Совершенствование лабораторной иммунодиагностики вич-инфекции

На правах рукописи

ТЫРГИНА Татьяна Вячеславовна

СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ

ЛАБОРАТОРНОЙ ИММУНОДИАГНОСТИКИ ВИЧ-ИНФЕКЦИИ

14.03.10 – клиническая лабораторная диагностика

14.03.09 – клиническая иммунология, аллергология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Санкт-Петербург – 2011

Санкт-Петербургское государственное учреждение здравоохранения «Клиническая инфекционная больница имени » и ФГВОУ ВПО Военно-медицинская академия имени .

Научные руководители: доктор медицинских наук

доктор медицинских наук

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

доктор медицинских наук, профессор

Ведущая организация: Федеральное государственное учреждение здравоохранения "Всероссийский центр экстренной и радиационной медицины им. " МЧС России

Защита состоится « 29 » ноября 2011 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета по защите докторских и кандидатских диссертаций

Д 215.002.08 при ФГВОУ ВПО Военно-медицинской академии имени МО РФ ( Санкт-Петербург, ул. Академика Лебедева, д. 6).

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке ФГВОУ ВПО Военно-медицинской академии имени (Санкт-Петербург, ул. Академика Лебедева, д. 6)

Автореферат разослан «____»_____________2011 года

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук профессор

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность исследования. Масштабность пандемии ВИЧ/СПИДа, отсутствие средств специфической профилактики, дорогостоящие лабораторная диагностика и лечение дают право отнести проблему ВИЧ/СПИДа к мировым и наиболее важным (, 2000; и соавт., 2003, 2011; , , 2005, 2011; , 2008; 2010; Eberstadt N., 2002; Shih T. Y., Chen K. F., 2011). Как отмечают и соавт. (2000) первоочередной задачей здравоохранения в условиях рыночной экономики является разработка и внедрение ресурсосберегающих и высокотехнологичных моделей охраны здоровья населения. Оказание медицинской помощи населению стало невозможным без применения новых для здравоохранения технологий – стандартизации медицинских услуг, внедрения формулярной системы, маркетинговых исследований (, 2000; , 2009). Эти программы весьма актуальны в связи с необходимостью обеспечения государственных гарантий по оказанию бесплатной медицинской помощи, обеспечению ее доступности. При стратегическом планировании в здравоохранении в настоящее время одной из основных проблем является определение приоритетов в процессе размещения ограниченных финансовых средств, особенно при обосновании программ комплексных организационных мероприятий по профилактике и лечению инфекционных заболеваний (, 2011; , 2011).

ВИЧ-инфекция является не только медицинской, но и глубоко социальной проблемой. Болезнь поражает, прежде всего, людей репродуктивного и трудоспособного возраста, протекает длительно и остается заболеванием с крайне высокой степенью летальности (ВОЗ, 2007). Она угрожает экономической стабильности многих, в том числе развитых стран, так как с внедрением антиретровирусной терапии продолжительность жизни больных растет, как следствие, кумулятивное число живущих с ВИЧ и нуждающихся в ежедневном дорогостоящем лечении и постоянном лабораторном обследовании увеличивается. Поэтому проблема ВИЧ/СПИДа является одним из постоянно обсуждаемых вопросов на высшем государственном уровне.

До настоящего времени диагностика болезни зачастую представляет определенную трудность. Проблемы лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции обусловлены отсутствием абсолютно специфичных тест-систем, высокой стоимостью исследований, недостатками организации их проведения, генетической изменчивостью вируса и схожестью антигенного состава ВИЧ и некоторых структур организма человека (, 1997; и соавт., 2000, 2010; и соавт., 2010; , и соавт., 2010, 2011; Jennings C., 2005). В лабораторной службе все большее значение приобретает задача слежения за инфекционным процессом, вызванным самим ВИЧ и своевременного выявления вторичных инфекций, так как пришло время, когда у десятков тысяч, выявленных на пике эпидемии – в гг. – заболевание перейдет из стадии субклинической в стадию предСПИД и СПИД. Это и послужило основанием для выполнения настоящего исследования.

Цель исследования: на основании анализа диагностической эффективности серологического скрининга, референтной и экспертной диагностики, лабораторного мониторинга ВИЧ-инфицированных разработать предложения по совершенствованию лабораторной иммуно- диагностики ВИЧ-инфекции.

Задачи исследования:

1. Провести анализ диагностической эффективности различных иммуноферментных тест-систем, использованных для серологического скрининга ВИЧ-инфекции.

2. С учетом тенденций распространения и выявления ВИЧ-инфекции в Санкт-Петербурге, оценки диагностической и экономической эффективности лабораторных методов ее иммунодиагностики разработать предложения по совершенствованию этиологической диагностики и лабораторного мониторинга ВИЧ-инфицированных.

3. Изучить эффективность способа лабораторной оценки активности обратной транскриптазы (ОТ) ВИЧ в качестве оценочного показателя вирусной нагрузки и эффективности антиретровирусной терапии.

Научная новизна работы

Впервые установлено, что увеличение достоверности этиологической диагностики в Санкт-Петербурге в основном определяется внедрением нового поколения диагностических комбинированных иммуноферментных тест-систем, позволяющих выявлять не только антитела, но и антиген ВИЧ (Аг/Ат). Предложенный показатель прогностичности положительных результатов (ППР) позволил оценить диагностическую эффективность иммуноферментных тест-систем и определить лучшие из использующихся в Санкт-Петербурге, и предложить их для различных этапов диагностики.

Установлено прогностическое значение уровня р24-антигенемии для срока сероконверсии у пациентов с острой ВИЧ-инфекцией.

Предложен новый алгоритм арбитражного этапа исследования образцов крови на ВИЧ с определением р24 и сокращением числа референтных ИФА.

Впервые в стране апробирована и доказана диагностическая и экономическая целесообразность внедрения метода определения активности обратной транскриптазы ВИЧ с использованием тест-системы Exavir®load Ver. 3, как маркера активности ретровирусной репликации.

Впервые в Санкт-Пете6рбурге проведен анализ затрат на лабораторное сопровождение ВИЧ-инфицированных. Установлено, что важной причиной низкой экономической эффективности диагностики является 4-5-кратное дублирование референтных исследований в расчете на 1 вновь выявленного больного.

Впервые установлена прямая связь низкой экономической эффективности диагностики с несовершенством нормативной базы по обследованию и регистрации ВИЧ-инфицированных, предложено создание регистра больных, который поможет снизить кратность проведения скрининговых и референтных исследований в несколько раз, а также разработан алгоритм анонимного обследования.

Практическая значимость

Дана оценка эффективности лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции в Санкт-Петербурге. На ее основе разработаны предложения по эффективному использованию диагностических тест-систем на разных этапах экспертизы ВИЧ-инфекции. Предложен новый сокращенный алгоритм референс-диагностики, позволяющий сократить количество исследований, снизить затраты и продолжительность диагностического периода.

Выявленные основные причины диагностических ошибок позволяют предложить эффективные меры для их предотвращения.

Использование критерия прогностичности антигена р24 (выявленной зависимости между уровнем р24-антигенемии и формированием сероконверсии у ВИЧ-инфицированных) может способствовать сокращению количества исследований и сроков постановки диагноза.

При более широком использовании экспресс-тестов можно рассчитывать на снижение числа диагностических ошибок, сокращение длительности диагностического периода, улучшение результатов лечения ВИЧ-инфицированных в ЛПУ.

Разработка и внедрение регистра ВИЧ-инфицированных с возможностью санкционированного защищенного доступа будут способствовать исключению дублирования исследований у ВИЧ-инфицированных и снижению затрат на диагностику.

Внедрение метода определения активности ОТ ВИЧ, обоснованного в работе, позволит сделать мониторинг эффективности ВААРТ (высокоактивной антиретровирусной терапии) дешевле и доступнее.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Использование комбинированных иммуноферментных тест-систем (Аг/Ат), совершенствование системы регистрации больных и создание регистра ВИЧ-инфицированных с возможностью защищенного санкционированного доступа специалистов, более широкое использование в клинических подразделениях бесприборных экспресс-тестов для выявления маркеров ВИЧ-инфекции будут способствовать сокращению числа ложноположительных и ложноотрицательных результатов лабораторных исследований, сокращению диагностического периода и стоимости диагностики, повышению эффективности лечения ВИЧ-ассоциированных заболеваний.

2.  Метод определения активности ОТ ВИЧ является эффективным для определения вирусной нагрузки ВИЧ при диспансерном наблюдении за ВИЧ-инфицированными.

Апробация работы

Результаты исследований и основные положения диссертации были представлены и обсуждены на Российско-итальянской конференции «Актуальные вопросы социально значимых вирусных инфекций» (Великий Новгород, 2009), на Северо-Западной научно-практической конференции «ВИЧ-инфекция и иммуносупрессия» (Санкт-Петербург, 2010), на расширенном заседании НИЛ СПИД и инфекционных болезней Военно-медицинской академии имени (Санкт-Петербург, 2011).

Публикации. По теме диссертационного исследования опубликовано 10 научных работ, в том числе 1 работа в журнале, рекомендованном ВАК.

Реализация и внедрение результатов работы

Результаты исследования внедрены в практическую деятельность Городской иммунологической лаборатории Клинической инфекционной больницы имени г. Санкт-Петербурга, в учебный процесс кафедр инфекционных болезней Волгоградского государственного медицинского университета, института Медицины Ульяновского государственного университета, Уральской государственной медицинской академии, Научно-исследовательской лаборатории СПИД и инфекционных болезней в ВС РФ кафедры инфекционных болезней (с курсом паразитологии и тропических заболеваний), кафедры факультетской терапии ФГВОУ ВПО Военно-медицинской академии имени .

Личный вклад автора

Весь материал, представленный в диссертации, собран автором в Городской иммунологической лаборатории Клинической инфекционной больницы им. , НИЛ СПИД и инфекционных болезней в ВС РФ и на кафедре факультетской терапии Военно-медицинской академии им. . Обработка статистических и клинико-лабораторных данных, интерпретация полученных результатов выполнена лично автором.

Теоретические положения, выводы и практические рекомендации, содержащиеся в диссертации, являются результатом самостоятельного исследования. Личный вклад автора в исследование проблемы состоит:

-  в постановке и обосновании цели исследования, выборе объекта, определении задач исследования и их решении;

-  в выявлении и формулировании закономерностей лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции;

-  в разработке и научном обосновании методических основ комплексного мониторинга больных ВИЧ-инфекцией;

-  в разработке общих и частных методических принципов оптимизации лабораторной диагностики ВИЧ/СПИД.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 202 страницах машинописного текста и состоит из введения, 4 глав, обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций, указателя литературы (137 отечественных и 69 иностранных источников), 7 приложений, иллюстрирована 51 таблицей и 35 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Работа выполнена в Городской иммунологической лаборатории Клинической инфекционной больницы имени Санкт-Петербурга, где ежегодно обследовалось от 18425 до 19498 человек, биологический материал которых направлялся на экспертную диагностику ВИЧ-инфекции; в НИЛ СПИД и инфекционных болезней в ВС РФ кафедры инфекционных болезней, на кафедре факультетской терапии Военно-медицинской академии им. С М. Кирова.

В анализ вошли данные, полученные за 7 лет ( гг.) работы над проблемой лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции. Анализ заболеваемости ВИЧ-инфекцией проводился по методике [1982] по данным отчетов Центра СПИД г. Санкт-Петербурга и Центра СПИД Ленинградской области. Проявления эпидемического процесса ВИЧ-инфекции оценивались на основании статистических данных о выявляемости ВИЧ-инфекции среди жителей г. Санкт-Петербурга.

Диагноз «ВИЧ-инфекция» верифицировался исследованиями ИФА с обнаружением в крови специфических антител к ВИЧ с последующим подтверждением в реакции иммуноблоттинга. Детям, рожденным от ВИЧ-позитивных матерей, диагноз подтверждался методом ПЦР на ДНК провируса ВИЧ. Основные методы и объем исследований представлены в табл. 1.

Таблица 1 – Основные методы и объем исследований

Методы исследований	Объем и методики исследования
Анализ историй болезни больных ВИЧ-инфекцией	975 больных ВИЧ-инфекцией, в том числе 822 мужчины (84,3%) и 153 женщины (15,7%); 18 332 исследования
Лабораторные методы диагностики	Общеклинические Серологические Биохимические Иммунологические
Эпидемиологические	Анализ заболеваемости ВИЧ-инфекцией в Санкт-Петербурге
Анализ ежегодных отчетов Центра СПИД г. Санкт-Петербурга и Центра СПИД Ленинградской области	гг. Анализ работы и годовые отчеты экспертной (93 482 исследования) и скрининговых (2 616 558 исследований) лабораторий города и Ленинградской области
Статистическая и графическая обработка данных	Формирование баз данных, параметрические и непараметрические статистические методы

В исследованиях использовали диагностические тест-системы на анти-ВИЧ 1/2 российского и импортного производства. Чаще всего использовали диагностическую тест-систему Дженскрин Ультра ВИЧ Аг/Ат (Genscreen ULTRA HIV Ag/Ab) для определения антител к ВИЧ1 и ВИЧ2 и антигена р24 вируса иммунодефицита человека в сыворотке и плазме крови, позволяющую одновременно обнаружить анти-ВИЧ 1 (М и О группы) и анти-ВИЧ 2 антитела и антигены. Второй системой, используемой для подтверждения ВИЧ-инфекции, в лаборатории являлась ARCHINECT HIV Ag/Ab Combo, предназначенная для одновременного качественного определения антигена р24 и антител к ВИЧ 1 типа и 2 типа (ВИЧ1 и ВИЧ2) в сыворотке или плазме человека методом хемилюминесцентного иммуноанализа на микрочастицах (ХИАМ).

Лабораторное экспертное заключение об инфицированности ВИЧ выносили при получении положительного результата исследования методом иммуноблоттинга.

Для оценки иммунного статуса применяли: а) количественное определение Т и В-лимфоцитов и их субпопуляций, коэффициента иммунорегуляции на проточном цитофлюориметре «FACS Calibur» производства США фирмы Becton Dickinson с использованием моноклональных антител CD3/ CD4/ CD5 и CD3/ CD8/ CD45 той же фирмы в пробирках Trucount (одно-платформенная технология) в цельной крови с лизированием без отмывки; б) количественное определение иммуноглобулинов IgA, IgM, IgG методом Manchini et al. [1970]; г) определение уровня циркулирующих иммунных комплексов; д) определение НСТ-теста (реакция восстановления нитросинего тетразолия).

Впервые в стране мы изучили возможность лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции при использовании метода Exavir®load Ver. 3 (Cavidi Tech AB, Uppsala, Sweden), позволяющего оценить вирусную нагрузку по степени активности обратной транскриптазы (ОТ) ВИЧ с использованием стандартного оборудования для ELISA вместе с запускающим оборудованием ExaVir Load. Метод основан на выделении ВИЧ из плазмы пациента с помощью геля (solid matrix), с последующим лизисом материала и сбором лизата, содержащего ОТ. Вирусная ОТ выявлялась методом ИФА с использованием 96-луночного микропланшета. Дно лунок этого микропланшета покрыто шаблонной РНК. Реакционная смесь, содержащая затравку и субстрат ОТ бром-диоксиуридинатрифосфат (BrdUТР), наносилась вместе с лизатами в лунки, где при наличии в лизатах ОТ начинается синтез цепи ДНК. Этот продукт детектировали с помощью щелочной фосфатазы (ЩФ), конъюгированной с антителами против бром-диоксиуридина (&-BrdU). Количество продукта синтеза измеряли в присутствии хромогенного субстрата ЩФ. Количественную оценку активности ОТ ВИЧ в образцах производили с использованием вычислительной программы «ExaVir Load Analyzer».

Для подготовки графических изображений и диаграмм использовался ППП Microsoft Excel 10.0. Для оценки лабораторных показателей использовались стандартные методики. При обработке данных использовался ППП Statistica for Windows 5.0. Формирование базы данных и графическая обработка результатов исследований проводились при помощи ПЭВМ Intel Celeron 700.

Основные результаты исследования

1.Оценка эффективности лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции

Данные проведенного анализа показали, что за 5 лет количество скрининговых исследований в Санкт-Петербурге выросло на 3,9%. Количество анализов крови, направленных на референтное исследование, увеличилось на 11,4%. Рост объемов референс-диагностики в этот период составил 12,6%, что потребовало соответствующего увеличения объемов экспертной диагностики. Достоверно вырос удельный вес подтвержденных анализов с 67,0% в 2005 году до 74,2% в 2009 году.

Выявленное снижение доли проб, отправляемых в референс-лабораторию (обобщенные данные по Санкт-Петербургу) с 4,3% в 2006 году до 3,4% в 2009 году (в 1,3 раз), на фоне сохраняющегося числа вновь выявляемых случаев ВИЧ-инфекции, свидетельствует об улучшении качества исследований на скрининговом этапе (табл.2). Принципиально, что за этот период произошел переход скрининговых лабораторий с иммуноферментных тест-систем 2-го поколения на 3-4-е.

Таблица 2 – Динамика лабораторных исследований на ВИЧ-инфекцию

в Санкт-Петербурге в годах

Годы	2005	2006	2007	2008	2009
Количество скрининговых исследований
Количество вновь выявленных (В/В) ВИЧ-инфицированных	2 966	3 384	4 078	3 439	3 382
Количество сывороток, направленных в референс-лабораторию	17 146 (3,2%)	18 425 (4,3%)	19 231 (3,6%)	19 179 (3,4%)	19 501 (3,4%)
Количество сывороток, подтвержденных в референс-лаборатории	11 495 (67,0%)	12 824 (69,6%)	13 862 (72,0%)	14 232 (74,2%)	14 470 (74,2%)
Выполнено скрининговых ИФА на 1вновь выявленного (В/В) / минимальный %	181.3/ 11.0	126,5/ 15,8	130,9/ 15,2	162,2/ 12,4	165,2/ 12,2
Кратность проведения исследований на 1 серопозитивного В/В	5,78	5,44	4,72	5,58	5,77
Кратность проведения арбитражных исследований на 1 В/В	3,88	3,79	3,42	4,14	4,28

Примечание: *для подтверждения диагноза должно быть проведено не менее 2-х ИФА.

Для оценки эффективности лабораторного аналитического этапа референтной диагностики нами проанализированы результаты работы Городской иммунологической лаборатории за 2005 и 2010 гг. (табл. 3).

Отмечается незначительный рост (с 90,5 до 92,2%) доли подтверждения положительного референтного результата при постановке иммунного блоттинга (ИБ). При этом к 2010 году доля данных ИБ с неопределенным результатом снизилась в 1,2 раза (с 9,4 до 7,7%). Таким образом, отпала необходимость проведения повторного ИБ у 20% обследованных (более 160 человек).

Таблица 3 – Эффективность референс-диагностики в Городской иммунологической лаборатории Санкт-Петербурга в 2005 и 2010 г.

Годы	Референс-положительных проб
Всего	Из них положительных в ИБ/%	Из них неопределенных в ИБ/%
2005	2616	2368/90,5	248/9,5
2010	6312	5821/92,3	491/7,7

По причине недостаточного количества направленного для исследования материала в 2005 и 2010 году однократному референс-исследованию с положительным результатом подверглись 140 и 114 проб соответственно. При сравнении исходов экспертной диагностики в группах с двукратным и однократным обследованием достоверных различий не выявлено. Представленные данные свидетельствуют о том, что получение даже первого положительного результата в референтной лаборатории позволяет в перспективе получить положительный результат в ИБ у 99,0-99,7%. Следовательно, при обследовании в референтной лаборатории при получении первого положительного результата с высокой степенью достоверности можно назначать ИБ, не дожидаясь или не проводя повторное референтное исследование методом твердофазного иммуноферментного анализа. Это позволит существенно сократить прямые финансовые затраты на диагностику и длительность диагностического периода без снижения качества диагностики. При этом принятый диагностический алгоритм (рис. 1) будет иметь альтернативный вид (рис.2):

Рис. 1 Принятый алгоритм лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции

Рис. 2 Возможный алгоритм лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции.

Установлена высокая кратность проведения экспертных и референс-исследований в пересчете на одного вновь выявленного больного, что обусловлено дублированием исследований у больных, обследующихся анонимно, скрывающих свой ВИЧ-статус, невысоким качеством дотестового консультирования. Перспективным направлением оптимизации системы диагностики ВИЧ-инфекции может стать создание регистра ВИЧ-инфицированных с защищенным доступом к информации профильных медицинских специалистов.

Для определения прогностичности положительных результатов (ППР) скрининговой или референтной ИФА-диагностики ВИЧ-инфекции, полученных с использованием определенной тест-системы, нами изучалось соотношение истинно-положительных результатов к сумме истинно-положительных и ложноположительных результатов, истинность или ложность которых была установлена в результате проведения в последующем экспертной диагностики методом иммунного блота:

Учитывая данный показатель, лучшими тест-системами среди используемых в нашем исследовании для скрининговой диагностики ВИЧ-инфекции оказались: GENSCREEN ULTRA HIV Ag/Ab, Био-Рад, Франция (ППР-93,7 %), ДС-ИФА-ВИЧ-АГАТ-скрин «Диагностические системы», Россия (ППР ― 84,9 %). Наибольшая диагностическая эффективность установлена для иммуноферментных тест-систем, изготовленных на основе смеси гликопротеина gp160, синтетических пептидов ВИЧ1 и ВИЧ2, воспроизводящих иммунодоминантные эпитопы трансмембранных белков оболочки, и моноклональных антител к антигену ВИЧ p24.

Нами проведен анализ зависимости результатов скрининговой и референтной диагностики от стадии ВИЧ-инфекции в момент постановки лабораторного диагноза пациентам с впервые выявленной ВИЧ-инфекцией. Выявлена тенденция увеличения кратности обследования ВИЧ-инфицированных в стадии 2 ВИЧ-инфекции. Это подтверждает положение о том, что клинические проявления ВИЧ-инфекции в стадии 2А-В обусловлены незавершенностью сероконверсии и низким уровнем специфических анти-ВИЧ Ig.

Нами проанализированы результаты показателей, полученных при обследовании пациентов с изначально отрицательным/неопределенным ИБ, имеющим положительные значения ИФА и антигена р24 в крови. У наблюдаемых больных коэффициент позитивности (КП) р24 вычисляли по формуле:

где: КП – коэффициент позитивности,

ОП образца – значение оптической плотности исследуемого материала,

ОП критическая – стандартный показатель, рассчитывается для каждой ИФА-системы.

Мы взяли для анализа данные 127-ми пациентов, у всех при высоких значениях экстинций р24 был выявлен сомнительный или отрицательный ИБ (острая ВИЧ-инфекция). В последующем у этих пациентов неоднократно проводились обследования до получения положительного результата в ИБ. При этом уровень р24-антигенемии снижался до отрицательных значений. Как показали расчеты и их анализ, сероконверсия происходила в среднем за 65,2 дня (от 225 до 12 суток). Средняя скорость снижения уровня антигена в сыворотке крови составила 1,4 КП/сут. (от 0,01 КП/сут. до 3,5 КП/сут.). Проведенный статистический анализ позволил выявить устойчивые связи между уровнем антигенемии р24 и сроком наступления сероконверсии (r = -0,87), при этом коэффициент детерминации r2 = 0,76, что указывает на то, что положение не менее 76% точек данной выборки объясняются данной зависимостью.

Дальнейший анализ данных позволил выявить линейную зависимость между уровнем р24 антигенемии и сроком сероконверсии (р<0,001), выраженную формулой:

где: Х – срок сероконверсии в неделях, У – уровень р24 антигена (относительный показатель КП у пациентов с отрицательным результатом иммунного блота) [, ,

, , 2010]. Полученные данные позволяют заключить, что уровень р24-антигенемии у пациентов с острой ВИЧ-инфекцией может быть использован для прогноза сроков выявления у них положительного иммунного блота. Применение данной формулы позволит более объективно подходить к назначению повторных арбитражных исследований и сократить их число.

Для двух используемых в референс-лаборатории тест-систем был рассчитан коэффициент позитивности (КП), позволяющий прогнозировать положительный результат в ИБ (такое его наименьшее значение, при котором с вероятностью в 95% можно прогнозировать наличие ВИЧ-инфекции у пациента (положительный ИБ)). Исследовали образцы сыворотки крови 400 человек, получивших положительные результаты ИФА. В подтверждающей лаборатории им было выдано положительное заключение о наличии ВИЧ-инфекции по данным иммунного блота. Наименьшим значением КП, которое определяло наличие ВИЧ-инфекции у пациента с вероятностью 95% и выше при исследовании системой GENSCREEN ULTRA HIV Ag/Ab стал показатель 16,7, для ARCHITECT HIV Ag/Ab Combo – 139,9.

Стремление исключить диагностические ошибки в связи с важностью диагноза привело к созданию диагностического алгоритма, построенного на многократном дублировании сходных исследований на всех этапах диагностики. По нашим данным, в этой ситуации затраты на получение положительного скринингового результата ИФА в 2,6 раза больше, чем отрицательного, неопределенный результат в 5,6 раз дороже, чем положительный, и в 14,8 раза – чем отрицательный (рис. 3).

Мы провели расчеты экономических затрат на этиологическую диагностику ВИЧ-инфекции в Санкт-Петербурге в 20году.

Общие затраты оцениваются в сумму более 32 млн. рублей. Учитывая тот факт, что за этот период вновь выявлено только 2 938 ВИЧ-инфицированных, можно утверждать, что при правильной регистрации пациентов в момент первичной диагностики (регистр) затраты на референсную и экспертную диагностику можно снизить в 5-6 раз, а на скрининг – вдвое. При этом экономия средств на диагностику ВИЧ-инфекции в Санкт-Петербурге может составить 50-70%.

Руб.

Рис. 3 Стоимость лабораторного обследования при отрицательном, положительном и неопределенном результате анализа.

Одной из причин поздней диагностики ВИЧ-инфекции явилось отсутствие возможности использования лабораторных экспресс-методов выявления антител (антигенов) ВИЧ в условиях амбулаторного обследования или стационара.

Для проверки диагностической эффективности трех наиболее распространенных экспресс-тестов нами были проанализированы 600 случаев их использования в качестве скрининговых и арбитражных в научно-исследовательской лаборатории СПИД и инфекционных болезней в ВС РФ Военно-медицинской академии им. за период гг. (табл. 4).

Таблица 4 – Сравнительная эффективность простых быстрых тестов

Показатели/ Экспресс-тесты	% совпадений Скрининг* (++) ** экспресс (+) Абс./%	% расхождений Скрининг* (++) ** экспресс (-) Абс./%	% расхождений Скрининг* (+-) ** экспресс (+) Абс./%
Детермин (n=492)	468 / 95,1	20 / 4,1	4 / 0,8
Джения (n=120)	112 / 93,3	6 / 5,0	2 / 1,7
ИХА(Фактор-Мед (n=398)	378 /95,0	12 / 3,0	8/ 2,0

* В качестве скрининговых использовались отечественные тест-системы (анти-ВИЧ 1/2); ** 2х-кратное исследование.

Сравнительные исследования подтвердили высокую диагностическую ценность простых быстрых тестов для выявления антител к ВИЧ. Несовершенство нормативной базы использования экспресс-тестов ограничивает их использование в лечебно-диагностических отделениях ЛПУ, что негативно сказывается на лечении все возрастающего числа больных в 4Б-В стадиях заболевания. Этому способствует большая длительность диагностического периода (11-14 дней), обусловленная высокой степенью централизации арбитражного этапа диагностики. Использование быстрых тестов позволит сократить длительность диагностики ВИЧ-инфекции.

2. Анализ лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции у детей

Общее число детей, имевших перинатальный контакт, в Санкт-Петербурге на 01.01.2009 составило 3033 ребенка. Мы проанализировали результаты лабораторного обследования 210 детей (110 мальчиков, 100 девочек) с установленным диагнозом ВИЧ-инфекции. Основным лабораторным методом, подтверждающим ВИЧ-инфекцию, являлся иммунный блоттинг. Было проведено 549 исследований методом ИБ за весь период наблюдения. Применительно к 169-и детям выполнено 516 исследований, что составляет 3,05 исследования ИБ на ребенка, 33 ребенка обследованы однократно. Диагностическая ценность ИБ, как экспертного метода, у детей первого года жизни ограничена, поскольку более чем у 1/3 пациентов выявление белков к оболочечным антигенам было различным.

В этой ситуации важное диагностическое значение приобретают методы молекулярно-генетической диагностики ВИЧ-инфекции.

За весь период наблюдения было проведено 328 исследований на ВИЧ методом ПЦР. В 90% случаев исследования проводились в первый год жизни, что свидетельствует о выявлении маркеров ВИЧ-инфекции к этому возрасту у абсолютного большинства из них. И лишь 10% детей нуждались в проведении повторных исследований в более поздние сроки для подтверждения диагноза. Полученные результаты свидетельствуют о том, что повышение уровня этиологической диагностики ВИЧ-инфекции у детей может быть обеспечено только при комплексном использовании серологических и молекулярно-генетических методов диагностики.

3.  Совершенствование лабораторного сопровождения диспансерного наблюдения и антиретровирусной терапии больных ВИЧ-инфекцией

Даже в сравнительно короткий срок (2гг.) значительно возросло число больных в продвинутых стадиях болезни (стадия 4). Только за 7 лет, с 2002 по 2007 гг., показатель удельного веса больных в стадии СПИД вырос в 49 раз. Динамика заболеваемости ВИЧ-инфекцией и увеличение доли пациентов в продвинутых стадиях заболевания требуют увеличения объема исследований и расходов на лабораторное сопровождение диагностики и диспансерное наблюдение за больными, особенно получающими антиретровирусные препараты.

Помимо значительного увеличения затрат на выполнение количественной ПЦР, высокая степень централизации данного вида исследований (1-2 лаборатории в субъекте Федерации) может создать сложности со своевременностью выполнения данных исследований. Нами изучена возможность использования альтернативного ПЦР лабораторного метода мониторинга эффективности ВААРТ с использованием более доступной и менее затратной технологии.

В соответствии с целью исследования мы изучили эффективность метода оценки ферментативной активности обратной транскриптазы ВИЧ (ОТ), являющейся маркером активности ретровирусной репликации, в лабораторном мониторинге больных ВИЧ/СПИД. Для этого использовали тест-набор «ExaVir Load», который предназначен для молекулярно-генетической диагностики с фотометрической (иммуноферментной) количественной оценкой результатов анализа.

Данным методом был обследован 241 больной ВИЧ-инфекцией.

У 154 пациентов мы провели сопоставление показателей активности ОТ и количества РНК в плазме крови. Установлено, что из 59 больных с положительным тестом на ОТ также положительный тест на РНК был в 97,7% случаев, в то время как при отрицательных результатах ИФА на ОТ тест на РНК был положительным в 43,1% случаев (у 41 из 95 больных). Выявленный факт мы объясняем тем обстоятельством, что тесты имеют разный нижний диапазон чувствительности: ОТ-1fg/ml (200 коп/мл), ПЦР (РНК)-50 коп/мл.

Следовательно, положительный тест на активность ОТ ВИЧ высокоспецифичен (97,7%), но по чувствительности уступает определению РНК вируса методом ПЦР (табл. 5).

Таблица 5 – Соотношение показателей активности ОТ и РНК

Результаты ОТ, абс./%	Результаты РНК
Положительные, абс./%	Отрицательные, абс./%
Положительные n=59	57/97,7	2/2,3
Отрицательные n= 95	41/43,1	54/56,9

У больных с положительным результатом обследования на ОТ в 7,7% случаях не удалось выявить р24 при наличии РНК ВИЧ (рис. 4).

Преимуществом метода «ExaVir Load» является то, что частота выявления ОТ не зависит от абсолютного содержания CD4+ лимфоцитов (табл. 6).

Рис. 4 Данные тестирования больных ВИЧ-инфекцией на р24 при положительных результатах анализа на ОТ (%).

Таблица 6 – Частота выявления ОТ у больных с различным уровнем CD4+клеток в периферической крови

Уровень CD4+клеток	Число больных	Частота выявления ОТ, %
>500 в 1 мкл	43	62,8
499-350	56	66,1
<349 в 1 мкл	84	59,1

Анализ показал, что эффективная антиретровирусная терапия снижает частоту выявления активности ОТ ВИЧ (рис. 5).

Так, при обследовании 79 больных до лечения ОТ выявлена в 77,2% случаев, на фоне проводимой терапии из 148 больных – лишь у 14,8%. Таким образом, определение активности ОТ у больных ВИЧ-инфекцией является показателем, адекватно отражающим степень репликативной активности ВИЧ и может рассматриваться в качестве альтернативы ПЦР при мониторинге эффективности антиретровирусной терапии и диспансерном наблюдении за больными.

Использование методики определения уровня активности ОТ ВИЧ с иммуноферментной визуализацией результата позволяет значительно сократить расходы на диспансерное наблюдение за ВИЧ-инфицированными и увеличить доступность объективного лабораторного мониторинга эффективности АРТ.

%

Рис. 5 Показатели частоты выявления ОТ у больных ВИЧ-инфекцией до лечения и на фоне АРВТ.

Суммарные результаты финансовых затрат на лабораторный мониторинг ВИЧ-инфицированных в Санкт-Петербурге за год могут быть рассчитаны (табл. 7) и составляют 323-330 млн. рублей в год.

Таблица 7 – Затраты на лабораторный мониторинг ВИЧ-инфицированных за год (в ценах 2010 г.)

Наименование	Количество диспансерных пациентов	Стоимость (руб.)
2009 г.	2010 г.	2009 г.	2010 г.
Постановка на диспансерный учет	3430	2938
Стоимость диспансерного обследования без ВААРТ	17500	18140	196
Стоимость диспансерного обследования на ВААРТ	4500	4612*
Всего

Примечание: *Расчет произведен на 5433 начавших и 4612 продолжающих ВААРТ пациентов.

При условии соответствия кратности обследования перечисленных в таблице 7 категорий стандартам оказания медицинской помощи «Об утверждении стандарта медицинской помощи больным болезнью, вызванной вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ)», приказ Минздравсоцразвития России № 000 от г, требуемый объем годового финанси­рования лабораторного обследования ВИЧ-инфицированных составит 323 млн. руб.

Представленный анализ свидетельствует о том, что в условиях развившейся эпидемии основные экономические затраты приходятся на лабораторное сопровождение диспансерного наблюдения за ВИЧ-инфицированными и определяются высокотехнологичными исследованиями для выявления уровня вирусемии, как основного фактора оценки показаний к назначению АРТ и ее эффективности. До 60% затрат связано с молекулярно-генетическими исследованиями. Таким образом, при объявленной стоимости 1 анализа на определение активности ОТ ВИЧ в пределах 15-20$ (400-550 рублей), что в 6-7 раз ниже, чем при использовании сертифицированных тест-систем фирмы Roshe (Франция), использование апробированного нами метода определения активности ОТ ВИЧ способно значительно снизить финансовую нагрузку на бюджет, расширить возможности доступа к исследованиям, повысить эффективность лечения.

ВЫВОДЫ

1.  Увеличение объема лабораторных исследований в Санкт-Петербурге за последние 5 лет произошло на фоне внедрения комбинированных (Аг/Ат) иммуноферментных тест-систем 4-го поколения, имеющих высокую чувствительность и специфичность, что способствовало достоверному сокращению доли ложноположительных и ложноотрицательных проб. Наибольшая диагностическая эффективность установлена для иммуноферментных тест-систем, изготовленных на основе смеси гликопротеина gp160, синтетических пептидов ВИЧ1 и ВИЧ2, воспроизводящих иммунодоминантные эпитопы белков оболочки, и моноклональных антител к антигену ВИЧ p24.

2.  Высокая частота повторных исследований в арбитражных лабораториях (до 5,8 на 1 вновь выявленного ВИЧ-инфицированного в год) значительно увеличивает финансовые расходы на этиологическую диагностику ВИЧ-инфекции.

3.  Использование комбинированных тест-систем 4-го поколения (Аг/Ат) позволяет сократить число референс-исследований и при получении первого положительного результата референс-ИФА проводить экспертное исследование методом ИБ.

4.  Использование при диагностике острой ВИЧ-инфекции критерия прогностичности, рассчитанного на основании уровня антигена ВИЧ р24, позволяет прогнозировать срок сероконверсии и сократить число арбитражных исследований.

5.  Использование простых быстрых тестов в клинических подразделениях у больных с симптомами СПИД-ассоциированных заболеваний позволяет сократить длительность диагностики ВИЧ-инфекции и своевременно начать специфическое лечение.

6.  Сочетанное использование серологических и молекулярно-генетических методов диагностики ВИЧ-инфекции у детей, рожденных ВИЧ-инфицированными матерями, позволяет сократить длительность диагностического периода до 1 года у 90% инфицированных.

7.  Способ оценки вирусной нагрузки ВИЧ методом определения активности ОТ ВИЧ с использованием тест-системы Exavir®load Ver. 3 с иммуноферментной визуализацией эффективен, высокоспецифичен, позволяет достичь высокой степени совпадения результатов с результатми ПЦР (97,7%) при более высокой чувствительности ПЦР и низкой себестоимости определения активности ОТ ВИЧ.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1.  С целью повышения эффективности серологического скрининга целесообразно использовать иммуноферментные тест-системы на основе смеси гликопротеина gp160, синтетических пептидов ВИЧ1 и ВИЧ2, воспроизводящих иммунодоминантные эпитопы белков оболочки, и моноклональных антител к p24; синтетических пептидов в сочетании с рекомбинантными белками и трансмембранным белком gp36 ВИЧ2.

2.  При получении отрицательного (неопределенного) результата ИБ рекомендуется использовать определение уровня антигена ВИЧ р24 и предложенного критерия прогностичности.

3.  С целью выявления серологических маркеров ВИЧ-инфекции у больных с симптомами СПИД-ассоциированных заболеваний рекомендуется использовать бесприборные простые быстрые тесты.

4.  С целью сокращения кратности проведения исследований и финансовых затрат на этиологическую диагностику ВИЧ-инфекции разработать положения и внедрить регистр ВИЧ-инфицированных с возможностью санкционированного защищенного доступа специалистов.

5.  Экспертное исследование ИФА-положительных образцов, полученных при анонимном скрининге, рекомендуется проводить после консультирования и отказа пациентов от анонимности.

6.  Рекомендовать метод определения активности ОТ ВИЧ с использованием тест-системы Exavir®load Ver. 3 с иммуноферментной визуализацией в качестве допустимой альтернативы ПЦР при диспансерном наблюдении за ВИЧ-инфицированными.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Мусатов р24-антигенемии как предиктор ранней сероконверсии при острой ВИЧ-инфекции/ , , // Альманах Инфекционные болезни. – СПб., 2009. – С. 134-137

2 . Ковеленов и клинические аспекты ВИЧ-инфекции / , , // Медлайн-Экспресс. – 2009. – №6. – С. 8-10

3 . Буланьков органов дыхания у больных ВИЧ-инфекцией / , , // Медлайн-Экспресс. –2009. – №2-3. – С. 35-37

4 . Тыргина лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции у детей / , // Медлайн-Экспресс. – 2009. – №6. – С.3-35

5 Мусатов значимость определения р24 ВИЧ в верификации острой стадии ВИЧ-инфекции / , , // ВИЧ-инфекция и иммуносупрессии. – 2010. – Т.2, №1. – С. 46-50

6 . Якубенко случаев поздно выявленной ВИЧ-инфекции в г. Санкт-Петербурге в 2008г / , , // Тезисы конференции Северо-Балитйского конгресса по инфекционным болезням. – 2009. – С. 84

7. Мусатов уровеня р24-антигенемии как предиктора ранней сероконверсии при острой ВИЧ-инфекции / , , А. Д Галачьянц // Тезисы конференции Северо-Балитйского конгресса по инфекционным болезням. – 2009. – С. 50

8. Буланьков лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции / , // Медлайн-Экспресс. – 2010. – №2-3. – С. 17-21

9. Мусатов выявленные случаи ВИЧ-инфекции среди госпитализированных пациентов / , , // ВИЧ-инфекция и иммуносупрессии. – 2010. – Т.2, №3. – С. 88-90

10. Лисицина лабораторных исследований и рассмотрение затрат по выявлению и контролю за ВИЧ / , , // ВИЧ-инфекция и иммуносупрессии. – 2010. – Т.2, №4. – С. 79-85

СПИСОК ОСНОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ

Аг/Ат – антиген-антитело

ВААРТ (АРT) – высокоактивная антиретровирусная терапия

ВИЧ – вирус иммунодефицита человека

ВОЗ – Всемирная организация здравоохранения

ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота

ИБ – иммунный блоттинг

ИФА – иммуноферментный анализ

ОТ – обратная транскриптаза

ПЦР – полимеразная цепная реакция (ПЦР)

РНК – рибонуклеиновая кислота

СПИД – синдром приобретенного иммунодефицита

ТМР – трансмембранный белок

ЩФ – щелочная фосфатаза

ELISA – твердофазный иммуноферментный анализ, ТИФА

BrdU – бром-диоксиуридин

Ig – иммуноглобулин