МІНІСТЕРСТВО ОСВІТИ І НАУКИ УКРАЇНИ
Дніпропетровський національний університет імені Олеся Гончара
Наукова робота
на здобуття щорічної премії Президента України
для молодих вчених
АКТИВНІСТЬ АНТИОКСИДАНТНИХ ФЕРМЕНТІВ ТА ІНТЕНСИВНІСТЬ ОКСИДАТИВНОГО СТРЕСУ ПРИ ЗАСТОСУВАННІ КЛАСТЕРНИХ СПОЛУК РЕНІЮ З АЛКІЛЬНИМИ ЛІГАНДАМИ ЯК ПРОТИПУХЛИННИХ ЗАСОБІВ
ЛЕУС Інга Володимирівна – | кандидат біологічних наук,молодший науковий співробітник науково-дослідної лабораторії біохімії НДІ біології ДНУ ім. Олеся Гончара |
Реферат
2014
Актуальність теми. Останнім часом широке розповсюдження набуває ідея окисно-відновної хіміотерапії (Fruehauf J. P., 2007; Wondrak G. T., 2009). Особливістю ракових клітин є високий рівень оксидативного стресу та активних форм кисню (Cabello C. M., 2007; Fruehauf J. P., 2008). Отже, редокс стан ракової клітини може бути мішенню прямої чи непрямої дії про - та антиоксидантів і окисно-відновних модуляторів, які представляють новий клас перспективних протипухлинних агентів (Cabello C. M., 2007; Laurent A., 2005; Trachootham D., 2008). Позитивні якості металоорганічних сполук, а саме – окисно-відновна активність атома металу, можливість сконструювати органічні ліганди з необхідними властивостями (певною структурою, певною довжиною ланцюга та ін.) є основою розробки нових малотоксичних та біологічно активних металоорганічних сполук (Casini A., 2006; Devereux M., 2007; Howard R. A., 1976; Marcon G., 2003; Trynda-Lemiesz L., 2000; Wondrak G. T., 2009; Zhang C. X., 2003). У попередніх роботах кафедри біофізики та біохімії Дніпропетровського національного університету було представлено нову протипухлинну систему Реній-Платина (Re-Pt), застосування якої у моделі пухлинного росту призводило до ефективного гальмування новоутворення (Shtemenko N., ). Оскільки усі досліджені сполуки Ренію ефективно гальмували ріст пухлини, було зроблено висновок, що провідна роль у механізмі протипухлинної активності належить кластерному фрагменту Re-Re з почверним зв’язком – загальному структурному елементу вивчених сполук. У продовження цих робіт було поставлене запитання: чи відіграє роль у прояві активності кластерних сполук Ренію довжина алкільного радикалу у молекулі цис-дикарбоксилатів диренію. У зазначених вище роботах, а також у дослідженнях інших авторів (Bruijnincx P. C., 2008; Novo E., 2008; Wondrak G. T., 2009; Zhang C. X., 2003), присвячених біохімії редокс системи клітини і організму, підкреслювалось, що антиоксидантні властивості препаратів можуть відігравати вирішальну роль у кореляції патологічних станів, в тому числі і в протипухлинній терапії. В експериментах in vitro була показана залежність швидкості реакції взаємодії кластерних сполук Ренію зі стабільними радикалами від структури сполук цього елементу (Shtemenko O. V., 2008). Отже, постає актуальною задачею встановлення можливої залежності антирадикальної активності та антиоксидантних властивостей сполук Ренію від їх структури. Біологічна активність сполук Ренію транс-конфігурації не вивчалася, отже порівняльне дослідження цис- і транс-дикарбоксилатів диренію як протипухлинних агентів, антигемолітиків та антиоксидантів in vivo та in vitro є перспективним напрямком біохімічних досліджень, оскільки конструювання нових ефективних антиракових засобів є однією із найактуальніших задач XXI сторіччя. Супероксиддисмутаза належить до найважливіших ензимів антиоксидантного захисту (Turrens J. F., 2010; Young I. S., 2001). Відомо також, що деякі металоорганічні сполуки мають власну супероксиддисмутазну активність (Gonzalez-Alvarez M., 2003; Riley D. P., 1999; Zhang C. X., 2003). Тому визначення прояву супероксиддисмутазної активності сполук Ренію або їхній безпосередній вплив на активність ензиму in vitro є дуже актуальним питанням. Вивчення взаємодії білкових молекул з металоорганічними сполуками in vitro має і практичне значення, оскільки висвітлює шляхи створення кон’югатів – синтетичних протеїдів, які вже знаходять використання в медичній практиці (Sakhno L. A., 2005).
Мета та завдання дослідження. Мета роботи – дослідження впливу цис- і транс-дикарбоксилатів диренію з алкільними лігандами на інтенсивність оксидативного стресу, активність каталази, супероксиддисмутази та морфологічні і біохімічні характеристики еритроцитів при розвитку пухлини щурів за їхнього введення окремо та у системі Реній-Платина, а також дослідження взаємодії сполук Ренію цис- і транс-конфігурації з альбумінами і супероксиддисмутазою.
Відповідно до мети було поставлено наступні завдання:
1. Дослідити протипухлинну активність сполук Ренію різної конфігурації та встановити залежність між довжиною алкільного радикалу і ефективністю сполук як протипухлинних агентів.
2. Вивчити вплив цис- і транс- дикарбоксилатів диренію на морфологічні і біохімічні характеристики еритроцитів, інтенсивність перекисного окиснення ліпідів та активність супероксиддисмутази і каталази.
3. Методами триптофанової і тирозинової флуоресценції та кругового дихроїзму дослідити механізм взаємодії сполук Ренію цис- і транс- конфігурації з сироватковими альбумінами і супероксиддисмутазою in vitro.
4. На модельній ксантин-ксантиноксидазній системі визначити швидкість реакції між супероксиддисмутазою і супероксид-аніоном у присутності цис- і транс- дикарбоксилатів диренію та супероксиддисмутазо-подібну активність сполук Ренію.
Методи дослідження – біохімічні: фотоколориметричне та спектрофотометричне визначення вмісту ТБК-активних сполук, гемоглобіну, активності ензимів антиоксидантного захисту, цитохімічний та флуоресцентний аналіз, методи кругового дихроїзму та математичної статистики.
Наукова новизна одержаних результатів. Вперше показано, що дикарбоксилати диренію транс- і цис- ряду мають протипухлинну активність при окремому введенні щурам-пухлиноносіям і ефективно знижують ріст пухлини у складі системи Реній-Платина. Встановлена залежність між довжиною радикалу та ефективністю сполук як протипухлинних агентів, що особливо виявляється при введенні сполук з цисплатином, де можна побудувати ряд алкільних радикалів у складі сполук за впливом на розмір остаточної пухлини. Знайдено, що дикарбоксилати диренію цис-конфігурації здатні до відновлення системи червоної крові та гальмування процесу перекисного окиснення, що порушуються при розвитку пухлини і введенні цисплатину, незалежно від довжини алкільного радикалу при різних способах введення. Натомість, введення дикарбоксилату диренію транс-конфігурації сприяє погіршенню морфологічних характеристик еритроцитів. Вперше показана залежність між структурою дикарбоксилатів диренію та їхньою здатністю до активації еритроцитарної супероксиддисмутази у моделі пухлинного росту – введення цис-дикарбоксилатів збільшувало активність супероксиддисмутази зі зростанням довжини алкільного радикалу. Вперше було доведено, що in vitro сироваткові альбуміни взаємодіють зі сполуками Ренію із зміною нативної конформації в залежності від конфігурації сполуки Ренію. Було з’ясовано, що сполуки Ренію цис- і транс- конфігурації взаємодіють in vitro з еритроцитарною супероксиддисмутазою та змінюють вторинну структуру протеїну, що не впливає на активний центр ферменту. Вперше знайдено супероксиддисмутазо-подібну активність цис-дикарбоксилатної сполуки Ренію. Запропоновано можливий механізм різного впливу цис- і транс-дикарбоксилатів диренію на редокс статус організму.
Практичне значення одержаних результатів. Отримані результати становлять теоретичну основу спрямованого синтезу протипухлинних препаратів на основі кластерних сполук Ренію. Показано перевагу дикарбоксилатів диренію цис-конфігурації у порівнянні з транс-дикарбоксилатами диренію щодо гальмування росту новоутворення і одночасним збереженням системи еритрону. Розроблено методологію дослідження протипухлинних засобів, яка включає контроль за станом системи червоної крові. Результати досліджень впроваджені в науково-дослідну діяльність студентів, аспірантів, здобувачів; при викладанні загальних лекційних курсів «Біохімія», «Біоорганічна хімія» і спецкурсів: «Біологічно активні сполуки», «Фізико-хімічні методи», «Біохімія ксенобіотиків».
Апробація результатів роботи. Матеріали, викладені в роботі, було представлено на 31-му конгресі FEBS “Molecules in health & disease” (Istanbul, Turkey, 24-29 june 2006), IX Українському біохімічному з’їзді (Харків, 24-27 жовтня 2006 р.), 2-му з’їзді Українського товариства клітинної біології (Київ, 23-26 жовтня 2007 р.), на міжнародній конференції „Metal Ions in Biology and Medicine” (Корсіка, Франція, травень 2008), Всеукраїнській науковій конференції з міжнародною участю „Актуальні проблеми сучасної біохімії та клітинної біології” (Дніпропетровськ, 30-31 жовтня 2008 р.), на Х Українському біохімічному з’їзді (Одеса, 13-17 вересня 2010 р.), Міжнародній науково-практичної конференції «Теоретические и прикладные проблемы современной науки и образования» (Курськ, Росія, 31 марта – 1 квітня 2011 р.), на VI Всеукраїнській студентській науковій конференції «Сучасні проблеми природничих наук» (Ніжин, 5-6 квітня 2011 р.), на I Всеукраїнському форумі студентів, аспірантів і молодих учених «Україні XXI сторіччя – інтелект і творчість молоді» (Дніпропетровськ, 14-15 квітня 2011 р.), NATO Advanced research workshop (ARW) “Environmental and food security and safety in southeast Europe and Ukraine” (Дніпропетровськ, 15-19 травня 2011р.), XVIII Українській конференції з неорганічної хімії за участю закордонних учених в рамках Міжнародного року хімії ООН (Харків, 27 червня – 1 липня 2011 р.), ІІ міжнародній конференції студентів, аспірантів та молодих учених „Фундаментальні та прикладні дослідження в біології” (Донецьк, 19-22 вересня 2011р.), на семінарі «Актуальні проблеми сучасної біохімії» Iнситуту біохімії ім. іна НАН України (Київ, 6 грудня 2011р.), на Х Міжнародній науковій конференції студентів та молодих науковців «Шевченківська весна» (Київ, 19-23 березня 2012), на VIII Міжнародній науковій конференції студентів та аспірантів «Молодь і поступ біології» (Львів, 3-6 квітня 2012).
Висновки. Показано, що сполуки ряду цис-дикарбоксилатів диренію здатні пригнічувати розвиток пухлини, покращувати морфологічні та біохімічні характеристики еритроцитів і впливати на активність ензимів антиоксидантного захисту, параметри оксидативного стресу крові у моделі канцерогенезу щурів при їхньому окремому введенні та разом з цисплатином, а також вивчено взаємодію сполук диренію цис- і транс- конфігурації з альбумінами і супероксиддисмутазою in vitro та показано їхній вплив на конформацію протеїнів й ензиматичну активність.
1. Вперше показано, що дикарбоксилати диренію транс- і цис- ряду мають протипухлинну активність при окремому введенні щурам-пухлиноносіям (до 30,1%) та ефективно знижують ріст пухлини (на 78,2-99,9%) у складі системи Реній-Платина. Встановлена залежність між довжиною радикала та ефективністю сполук як протипухлинних агентів, що особливо виявляється при введенні сполук з цисплатином. В останньому випадку можна побудувати ряд алкільних радикалів у складі сполук за впливом на розмір остаточної пухлини у відсотках до контролю: ацетатний (21,8%)< пропіонатний (2,4%)< ізобутиратний (0,5%)< півалатний (0,09%)
2. Знайдено, що дикарбоксилати диренію цис-конфігурації здатні до відновлення морфологічних і біохімічних характеристик еритроцитів (а саме, до зменшення патологічних форм еритроцитів на 93%) та гальмування процесу перекисного окиснення (на 81%), що порушуються при розвитку пухлини і введенні цисплатину, незалежно від довжини алкільного радикалу при різних способах введення. Показано, що введення дикарбоксилату диренію транс-конфігурації у складі системи Реній-Платина супроводжувалося збільшенням патологічних форм еритроцитів (до 38%) у порівнянні з даними для групи пухлиноносіїв.
3. Вперше встановлена залежність між структурою дикарбоксилатів диренію та їхньою здатністю до активації еритроцитарної супероксиддисмутази у моделі пухлинного росту. Так, введення цис-дикарбоксилатів збільшувало активність супероксиддисмутази із збільшенням довжини алкільного радикалу: ацетатний (на 127,8%) < пропіонатний (на 138,4%) < ізобутиратний (на 147,4%) < півалатний (на 171,7%), а введення транс-дикарбоксилатів змінювало активність супероксиддисмутази (на 30-70%), у порівнянні з даними групи щурів-пухлиноносіїв.
4. З використанням методів триптофанової флуоресценції та кругового дихроїзму вперше доведено, що сироваткові альбуміни взаємодіють in vitro зі сполуками Ренію зі зміною нативної конформації в залежності від конфігурації сполуки Ренію.
5. Методами тирозинової флуоресценції та кругового дихроїзму in vitro вперше з’ясовано, що сполуки Ренію цис- і транс- конфігурації взаємодіють з еритроцитарною супероксиддисмутазою та здійснюють практично однакову зміну вторинної структури протеїну: збільшується кількість елементів α-спіралізованої ділянки (на 6-7%) та нерегулярної структури (на 12-13%), і зменшується відсоток елементів β-листа (на 16-18%) та β-вигинів (на 1-3%). Зроблено припущення про приєднання сполук Ренію до гістидинових залишків, що знаходяться на віддалених ділянках білкової молекули від флуорофора Tyr-108.
6. Шляхом застосування модельної ксантин-ксантиноксидазної ферментативної системи in vitro показано, що швидкість реакції між супероксиддисмутазою та генерованим супероксид-аніоном практично не змінюється у присутності цис-дикарбоксилату диренію та транс-дикарбоксилату (на 6-12%) у порівнянні з нативним ферментом, що свідчить про незначний вплив цих сполук на активний центр ферменту.
7. У модельній системі ксантин-ксантиноксидаза для цис-дикарбоксилату знайдено супероксиддисмутазну активність, яка не є характерною для транс-дикарбоксилату. Вивчені особливості взаємодії сполук Ренію з супероксиддисмутазою in vitro свідчать про те, що знайдені закономірності зміни активності цього ферменту у експериментах in vivo здійснюють певний внесок у феномен активації супероксиддисмутази. Запропоновано можливий механізм різного впливу цис- і транс-дикарбоксилатів диренію на редокс статус організму.
Публікації. За матеріалами наукової роботи опубліковано 20 робіт, серед яких дисертація та 6 статей надруковано у провідних фахових виданнях України і за кордоном.
1. Леус І. В. Активність супероксиддисмутази та інтенсивність оксидативного стресу при застосуванні кластерних сполук ренію з алкільними лігандами як протипухлинних засобів..Автореф. дис. ...к-та біол. наук: 03.00.04. Київ - 2012.- p. 21
2. Використання кластерних сполук ренію з алкільними лігандами у процесі пригнічення росту карциноми Герена / , І. В. Леус, ініч, , Н. І. Штеменко //Вісник Дніпропетровського університету. Біологія. Екологія. – 2008. – Вип.16, т.1. – с.46-50.
3. Вплив структури ліганду на протипухлинні та антиоксидантні властивості кластерних сполук ренію / І. В. Леус, , інна, Н. І. Штеменко //Вісник Дніпропетровського університету. Біологія. Екологія. – 2009. – Вип. 17, т. 3. – с.46–53.
4. Investigation of antioxidant properties of the cluster rhenium compound in the model of tumor growth / I. Leus, E. Zabitskaya, K. Shamelashvili, D. Yegorova, N. Shtemenko //Metal Ions in Biology and Medicine. John Libbey Eurotext. Editors: Philippe Collery, Ivan Maymard, Theophile Theophanides, Lylia Khassanova, Thomas Collery. – 2008, V. 10. – P.399 – 402.
5. Взаємодія сироваткових альбумінів з кластерними сполуками ренію цис - і транс-конфігурації. / І. В. Леус, І. А. Кленіна, , іченко, , Н. І. Штеменко //Біополімери та клітина. – 2011. – т. 27., № 6. – P.465-471.
6. Цитостабілізувальні властивості кластерних сполук ренію у процесі зберігання клітин / І. В. Леус, ілі, , О. І. Ніколенко, Н. І. Штеменко //Вісник Дніпропетровського університету. Біологія. Медицина. – 2011. – Вип.2, т.2. – с.57-63.
7. Антиоксидантна і протипухлинна активність та механізм дії дикарбоксилатів диренію у тварин із карциномою Герена / І. В. Леус, ілі, , іченко, , Н. І. Штеменко //Укр. біохім. журн. – 2012. – т. 84, № 3. – с.87-96.
8. Antioxydant enzymes in blood of tumor-bearing rats. / I. V. Leus, N. I. Stemenko // 31 th International FEBS Meeting. – Istanbul (Turkey), 2006. – P.466.
9. Вплив комплексних сполук ренію з органічними лігандами на активність супероксиддисмутази/ І. В. Леус // Матеріали IX Українського біохімічного з’їзду. – Харків, 2006. – с.79.
10. Зміна активності антиоксидантних ферментів еритроцитів щурів-пухлиноносіїв при дії цитостатиків / І. В.Леус, Н. І.Штеменко //2-ий з’їзд українського товариства клітинної біології. Збірник тез. – Київ, 2007. – с.70.
11. Ферменти антиоксидантного захисту у моделі пухлинного росту / К.Л. Шамелашвілі, О.Д. Жабіцька, І.В. Леус, Н.І. Штеменко //Матеріали Всеукраїнської наукової конференції з міжнародною участю [„Актуальні проблеми сучасної біохімії та клітинної біології”], (Дніпропетровськ, 30-31 жовтня 2008р.). – Дніпропетровськ, Україна. – С.73-А.
12. Вплив структури ліганду на протипухлинні та антиоксидантні властивості кластерних сполук ренію / І. В. Леус, Н. І. Штеменко // Матеріали Х Укр. Біохім. З’їзду 13-17 вересня 2010 р., м. Одесса, УБЖ, 2010., – т.82, №4. – с.88.
13. Интенсивность оксидативного стресса при торможении опухолевого роста соединениями рения. / , , , Е. Николенко //Теоретические и прикладные проблемы современной науки и образования, Материалы международной научно-практической конференции, Ч.1., – Курск, 2011. – с.238-242.
14. Активність супероксиддисмутази та інтенсивність оксидативного стрессу при застосуванні кластерних сполук ренію з алкільними лігандами як протипухлинних засобів/ І. В. Леус //Матеріали I Всеукраїнського форуму студентів, аспірантів і молодих учених, [“Україні XXI сторіччя – інтелект і творчість молоді”]. – Дніпропетровськ, 2011. – с.292-295.
15. Цитостабілізуючі властивості кластерних сполук ренію / І. В. Леус, ілі, Н. І. Штеменко //Матеріали VI Всеукраїнської студентскої наукової конференції [“Сучасні проблеми природничих наук”], – Ніжин, 2011. – с.76-77.
16. Mechanism of oxidative stress as a nonspecific replay on exogenous influence / O. Skorik, I. Leus, K. Shamelashvili, N. Shtemenko //NATO Advanced research workshop (ARW) [“Environmental and food security and safety in southeast Europe and Ukraine”], Scientific program and abstracts, – Dnipropetrovs’k, Ukraine, 2011. – p.79.
17. Взаимодействие изомерных тетрахлороди-µ-изобутиратов и дихлоротетра-µ-изобутирата дирения (III) с сывороточным альбумином / , , , , //XVIII Українська конференція з неорганічної хімії за участю закордонних учених в рамках Міжнародного року хімії ООН, – Харків, 2011. – с.82.
18. Вплив кластерних сполук ренію на властивості Cu, Zn-супероксиддисмутази / І. В. Леус, Н. І. Штеменко //Матеріали ІІ міжнародної наукової конференції студентів, аспірантів та молодих учених [“Фундаментальні та прикладні дослідження в біології”], – Донецьк, 2011. – c.231.
19. Активність супероксиддисмутази при взаємодії з кластерними сполуками ренію у цис - і транс-конфігурації in vivo та in vitro / І. В. Леус, Н. І. Штеменко // Матеріали Х Міжнародної наукової конференції студентів та молодих науковців [“Шевченківська весна 2012”], – Київ, 2012. – с.183-184.
20. Вплив алкільних лігандів цис-дикарбоксилатів диренію на антиоксидантну систему щурів при розвитку новоутворення / І. Леус, О. Ніколенко, К. Шамелашвілі, О. Скорик, Н. Штеменко //VIII Міжнародна наукова конференція студентів та аспірантів “Молодь і поступ біології”. Збірник тез, – Львів, 2012. – с.60-61.
