно применяются в направленной химиотерапии многих видов опухолей, таких как: рак легких, рак молочной железы, рак прямой кишки, рак головного мозга, лейкемия, меланома и саркома.
Ранее было определено, что в клетках млекопитающих mTORC1-комплекс регулирует синтез рибосомальных белков и транскрипцию рибосомальной РНК. Однако биогенез рибосом с участием протеинкиназных комплексов до сих пор остается малоизученным и представляет большой интерес для исследователей, так как нарушение регуляции данного процесса может привести к злокачественным новообразованиям в организме человека. Таким образом, детекция ядерной аккумуляции рибосомальных белков в зависимости от активности mTOR-киназного комплекса является актуальным направлением современных биохимических исследований.
Цели и задачи исследования. Целью исследования является изучение механизма регуляции импорта рибосомальных белков в ядро клеток млекопитающих при участии mТОR комплекса.
Задачи исследования:
1. Исследовать локализацию mTOR комплекса в преядерной области оболочки ядра клеток млекопитающих
2. Определить белки, локально взаимодействующие с mTOR комплексом
3. Изучить роль mTOR комплекса в импорте веществ из цитоплазмы в ядро
4. Определить механизм действия mTOR в ядерной оболочке клетки
Научная новизна исследования. Впервые удалось показать неизвестный ранее путь импорта веществ в ядро клеток млекопитающих.
Впервые установлено, что mTOR участвует в регуляции импорта веществ с помощью активирования нуклеопорина – RanBP2 на поверхности ядерной оболочки, благодаря чему индуцируется синтез рибосомальных белков в клетке. Результаты исследования роли комплекса mTOR/RanBP2 в импорте белков из цитоплазмы в ядро могут значительно дополнить карту сигнальных путей контролирующих нуклео-цитоплазматический транспорт.
Результаты ингибирования активности mTOR и отключения гена RanBP2 черезвычайно важны в понимании патологических процессов онкозаболеваний и разработке профилактических препаратов. Сведения о рибосомальных белках rpS3 и rpL26 в ядерной фракции может свидетельствовать о состоянии активности mTOR/RanBP2 и патологическом состоянии клетки.
Определено, что mTOR регулирует импорт веществ в зависимости от цикла деления клеток. Поскольку активация mTOR комплекса происходит, в основном, в фазе деления клеток G1, мы полагаем, что mTOR участвуя в импорте веществ, может индуцировать транспорт рибосомальных белков для роста и развития клеток млекопитающих в этой фазе.
Изучение динамики импорта веществ в ядро клеток млекопитающих опосредованной mTOR комплексом, имеет большое значение для понимания механизмов роста, размножения, миграции, выживания и метаболизма клеток.
Теоретическое и практическое значение работы. Изучение взаимодействия mTOR/RanBP2 имеет фундаментальное значение. Получены данные раскрывающие процессы биогенеза рибосом, так как двунаправленный (двусторонний) транспорт макромолекул, в основном, регулирует процессы биогенеза рибосомных субъединиц. Методологический подход по фракционированию и определению роли mTOR комплекса позволит более детально понять механизм регуляции транспорта веществ.
Основные положения, выносимые на защиту:
Новая функция mTOR комплекса, расположенного в цитоплазматической части ядерной оболочки клеток, описана с использованием метода разделения белков по фракциям (цитоплазма, околоядерная зона, ядро).
Выявлена взаимосвязь mТОR-комплекса в цитоплазматической части ядерной оболочки с нуклеопорином-RanBP2.
Механизм транспорта рибосомальных белков с помощью импортинового белка-импортин В1 зависит от активности преядерного mТОR комплекса.
Методом синхронизации цикла деления клеток выявлено участие mTOR комплекс в перемещении белков в динамическом импорте веществ в ядро клеток.
Апробация работы. Основные положения диссертационной работы были апробированы и доложены на международных конференциях: XХI Международная научная конференция студентов, аспирантов, молодых ученых «Ломоносов - 2014» (г. Москва, Россия, 2014 г.), Международная конференция «Биотехнология в ХХІ веке» (г. Астана, Казахстан, 2014 г.), Международная конференция «Современные тенденции в науке и образовании» (г. Ольштен, Польша, 2014 г.), Первый всероссийский симпозиум «Новейшие методы клеточных технологий в медицине» (г. Новосибирск, Россия, 2014 г.).
Результаты диссертационной работы. По материалам диссертации опубликовано 9 работ, из них: 2 статьи в международных изданиях, входящих в базу данных Scopus и Thomson Reuters – Journal of Biological Chemistry (импакт фактор -2013г: 4,6), Oncotarget (импакт фактор – 2013г: 6,6), 3 научные статьи в изданиях, рекомендованных Комитетом по контролю и аттестации в сфере образования и науки МОН РК (Вестник КазНУ им. Аль-Фараби, Вестник ЕНУ им. ), 4 работы в материалах международных конференции.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, литературного обзора, материалов и методов исследования, результатов и обсуждения, выводов, заключения и списка использованной литературы из 192 наименований. Текст изложен на 93 страницах. Работа содержит 39 рисунков, 3 таблицы.
«6D060700 - Биология» мамандығы бойынша философия докторы (PhD) ғылыми дәрежесін алу үшін ұсынылған ұлының «mTOR комплексі арқылы сүтқоректілер жасушаларының ядросына заттардың импортталу динамикасын зерттеу» атты диссертациясына
АҢДАТПА
Зерттеу тақырыбының өзектілігі. Қазіргі замаңғы жасушалық биологияның өзекті мәселелерінің бірі, ядролы-цитоплазмалық қатынастың сигналдық жолдарының реттелуі болып табылады. Ядро мембранасы арқылы ақуыздардың тасымалын реттеуші сигналдық жолдар ядро мен цитоплазманың қатынасу процесстерінде, сондай-ақ жасушаның морфофункционалды тұтастығын қамтамасыз етуде маңызды рөл атқарады.
Белгілі болғандай, mТОR комплексі қоршаған ортаның түрлі сигналдарын (қоректік заттардың, өсу факторларының, гормондардың, цитокиндердің және т. б. болуы) қолайлы жағдайда жасушаның өсуі мен гомеостазын реттеу үшін үйлестіреді. Қолайсыз жағдайда ол жасушадағы катаболикалық процесстерге әрекеттеседі.
Жасушада өтетін mTOR-дың әрекетсіздігі мен патологиялар арасындағы байланыс, бұл сигналдық жолдың жасушалық гомеостазды қалыпты ұстап тұрудағы маңызына ерекше көңіл аудартады. PI3K-mTOR сигналдық жолдың жоғарылатылған белсенділігі адам ағзасындағы ісік процесстерінің дамуымен жиі сипатталады. Сондықтан mTOR комплексінің баяулатқыштары ісіктердің көптеген түрлеріне бағытталған химиотерапияда қолданылады. Олардың ішінде: өкпе ісігі, сүт безі ісігі, тік ішек ісігі, бас миы ісігі, лейкемия, меланома және саркома.
Ертерек анықталғандай, сүтқоректілер жасушаларында mTORC1-комплексі рибосомалық РНҚ транскрипциясын және рибосомалық ақуыздардың синтезін реттеуге қатысады. Бірақ протеинкиназды комплекстердің қатысуымен өтетін рибосомалардың биогенезі аз зерттеліп, зерттеушілер үшін қызығушылық тудырады. Өйткені бұл процесстің реттелуінің бұзылуы адам ағзасында кеселді жаңа түзілістерге алып келуі мүмкін. Осыған орай, mTOR-киназды комплекстің белсенділігіне тәуелді рибосомалық ақуыздардың ядролық шоғырлануын анықтау, қазіргі замандағы биохимиялық зерттеулердің өзекті бағыты болып табылады.
Жұмыстың мақсаты мен міндеттері. Зерттеудің мақсаты, mТОR комплексінің қатысуы арқылы сүтқоректілердің жасушаларының ядросына рибосомалық ақуыздардың импортының реттелу механизмін зерттеу болып табылады.
Зерттеу міндеттері:
1. Сүтқоректілер жасушаларында mTOR комплексінің ядро қабықшасының бетінде оқшаулануын зерттеу
2. mTOR комплексімен жергілікті түрде әрекеттесетін ақуыздарды анықтау
3. Цитоплазмадан ядроға заттардың импортында mTOR комплексінің рөлін зерттеу
4. Жасушалардың ядролық қабықшасында mTOR-дың әрекет ету механизмін анықтау
Зерттеудің ғылыми жаңалығы. Осыған дейін белгісіз болған сүтқоректілердің жасушаларының ядросына заттардың импортталу жолы ең алғаш рет көрсетілді.
mTOR заттардың импортталуын реттеуге RanBP2 – нуклеопоринін белсендендіру арқылы қатысатындығы ең алғаш рет орнатылды. mTOR/RanBP2 комплексінің рөлін зерттеу нәтижелері нуклео-цитоплазмалық тасымалды бақылаудағы сигналдық жолдардың картасын толтыруға үлес қосады.
Результаты ингибирования активности mTOR активтілігін баяулату мен RanBP2 генін өшіру бойынша нәтижелер алдын алу препараттарын өңдеуде және ісік ауруларының патологиялық процесстерін түсінуде маңызы зор. Ядролық фракциядағы rpS3 және rpL26 рибосомалық ақуыздары жөніндегі мәлімет mTOR/RanBP2 белсенділік жағдайына және жасушаның патологиялық жағдайына дәлел болады.
Сондай–ақ алғаш рет жасушалардың бөліну циклына қарай mTOR заттардың импортталуын реттейтіндігі орнатылды. Өйткені mTOR комплексінің белсенденуі негізінен жасушалардың G1 бөліну фазасында өтеді. Біздің пайымдауымызша, mTOR заттардың импортына қатыса отырып, бұл фазада сүтқоректілердің жасушалары өсуі мен дамуына қажетті рибосомалық ақуыздардың тасымалдануын индукциялауы мүмкін.
mTOR комплексі арқылы сүтқоректілердің ядросына заттардың импортталу динамикасын зерттеу өсу, көбею, көшу және жасушалардың метаболизмі механизмедерін түсінуде маңызы зор.
Жұмыстың теоретиялық және практикалық маңызы.
Заттардың екі бағытты (екі жақты) тасымалы рибосомалық суббірліктердің биогенезі үрдістерін реттейтіндіктен, көрсетілген mTOR/RanBP2 қатынасының рибосомалардың биогенезі процесстерін айғақтауда іргелі құндылығы бар. Алынған нәтижелер, mTOR комплексі арқылы жасушалардың ядросына ақуыздардың импортталу процессінің реттелуін түсінуге жол ашады. Фракциялау және mTOR комплексінің рөлін анықтау бойынша әдістемелік амалды пайдалану, заттардың тасымалы процессінің реттелу механизмін толық тануға мүмкіндік береді.
Қорғауға шығарылатын негізгі қағидалар:
Фракциялар бойынша ақуыздарды бөлу (цитоплазма, ядеро айналасындағы аймақ, ядро) әдісін қолдану, жасушалардың ядро қабықшасының перинуклеарлы аймағының цитоплазмалық бөлігінде орналасқан жаңа mTOR комплексінің қызметін дәлірек суреттеуге жол ашты. Ядролық қабықшаның цитоплазмалық бөлігіндегі mТОR-комплексі мен RanBP2-нуклеопоринінің арасында қатынас анықталды.
Импортин В1 – импортиндік ақуызы көмегімен рибосомалық ақуыздардың тасымалы ядро айналасындағы mТОR комплексінің белсенділігіне тәуелді болатындығы орнатылды.
Жасушалардың бөліну циклын синхрондау әдісі, ақуыздар мен нуклейн қышқылдарының ауысу сигналдарын жасуша ядросына импортталу динамикасында анықтауға мүмкіндік берді. Рибосомалық ақуыздардың импорты mTOR комплекстің қатысуымен өтетіндігі көрсетілген.
Диссертациялық жұмыстың нәтижелері. Диссертациялық жұмыс материалдары бойынша 9 жұмыс жарияланды, Олардың ішінде: 2 мақала Scopus және Thomson Reuters мәліметтер базасына кіретін – Journal of Biological Chemistry (импакт факторы -2013ж: 4,6), Oncotarget (импакт факторы – 2013ж: 6,6) халықаралық басылымдарда, 3 ғылыми мақала ҚР БҒМ Білім және ғылым саласындағы бақылау және аттестаттау комитеті ұсынған басылымдарда, 4 жұмыс халықаралық конференциялар материалдарында: XХI Студенттер мен жас ғалымдардың халықаралық конференциясы «Ломоносов - 2014» (Мәскеу қ., Ресей, 2014ж.), «Биотехнология в ХХІ веке» Халықаралық конференция (Астана қ., Казақстан, 2014ж.), «Современные тенденции в науке и образовании» Халықаралық конференция (Ольштен қ., Польша, 2014ж.), «Новейшие методы клеточных технологий в медицине» Бірінші бүкілресейлік симпозиум (Новосібір қ., Ресей., 2014ж.). жарық көрді
Диссертацияның құрылымы мен көлемі. Диссертация кіріспе, әдеби шолу, зерттеу материалдары мен әдістері, нәтижелер мен талқылау, қорытынды және қолданылған әдебиеттер тізімінен тұрады. Зерттеуде 191 әдебиет атауы қолданылды. Мәтін 93 бетте баяндалған. Жұмыстың құрамында 39 сурет, 3 кесте бар.
ANNOTATION
for dissertation of Zhylkibayev Assylbek Aytanuly titled “Studying the dynamics of the import of substances into the nucleus of mammalian cells through mTOR complex” for the degree of Doctor of Philosophy (PhD) in the specialty “6D060700-Biology”.
Importance of the topic. One of the actual problems of modern cell biology is the regulation of the signaling pathways of nuclear-cytoplasmic interactions. Signaling pathways that regulates protein transport through the membrane of the nucleus play an important role in the interaction of the nucleus and the cytoplasm, as well as provide morphological and functional integrity of the cells.
It is known that mTOR complex integrates different environmental cues (availability of nutrients, the content of hormones, growth factors, cytokines, etc.) in order to regulate cell growth and homeostasis in favorable conditions. It promotes catabolic processes of the cell in unfavorable conditions
The connection between mTOR dysfunction and pathology occurring in the cell highlights the importance of this signaling pathway in the maintenance of cellular homeostasis. Increased activity of the PI3K/mTOR signaling pathway has often been associated with the development of neoplastic processes in the human body. Therefore inhibitors of mTOR complex are used in targeted molecular chemotherapy for many kinds of tumors, such as lung cancer, breast cancer, colon cancer, brain cancer, leukemia, melanoma and sarcoma.
Previously it was determined that in mammalian cells mTORC1-complex regulates the synthesis of ribosomal proteins and ribosomal RNA transcription. However, ribosome biogenesis involving protein kinase complexes remains poorly understood and it is the great interest to researchers, as dysregulation of this process may lead to malignant neoplasms in humans. Thus, detection of nuclear accumulation of ribosomal proteins, depending on the activity of mTOR-kinase complex is the actual direction of modern biochemical research.
Aim and tasks. The aim of the study was to examine mechanism of regulation of the import of ribosomal proteins into the nucleus of mammalian cells with the participation of mTOR complex.
The study tasks:
1. To study mTOR complex localization in the area of cytoplasmic interphase of the nuclear membrane in mammalian cells
2. To identify proteins locally interacting with mTOR complex
3. To study the role of mTOR complex in the import of substances from the cytoplasm to the nucleus
4. To establish the mechanism of mTOR activity in the nuclear membrane in the cells.
The scientific novelty of the study. For the first time were able to show a previously unknown way of import of substances in the nucleus of mammalian cells. In our study, it was established that mTOR is involved in the regulation of import agents via activation nucleoporin – RanBP2 on the surface of the nuclear envelope, whereby controls synthesis of a ribosomal protein in the cell. Results of the study of the role of mTOR/RanBP2 complex in the import of proteins from the cytoplasm to the nucleus can significantly complement the map of signaling pathways controlling nucleus-cytoplasmic transport.
The results of inhibition of mTOR or knockdown of RanBP2 gene, extremely important in the understanding of pathological processes in cancer and the development of preventive drugs. Information about the ribosomal proteins rpL26 and rpS3 in the nuclear fraction can be the indicator of the state of mTOR/RanBP2 complex activity and pathological state of the cell.
We have determined that mTOR regulates the import agents depending on the cycle of cell division. Since the activation of mTOR complex occurs mainly in the G1 phase of cell division, we believe that the mTOR participating in import of substances can induce transport of ribosomal proteins for growth and development of mammalian cells in this phase.
Studying the dynamics of import of the substances into the nucleus of mammalian cells mediated mTOR complex. It is important for understanding the mechanisms of growth, proliferation, reproduction, migration, survival, and cell metabolism.
Theoretical and practical significance of the work. Study of the mTOR – RanBP2 interaction has fundamental significance. The data revealed the processes of ribosome biogenesis, as a bi-directional (two-way) transport of macromolecules, mainly regulates the processes of biogenesis of ribosomal subunits. Methodological approaches as cellular fractionation and determination of the role of mTOR complex will provide more detailed understanding in the regulation mechanism of the substance transport.
Basic provisions for the dissertation work: New feature of mTOR complex located in the cytoplasmic interphase of the nuclear membrane of cells is described using the method of separation of protein fractions (cytoplasm, nuclear area, the nucleus). The interrelation of mTOR complex in the cytoplasmic portion of the nuclear envelope with nucleoporin-RanBP2. The mechanism of transport of ribosomal proteins by import protein importin-B1 depends on the activity of nuclear mTOR complex. The method of synchronization of cell division cycle revealed the involvement of mTOR complex in the movement of proteins in a dynamic import of substances in the cell nucleus.
Approbation of work. The main provisions of the thesis have been tested and reported at international conferences: XXI International Scientific Conference of students, young scientists “Lomonosov – 2014” (Moscow, Russia, 2014), International Conference “Biotechnology in the XXI Century” (Astana, Kazakhstan, 2014), International Conference “Modern Trends in Science and Education” (St. Olshten, Poland, 2014), the First All-Russian Symposium “New methods of cell technologies in medicine” (Novosibirsk, Russia, 2014).
The results of the dissertation research. 9 papers have been published according to the materials of the dissertation, including 2 articles in international journals listed in the database of Scopus and Thomson Reuters – Journal of Biological Chemistry (Impact Factor -2013: 4,6), Oncotarget (Impact Factor - 2013: 6.6 ), 3 scientific articles in journals recommended by the Committee for Control and Certification of Education and Science of MES RK (Journal of Kazakh National University named after al-Farabi, journal of ENU named after L. N. Gumilyov) 4 works in the proceedings of international conferences.
Structure and volume of dissertation. The dissertation consists of an introduction, literature review, materials and methods, results and discussion, summary, conclusions and bibliography of 192 titles. The text is set out on pages 93. The paper contains 39 figures, 3 tables.
Список научных трудов
Публикации в зарубежных изданиях, входящих в международные базы научных журналов и имеющие ненулевой импакт-фактор.
1. C-H. Chen, V. Kiyan, A. Zhylkibayev, D. Kazyken, O. Bulgakova, K. Page, R. Bersimbaev, E. Spooner, D. Sarbassov. Autoregulation of the Mechanistic Target of Rapamycin (mTOR) Complex 2 Integrity Is Controlled by an ATP-dependent Mechanism. //Journal of Biological Chemistry.-Vol.288-№38.-P., IF-4,65
2. D. Kazyken, Y. Kaz, V. Kiyan, A. Zhylkibayev, C-H. Chen, N. Agarwal, D. Sarbassov. The nuclear import of ribosomal proteins is regulated by mTOR. //Oncotarget.-Vol.5.-№20.-P., IF-6,6
Публикации в изданиях рекомендованных Комитетом по контролю в сфере образования и науки МОН РК.
1. Выявление влияния мТОР комплекса на транспорт рибосомальных белков при питательном истощении. //Вестник. Серия биологическая.- Алматы: КазНУ, 2014.-№1/1.-С.30-32
2. , , Роль mTOR комплекса в регулировании импорта рибосомальных белков. //Вестник.-Астана: ЕНУ им .-2014.-№4.- С.211-218
3. , Определение взаимодействия mTOR комплекса с белком ядерной поры RanBP2. //Вестник.-Астана: ЕНУ им .-2014.-№2.-С.234-238
Публикации в материалах республиканских и международных конференций.
1. , , RanBP2-mTOR зависимый транспорт через ядерную мембрану с участием импортиновых белков. //Современные тенденции в науке и образовании: Международная научно-практическая конференция: г. Ольштен, Польша.-2014г.-С.7-9
2. Участие мТОР комплекса в импорте рибосомальных белков в ядро клеток млекопитающих. //Ломоносов-2014: Материалы XХI международной научной конференции студентов, аспирантов, молодых ученых.-Москва.-2014г.-С.55-56
3. Регуляция импорта рибосомальных белков из цитоплазмы в ядро клеток эукариот. //Биотехнология в ХХІ веке: Международная конференция.-г. Астана.-2014г.-С.90-94
4. , Берсимбаев mTORC1 комплекса в регуляции баланса глюкозы в опухолевых клетках. //Новейшие методы клеточных технологий в медицине: Материалы симпозиума.-г. Новосибирск.-2014г.-С.69
Научная публикация
ЖЫЛКИБАЕВ АСЫЛБЕК АЙТАНУЛЫ
Изучение динамики импорта веществ в ядро клеток млекопитающих посредством mTOR комплекса
Аннотация на диссертацию на соискание ученой степени «доктор философии» (PhD) по специальности 6D060700 «Биология»
