Определение ифосфамида в плазме крови человека

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ИФОСФАМИДА В ПЛАЗМЕ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА

, ,

Курский государственный медицинский университет, г. Курск

Ифосфамид – это вещество из группы производных бис-(β-хлорэтил)-амина, широко применяющееся в качестве противоопухолевого лекарственного средства. Является основным действующим веществом препаратов Веро-Ифосфамид, Холоксан и др. Данное вещество токсично в отношении теплокровных животных и человека. При внутрибрюшинном введении мышам LD50 составляет 694 мг/кг. Известны случаи отравления людей ифосфамидом, в том числе с летальным исходом [2].

Токсические свойства, широкое применение ифосфамида, наличие случаев летальных отравлений делают его потенциальным объектом судебно-химического исследования. Вопросы определения рассматриваемого вещества в биологическом материале изучены недостаточно [1, 3].

Целью исследования явилась разработка методики изолирования, очистки, идентификации и количественного определения ифосфамида при исследовании плазмы крови.

Материалы и методы исследования. Объект исследования – субстанция ифосфамида (производитель – ), содержащая не менее 99% основного вещества. Для проведения эксперименты готовили модельные смеси, состоящие из 25 г плазмы крови человека и определенного количества внесенного в нее ифосфамида (5,0; 10,0; 25,0, 50,0 или 100 мг). Модельные смеси предварительно выдерживали при 18-220С в течение 1,5 часов.

В качестве изолирующего агента использовался ацетон. Изолирование ифосфамида проводили путем двукратного настаивания модельных смесей с ацетоном при соотношении изолирующего агента и биоматериала 2:1 по массе и продолжительности каждого настаивания 45 минут. Полученные извлечения объединяли и упаривали в токе воздуха при комнатной температуре до сухого остатка.

Сухой остаток растворяли в 2 мл смеси растворителей гексан-диоксан-пропанол-2 (17,5:5:0,75). Полученный раствор смешивали с 1,5 г силикагеля КСК-3 с размером частиц 40/100 мкм. После испарения растворителей, сорбент с веществом помещали в стеклянную хроматографическую колонку размерами 490×11 мм с 8,5 г того же сорбента. Хроматографировали, используя подвижную фазу гексан-диоксан-пропанол-2 (17,5:5:0,75). Элюат собирали фракциями по 2 мл. Фракции с 6 по 16 включительно (11-32 мл), содержащие анализируемое вещество, объединяли и упаривали в токе воздуха при комнатной температуре до получения сухого остатка, который впоследствии растворяли в 10 мл ацетона.

0,5 мл полученного раствора наносили на линию старта хроматографической пластины «Сорбфил» марки ПТСХ-АФ-А-УФ в виде полосы и хроматографировали в присутствии вещества-свидетеля, используя элюент гексан-диоксан-пропанол-2 (10:5:1). Хроматограмму проявляли в УФ-свете и идентифицировали ифосфамид по величине Rf.

Определяемое вещество элюировали из сорбента этанолом. Элюат испаряли в токе воздуха при комнатной температуре. Ифосфамид в сухом остатке переводили в соответствующее нитропроизводное путем обработки 10% раствором нитрата калия в концентрированной серной кислоте течение 5 минут. Реакцию среды доводили до щелочных значений рН 10% раствором гидроксида натрия. Полученный раствор нитропроизводного ифосфамида исследовали на спектрофотометре СФ-56 в области длин волн 200-400 нм. Определяемое вещество идентифицировали по форме спектральной кривой и положению точек экстремумов.

Количество ифосфамида в извлечениях определяли по интенсивности поглощения его нитропроизводного при аналитической длине волны λ=255,2 нм, используя уравнение калибровочного графика.

Результаты и их обсуждение. Исследования показали, что для достаточно полного извлечения ифосфамида из плазмы крови необходимо, как минимум, двукратное настаивание биологического объекта с ацетоном при условии, что соотношение изолирующего агента и биоматериала составляет не менее 2:1 по массе, а продолжительность каждого настаивания – не менее 45 минут.

Идентификацию ифосфамида методом ТСХ проводили по величине Rf, равной 0,53±0,02, что соответствовало величине Rf вещества-стандарта.

При идентификации спектрофотометрическим методом обнаруживалось совпадение формы спектральной кривой и положения точек экстремумов (255,2 и 363,2 нм) нитропроизводного ифосфамида, извлеченного из плазмы крови и очищенного по вышеописанной схеме, со спектром нитропроизводного чистой субстанции.

Уравнение градуировочного графика для фотометрического определения ифосфамида по поглощению его нитропроизводного в ультрафиолетовой области спектра имело вид: А = 0,00867·С – 0,00797, где А – оптическая плотность, С – концентрация анализируемого вещества в фотометрируемом растворе (мкг/мл).

Результаты количественного определения ифосфамида в плазме крови человека представлены в таблице 1.

Таблица 1

Результаты определения ифосфамида в плазме крови человека (n=5; P=0,95)

Внесено ифосфамида, мг в 25 г плазмы	Найдено, %
	S	S	Δ	ε
5	76,91	2,75	1,23	3,16	4,11
10	77,35	2,46	1,10	2,82	3,65
25	77,65	2,27	1,01	2,61	3,36
50	77,74	1,92	0,86	2,21	2,84
100	78,19	1,76	0,79	2,02	2,58

Предлагаемая методика позволяет определить 76,91-78,19% ифосфамида в плазме крови человека с достаточной для биологических исследований воспроизводимостью и правильностью.

Выводы

1. Для извлечения ифосфамида из плазмы крови человека применён ацетон.

2. Определены оптимальные условия очистки извлечений из биологического материала методом жидкостной колоночной хроматографии низкого давления.

3. По результатам проведенных исследований разработана методика идентификации и количественного определения ифосфамида в плазме крови человека.

Литература

1. Baumann, F. Application of liquid chromatography–mass spectrometry in the determination of oxazaphosphorines and their metabolites / F. Baumann, R. Preiss // Anal. Chim. Acta. – 2003. – Vol. 492, № 1-2. – Р. 147-156.

2. Imtiaz, S. Ifosfamide neurotoxicty in a young female with a remarkable response to thiamine / S. Imtiaz, N. Muzaffar // J. Pak. Med. Assoc. – 2010. – Vol. 60, № 10. – Р. 867-869.

3. Simultaneous determination of cyclophosphamide, ifosfamide, doxorubicin, epirubicin and daunorubicin in human urine using high-performance liquid chromatography/electrospray ionization tandem mass spectrometry: bioanalytical method validation / C. Sottani, P. Rinaldi, E. Leoni [еt аl.] // Rapid Commun. Mass. Spectrom. – 2008. – Vol. 22, № 17. – Р. .