УТВЕРЖДЕНА Приказом Росздравнадзора от 04.г. /09 |
|
8.6. Для выполнения измерения на автоматическом биохимическом анализаторе следует:
8.6.1. Установить программу определения активности АЛТ согласно таблице:
Наименование параметра | Значение |
Метод измерения | кинетический |
Длина волны, нм | основная 340, дифференциальная 405 |
Измерение против | Воздух или дист. вода |
Температура реакции | 37 ОС |
Единица измерения | Е/l, (МЕ/л) |
Число знаков после запятой | 0 |
Изменение оптической плотности | Уменьшается |
Фактор* | Зависит от длины оптического пути |
Соотношение рабочего реагента/проба | 20:1 |
Количество измерений, не менее | 3 |
Время лаг-фазы, мин | 1 |
Время реакции, мин | 1 |
Верхний предел абсорбции реагента против воды, Б | 2,2 |
Нижний предел абсорбции реагента против воды, Б | 0 |
Максимальная скорость изменения абсорбции, Б/мин | 0,15 |
Границы линейности, МЕ/л | 7,95-500 |
Максимум нормы, МЕ/л | 40 |
Минимум нормы, МЕ/л | 6 |
* - Перед первым использованием набора необходимо определить значение фактора по мультикалибратору, аттестованному по активности АЛТ IFCC методом без пиридоксаль-5-фосфата. Полученное значение ввести в память анализатора.
8.6.2. Приготовление рабочего реагента см. пункт 8.1.
8.6.3. Если результат измерения активности АЛТ выше 500 МЕ/л, следует разбавить пробу физраствором (0,9% NaCl) в 10 раз, повторно провести измерение, полученный результат умножить на 10.
9. УСЛОВИЯ ХРАНЕНИЯ И ЭКСПЛУАТАЦИИ НАБОРА
9.1. Набор реагентов «АЛТ-UTS» должен храниться в упаковке предприятия-изготовителя при температуре +2-8 ОС в течение всего срока годности, указанного на упаковке. Замораживание компонентов набора не допускается.
9.2. Реагенты 1 и 2 после вскрытия флаконов могут храниться при температуре 2–8 ОС в плотно закрытых флаконах в темном месте в течение всего срока годности набора.
9.3. Рабочий реагент можно хранить в плотно закрытом флаконе при температуре 2–8 ОС не более 1 месяца.
9.4. Для получения надежных результатов необходимо строгое соблюдение инструкции по применению набора.
Список литературы
1. Burtis A et al. Tietz Textbook of Clinical Chemistry, 3rd ed AACC 1999.
2. Tietz N W et al. Clinical Guide to Laboratory Tests, 3rd ed AACC 1995.
3. Murray R. Alanin aminotransferase. Kaplan A et al. Clin Chem The C. V.
Mosby Co. St Louis. Toronto. Princeton 1984; .
4. Young DS. Effects of disease on Clinical Lab. Tests, 4th ed AACC 2001.
Производится по заказу /О Юнимед».
По вопросам, касающимся качества набора «АЛТ–UTS» следует обращаться в /О ЮНИМЕД» Москва, ул. Касаткина, 3а; Тел. (4, 1-31,
Факс: (4;
E-mail: *****@***ru; http://www. unimedao. ru
ИНСТРУКЦИЯ
по применению набора реагентов для определения активности аланинаминотрансферазы в сыворотке и плазме крови человека кинетическим методом
«АЛТ - UTS»
Набор АЛТ-UTS разрешен к производству, продаже и применению на территории РФ.
Регистрационное удостоверение № ФСР 2009/05454
Информация для заказа набора «АЛТ-UTS»
Кат. № | Комплектация | Количество определений |
АЛТ | Р1 80 мл + Р2 20 мл | 100/v* |
АЛТ | Р1 320 мл + Р2 80 мл | 400/v |
*v – объем фотометрической ячейки анализатора.
1. НАЗНАЧЕНИЕ
1.1. Набор реагентов «АЛТ-UTS» предназначен для определения активности аланинаминотрансферазы в сыворотке или плазме крови человека в клинико-диагностических и биохимических лабораториях для целей диагностики заболеваний и контроля проводимого лечения пациентов.
1.2. АЛТ – это внутриклеточный фермент, который в больших количествах присутствует в цитоплазме и митохондриях клеток печени и почек, а также в эритроцитах. В небольших количествах АЛТ обнаруживается в скелетных мышцах и миокарде [1,2]. АЛТ относится к классу аминотрансаминаз, которые катализируют обратимую реакцию переноса аминогруппы с аланина (аминокислота) на α-кетоглютаровую кислоту (α –кетокислота):
R1-аминокислота + R2-α-кетокислота <=> R1-α-кетокислота + R2-аминокислота
АЛТ попадает в кровь вследствие цитолиза клеток, содержащих этот фермент. На этом основано клиническое значение анализа.
1.3. Потенциальный риск применения набора – класс 2а. Основной риск косвенный и связан с возможностью получения неверного результата анализа, что может привести к неправильно поставленному диагнозу и назначению неэффективного лечения пациента. Для снижения указанного риска необходимо в каждой аналитической серии контролировать качество результатов анализов с применением контрольных сывороток в соответствии с ОСТ 91500.13..
2. ПРИНЦИП МЕТОДА
2.1. Набор реагентов «АЛТ-UTS» разработан на основе стандартного кинетического УФ-метода (IFCC) без пиридоксаль-5-фосфата. АЛТ катализирует реакцию переноса аминогруппы с аланина на оксоглютарат, образуя пируват и глютамат (1). Затем в присутствии лактатдегидрогеназы (ЛДГ) происходит восстановление пирувата до лактата за счет окисления НАДН2 (2).
АЛТ
L-Аланин + 2-оксоглютарат <=> Глютамат + Пируват (1)
ЛДГ
Пируват + НАДН + Н+ <=> Лактат + НАД+ (2)
Скорость окисления НАДН2 прямо пропорциональна активности АЛТ и измеряется фотометрически при 340 нм [3].
2.2. Фотометрическое измерение основано на наличии максимума поглощения света на длине волны 340 нм молекулами НАДН2. Все остальные компоненты реакционной смеси слабо поглощают свет на этой длине волны. Таким образом, уменьшение оптической плотности реакционной смеси на длине волны 340 нм пропорционально уменьшению концентрации НАДН2. При достаточно высокой концентрации субстратов АЛТ, НАДН2 и высокой активности ЛДГ скорость уменьшения концентрации НАДН2 и, следовательно, уменьшение оптической плотности реакционной смеси будет пропорциональна активности АЛТ.
3. СОСТАВ НАБОРА
3.1. Поскольку рабочий реагент, содержащий все компоненты для обеспечения химических реакций (1) и (2), не стабилен, набор реагентов поставляется в виде двух растворов Р1 и Р2.
Компоненты и их состав:
Наименование | Состав | Концентрация |
Реагент 1 (Р1) | Трис (рН 7,3) Лактатдегидрогеназа L-Аланин | 150 ммоль/л >1350 МЕ/л 750 ммоль/л |
Реагент 2 (Р2) | НАДН2 2-оксоглютарат | 1,3 ммоль/л 75 ммоль/л |
4. АНАЛИТИЧЕСКИЕ И ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ
4.1. Набор обеспечивает линейную область определения активности АЛТ от 7,95 МЕ/л до 500 МЕ/л, отклонение от линейности во всем указанном диапазоне не превышает 5%.
4.2. Чувствительность – не более 7.95 МЕ/л.
4.3. Воспроизводимость - коэффициент вариации результатов определений – не более 5%.
4.4. Качество набора можно оценивать по отечественным или зарубежным контрольным сывороткам, аттестованным данным методом.
4.5. Для калибровки автоматизированных фотометрических систем рекомендуется использовать сывороточные калибраторы, аттестованные по значению активности АЛТ данным методом.
4.6. Нормальные величины активности АЛТ в сыворотке или плазме взрослого человека составляют: у мужчин от 10 до 40 МЕ/л, у женщин от 7 до 35 МЕ/л [2].
4.7. Перечень лекарственных препаратов, влияющих на определение активности АЛТ, приведены в обзоре [4].
5. МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ
5.1. При выполнении лабораторного исследования необходимо соблюдать «Правила устройства, техники безопасности, производственной санитарии, противоэпидемического режима и личной гигиены при работе в лабораториях (отделениях, отделах) санитарно-эпидемиологических учреждений системы Министерства здравоохранения СССР» (Москва, 1981 г.).
5.2. При работе с биологическими пробами следует надевать одноразовые резиновые или пластиковые перчатки, т. к. образцы крови человека следует рассматривать как потенциально инфицированные, способные длительное время сохранять и передавать ВИЧ, вирусы гепатита или любой другой возбудитель вирусной инфекции.
6. ОБОРУДОВАНИЕ И РЕАГЕНТЫ
Для выполнения анализа активности АЛТ с применением набора реагентов «АЛТ-UTS» рекомендуется использовать полуавтоматический или автоматический биохимический анализатор, позволяющий выполнять измерение скорости изменения оптической плотности при длине волны
340 нм (кинетический режим) и обеспечивающий термостатирование фотометрической ячейки при температуре +(37±0,2) ОС.
7. АНАЛИЗИРУЕМЫЕ ОБРАЗЦЫ
7.1. Негемолизированная сыворотка или плазма крови.
7.2. Сыворотку или плазму крови следует отделить от форменных элементов крови не позднее, чем через 1 час после взятия крови.
7.3. Образцы сыворотки или плазмы стабильны не более 7 суток при +(2-8) ОС [3].
8. ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА
8.1. Приготовление рабочего реагента. Смешать Реагент 1 и Реагент 2 в соотношении 4:1. Полученный раствор рабочего реагента стабилен 1 месяца при температуре 2-8 ОС.
8.2. Раствор рабочего реагента прогреть до +(37±0,2) ОС.
8.3. Оптическая плотность рабочего реагента при 340 нм должна составлять 1,7¸2,0 ед. опт. плотн. (Б), (при использовании кювет с длиной оптического пути 10 мм).
8.4. Для проведения анализа на полуавтоматическом анализаторе должен быть выбран кинетический режим измерения с калибровкой по фактору и установлены следующие значения параметров методики:
Параметр | Значение |
Имя теста | АЛТ |
Основной светофильтр | 340 |
Дополнительный светофильтр | |
Фактор, F0 | -1750* |
Время лаг-фазы | 1 мин. |
Время измерения | 3 мин. |
Единицы измерения | Е/л (МЕ/л) |
Линейность, МЕ/л | 7,9 |
* значение (F0) приведено для случая, когда в анализаторе используются кюветы или пробирки с оптическим путем L0=10мм. При использовании кювет или пробирок с иным оптическим путем (L1) следует рассчитать значение фактора по формуле: F=F0хL0/L1
8.5. Проведение реакции.
Отобрать компоненты реакционной смеси с использованием пипеточных дозаторов в объемах, указанных в таблице:
Наименование | 37 оС | 30 оС | ||
Фотометрический объем 1 мл | Фотометрический объем 0,5 мл | Фотометрический объем 1 мл | Фотометрический объем 0,5 мл | |
Рабочий реагент | 1000 мкл | 500 мкл | 1000 мкл | 500 мкл |
Сыворотка или плазма крови | 50 мкл | 25 мкл | 100 мкл | 50 мкл |
8.5.1. При использовании биохимических анализаторов с другим фотометрическим объемом количество рабочего реагента и анализируемых образцов в зависимости от объема используемой кюветы может быть пропорционально изменено (соотношение сыворотки или плазмы крови к рабочему реагенту составляет 1:20 про 37 оС и 1:10 при 30 оС).
8.5.2. Пробы перемешать, поместить в фотометрическую ячейку анализатора. На стадии лаг-фазы в течение 1 минуты скорость изменения концентрации АЛТ выходит на линейный режим. При этом под действием фермента ЛДГ также устраняется мешающее влияние пирувата, содержащегося в образце крови и взаимодействующего с НАДН2, вследствие чего не происходит завышение результатов анализа. После стадии лаг-фазы начинаются кинетические измерения через 1, 2 и 3 минуты.
8.5.3. Результат анализа - активность АЛТ рассчитывается автоматически при введение в память полуавтоматического биохимического анализатора фактора, указанного в таблице.
8.5.4. Если результат определения активности АЛТ превышает 500 МЕ/л, то следует разбавить пробу физраствором (0,9% NaCl) в 10 раз и повторно провести измерение, а полученный результат умножить на 10.
