Костянець Ольга Іванівна (Київський національний університет імені Тараса Шевченка )
Біологія та біотехнології: біологія
ІДЕНТИФІКАЦІЯ ПУХЛИНОАСОЦІЙОВАНИХ АНТИГЕНІВ МЕДУЛЯРНОЇ КАРЦИНОМИ МОЛОЧНОЇ ЗАЛОЗИ ЗА ДОПОМОГОЮ МОДИФІКОВАНОГО SEREX-АНАЛІЗУ
Рак молочної залози одна з найпоширеніших неопластичних патологій серед жінок. Щорічно реєструють близько 750 000 нових випадків даного захворювання [1]. Рак молочної залози належить до пухлин, з повільним прогресуванням, часто клінічні симптоми проявляються на пізніх стадіях розвитку пухлини, метастази з’являються навіть через десятки років. Хоча зустрічаються дуже агресивні форми даного захворювання. Карцинома молочної залози (КМЗ) походить із залозистого епітелію: солідний та муцинозний (колоїдний) рак. Найбільш поширеними гістологічними типами КМЗ є: внутрішньопротоковий рак in situ, лобулярний (дольковий) рак in situ, інвазивний протоковий, інвазивний лобулярний, медулярний, муцинозний, тубулярний [1]. Карцинома – це злоякісна пухлина, що розвивається з клітин епітеліальної тканини різних органів.
Медулярна карцинома молочної залози (МКМЗ) – це вид інвазивної карциноми протоків молочної залози, що зазвичай має хороший прогноз, характеризується низьким рівнем диференціації клітин [2], високим мітотичним рівнем і лімфоцитарною інфільтрацією. МКМЗ презентує від 3-7% [3] всіх видів інвазивних пухлин молочної залози. Виживаність серед хворих з даним типом неоплазії складає 84% терміном до десяти років, в порівнянні з 63% при інших гістологічних типах раку [3]. Медулярна карцинома молочної залози має в 3,2 рази більшу лейкоцитарну інфільтрацію, ніж карцинома протоків молочної залози. Такі фактори ризику як статус лімфатичних вузлів, рецептори до стероїдних гормонів, інвазія чи менопауза, які є важливими при прогнозуванні розвитку раку молочної залози, мають мінімальну прогностичну цініть при МКМЗ [1]. Це говорить про унікальні біологічні особливості цього типу раку. Існує кілька гіпотез сприятливого прогнозу даної неоплазії: 1) посилення апоптичних процесів [3]; 2) підвищена експресія ІСАМ-1, яка є визначальною для міграції лімфоцитів [4]; 3) підвищення рівня антиметастатичних факторів [3]; 4) посилення ефективності імунної відповіді [5].
Відсутність IgA, які домінують в нормальній тканині молочної залози і присутність значної кількості IgG свідчить про антигенспецифічну імунну відповідь [6], [7]. Припускають, що інтенсивна лімфоцитарна інфільтрація зумовлена присутністю специфічного антигену на поверхні трансформованих клітин медулярної карциноми молочної залози. Ідентифікація цих антигенів може забезпечити створення нових терапевтичних та діагностичних підходів для лікування не лише медулярної карциноми, а й інших видів пухлин молочної залози. Нещодавні дослідження антигенного репертуару медулярної карциноми молочної залози показали наявність високоекспресованих пухлиноасоційованих антигенів (ПАА): β-актину [8], гангліозиду D3 [9]. Ці антигени можуть виступати потенційними мішенями для терапії моноклональними антитілами.
Метою нашого дослідження було ідентифікувати нові пухлиноасоційовані антигени медулярної карциноми молочної залози за допомогою модифікованого SEREX-аналізу.
SEREX-аналіз (serological identification of antigen by recombinant expression cloning) дає можливість ідентифікувати імуногенні пухлинні антигени, в тому числі і внутрішньоклітинні, шляхом імуноскринінгу кДНК бібліотек створених на основі мРНК, виділеної з пухлин, аутологічною сироваткою. Протягом останніх кількох років SEREX використовувався для дослідження широкого спектру пухлин, зокрема меланоми, раку нирок, кишечника, легень, молочної залози, простати та лейкемії. Ідентифіковано більше 2000 антигенів[10].
Стандартна SEREX-методика включає кілька головних етапів:
1) створення кДНК-експресуючої бібліотеки на основі фагу λ з пухлини;
2) первинний скринінг бібліотеки аутологічною сироваткою і відбір позитивних клонів;
3) субклонування первинних позитивних клонів до моноклональності при вторинному скринінгу з аутологічною сироваткою;
4) переведення рекомбінантного фагу λ позитивних клонів в фагміду шляхом „in vivo excision”;
5) секвенування кДНК вставок позитивних клонів;
6) пошук в базах даних та ідентифікація позитивних клонів.
Присутність великої кількості В-лімфоцитів та плазмацитів в тканинах медулярної карциноми молочної залози зумовлює високу представленість кДНК клонів імуноглобулінів (IgG) в кДНК бібліотеках створених на основі пухлин, які детектуються при SEREX-аналізі і тим самим ускладнюють ідентифікування кДНК справжніх ПАА антигенів.
Нами був розроблений оригінальний підхід для вдосконалення стандартної SEREX-методики для пошуку ПАА медулярної карциноми молочної залози. Для цього ми синтезували олігонуклеотиди в анти-сенс орієнтації, які відповідають консервативним послідовностям СН2 і СН3 доменів важких ланцюгів імуноглобулінів класу G. Існує чотири ізотипи імуноглобулінів класу G: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4. Гени, які відповідають за синтез важкого ланцюга кожного з цих ізотипів мають різну кількість алельних форм: IGHG1 – 3, IGHG2 – 6, IGHG3 – 19, IGHG4 – 4. Загалом 32 алельні форми. За домогомою програми CLUSSTAL W(1.83) ми провели вирівнювання всіх 32-х послідовностей та виявили консервативні регіони характерні для всіх алельних форм (рис.1) довжиною 25 пар основ, до них було синтезовано олігонуклеотиди в антисмисловій послідовності. Синтезовані олігонуклеотиди були кон’юговані з біотином.
5’ TGTTGGAGACCTTGCACTTGTACTC 3’ 25по “-“ CH2 домен
5’ AGAAGCCTTTGACCAGGCAGGTCAG 3’ 25по “-“ CH3 домен
Рис.1. Консервативні олігонуклеотидні послідовності консервативних ділянок генів важких
Половину фракції тотальної РНК, яку було виділено за стандартною методикою з пухлини МКМЗ, ми виснажували проти генів IgG за допомогою олігонуклеотидів кон’югованих з біотином і стрептавідиновими BioMag магнітними частинками. З виснаженої та невиснаженої фракції тотальної РНК афінно було виділено мРНК з використанням Oligi(dT) магнітних частинок (DynalOligo(dT)), (рис. 2). На основі виснаженої та невиснаженої мРНК було синтезовано дві кДНК бібліотеки – Br502 та Br502’ на основі бактеріофагу λ (cDNA synthesis kit, Stratagene) за стандартною методикою. Не виснажена бібліотека виступала в якості контролю.
Рис. 2. Схема виділеня мРНК з МКМЗ
Титр бібліотек Br502 і Br502’становив 1*106 фагових часток в 1 мкл. Кількість нерекомбінантних фагів визначали за допогомою біло-голубого відбору, вона становила менше 1% від загальної кількості фагів. Кількість IgG клонів в виснаженій кДНК бібліотеці становила менше 0,05%, в той час, як не виснажена кДНК бібліотека містила більше 10% IgG клонів (рис. 3). Це свідчить про те, що запропонований нами підхід дозволив отримати повністю виснажену кДНК бібліотеку проти генів IgG, придатну для подальшого скринінгу аутологічною сироваткою.
Імуноскринінг бібліотеки проводився аутологічною сироваткою хворого за стандартною схемою. Процесування нітроцелюлозних мембран з вторинними антитілами, міченими пероксидазою до інкубації з аутологічною сироваткою, дозволяє ідентифікувати залишкові, не виснажені IgG клони. Після фарбування з діамінобензидином IgG клони забарвлюються в коричневий колір і маркуються. Після інкубації мембран протягом 14 годин з аутологічною сироваткою ми процесували мембрану з вторинними антитілами проти людських антитіл, міченими лужною фосфатазою. Внаслідок фарбування мембран бром-хлор-індолфосфатом в суміші з нітросинім тетразолієм клони забарвлювались в фіолетовий колір.
При первинному скринінгу виснаженої бібліотеки Br502 було виявлено 89 клонів, які реагують з антитілами аутологічної сироватки у високому титрі. Позитивні клони, виявлені при первинному скринінгу були скриновані вдруге у розведенні 1:100 (рис.4). При вторинному скринінгу підтвердилось 59 клонів, які були клоновані до моноклональності.
Рис.4. Нітроцелюлозна мембрана вторинного скринінгу кДНК експресуючої бібліотеки медулярної карциноми молочної залози Br502 (позитивні клони обведені колами).
З позитивних моноклональних фагів було виділено фагміди методом in vivo excision, які містили рекомбінантні вставки. Ми провели секвенування послідовностей всіх 59 клонів (168 субклонів), і встановили, що вони відповідають 41 різним генам, серед яких 9 генів були представлені кількома клонами – від двох до шести. За залученням білкових продуктів ідентифікованих нами генів в різні біологічні процеси ми розділили їх на 9 груп (табл.1). Слід зазначити, що 14 генів вже було ідентифіковано і заявлено іншими дослідниками, які працюють з SEREX-аналізом, при скринінгу кДНК бібліотек створених на основі РНК, виділеної з різних типів пухлин. Це підтверджує достовірність отриманих нами результатів. Після опрацювання літературних джерел нами було виявлено, що білки 5-ти генів мають імуномодулюючі властивості, можливо, їхня експресія зумовлює таку високу лімфоцитарну інфільтрацію МКМЗ, в порівнянні з іншими типами пухлин молочної залози. Ідентифіковані нами гени, мають бути запатентовані, тому ми не наводимо конкретних назв білкових продуктів.
Таблиця 1
Процес | Кількість генів | Ідентифіко-вано SEREX-аналізом | Кількість генів представлена декількома клонами | Експресія в інших пухлинах | Мають імуномо-дуляторні власти-вості |
Транскрипція/трансляція | 12 | 6 | 6 | Гостра мієлогенна лейкемія, аденокарци-нома, рак нирок, молочної залози, шлунку, простати | 2 |
Трансдукція сигналу | 4 | 1 | - | Рак молочної залози, легень, нирок | - |
Рибосомальні білки | 4 | 2 | - | Рак прямої кишки, стравоходу, меланома | - |
Цитоскелет/ міжклітинна взаємодія | 3 | 1 | - | Рак кишечника, рак шлунку | 1 |
Шаперон-подібна активність | 3 | 1 | - | Асоційований з лейкемією, первинні лускатоклітинні пухлини шиї та голови, рак молочної залози та шлунку, остеосаркома | 1 |
ДНК деструкція/репарація | 3 | - | 1 | - | - |
Секреторні білки | 1 | - | - | - | - |
Інші | 5 | 1 | - | Рак простати | 1 |
Функції не досліджено | 7 | 2 | 2 | Рак молочної залози | - |
Модифікований нами метод дозволив отримати повністю виснажену кДНК бібліотеку медулярної карциноми молочної залози проти генів IgG, придатну для подальшого скринінгу. При первинному скринінгу кДНК бібліотеки медулярної карциноми молочної залози виявлено 89 позитивних клонів, 59 з яких підтвердились при вторинному скринінгу. Подальше дослідження знайдених генів та їх білкових продуктів може дозволити відібрати ті антигени, які можуть бути використані для імунотерапії моноклональними антитілами і для створення протиракових вакцин, а в подальшому створити імунотерапевтичні підходи для лікування не лише МКМЗ, але і інших типів пухлин молочної залози. Алогенний скринінг виявлених нами білків дозволить виявити антигенний маркер медулярної карциноми молочної залози, який може бути використаний при діагностиці даної неоплазії. Вивчення взаємодії ідентифікованих нами білків допоможе глибше вивчити біологію туморогенезу пухлин молочної залози і наблизитись до розуміння механізмів імунної відповіді, у випадку їх високої інфільтрації лімфоцитами, асоційованої з хорошим прогнозом пухлин молочної залози.
Література
1. Сидоренко железа. Как уберечь себя от рака. – Фолио-Пресс. – 1998. – 702 с.
2. Moore OS, Foote FA. The relatively favorable prognosis of medullary carcinoma of the breast // Cancer.– 1949. – Vol. 2. – P. 635-642.
3. www. howardlieberman. org/dept/sph/publications/student_bulletin_SPH. pdf
4. Bacus SS, CR Zelnick CR, Chin DM, et. all Medullary carcinoma is associated with expression of intercellular adhesion molecule-1. Implication to its morphology and its clinical behaviour // American journal of Pathology. – 1994. –Vol. – P..
5. Feinmesser Meora, Sulkes Aaron, Morgenstern Sara, et all. HLA-DR and â2 microglobulin expression in medullary and atypical medullary carcinoma of the breast: histopathologically similar but biologically distinct entities // J. Clin. Pathol. – 2000. – Vol. 53. – P.286–291.
6. Nzula Sanizi, Going James J., Stott David. The role of B lymphocytes in breast cancer: a review and current status // Cancer Therapy. – 2003. – Vol.1. – P. 353-362.
7. Hsu Su-Ming, Raine Laurence, Nayak R. N. Medullary Carcinoma of Breast: An lmmunohistochemical Study of Its Lymphoid Stroma // Cancer. – 1981. – Vol.48. – P. .
8. Hansen Margit H., Nielsen Heidi, Ditzel Henrik J. The tumor-infiltrating B cell response in medullary breast cancer is oligoclonal and directed against the autoantigen actin exposed on the surface of apoptotic cancer cells // PNAS. – 2001. – Vol. 98. – P. 12659–12664.
9. Kotlan Beatrix, Simsa Peter, Teillaud Jean-Luc, et all. Novel Ganglioside Antigen Identified by B Cells in Human Medullary Breast Carcinomas: The Proof of Principle Concerning the Tumor-Infiltrating B Lymphocytes // The Journal of Immunology. – 2005. – Vol. 175. – P. 2278–2285.
10. Chen YT. Identification of human tumor antigens by serological expression cloning: an online review on SEREX // Cancer Immun. – 2004.
