КАНДИДАТНАЯ ДНК-ВАКЦИНА ПРОТИВ РАКА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ: КОНСТРУИРОВАНИЕ, ПОЛУЧЕНИЕ И ИЗУЧЕНИЕ ЭКСПРЕССИИ В ДЕНДРИТНЫХ КЛЕТКАХ
1*, 1*, 2*, 2, 2, 1, 1, 1,2, 1
1 ИХБФМ СО РАН, г. Новосибирск, 2ГНЦВБ «Вектор», р. п. Кольцово
* Авторы внесли равнозначный вклад в работу
Цель. Конструирование, получение и изучение экспрессии в дендритных клетках (ДК) кандидатной полиэпитопной ДНК-вакцины, кодирующей антигены клеток опухолей молочной железы.
Материалы и методы. Высокоиммуногенные Т-клеточные эпитопы выбирали при помощи программы предсказания Т-клеточных эпитопов TEpredict и на основании литературных данных. Полиэпитопную ДНК-вакцину конструировали при помощи программы PolyCTLDesigner, которая оптимизирует взаимное расположение пептидов и дополнительных сигнальных последовательностей. Последовательности целевых генов были синтезированы («Евроген», Россия) и для экспрессии в эукариотических клетках клонированы в плазмиду pcDNA3.1. Секвенирование целевых генов в составе плазмиды проводили в ЦКП «Геномика» (ИХБФМ СО РАН). Штаммы-продуценты получали трансформацией плазмидами реципиентных клеток Escherichia coli DH5αFI [1]. Для выделения плазмидной ДНК, свободной от эндотоксинов, использовали разработанный ранее протокол (патент РФ № 000). Зрелые ДК получали из моноцитов периферической крови здоровых доноров по протоколу, предложенному Mailliard и соавторами [2]. Фенотипирование ДК осуществляли с использованием моноклональных антител к поверхностным маркерам ДК (CD83, CD86, CD14). Образцы клеток анализировали на проточном цитофлуориметре Cytomics FC 500 (Beckman, США) с использованием предложенного производителем программного обеспечения. Уровень продукции интерлейкина-6 (ИЛ-6) и интерлейкина-10 (ИЛ-10) дендритными клетками определяли при помощи наборов для иммуноферментного анализа (Вектор-Бест, Россия). Клетки трансфицировали плазмидными ДНК с помощью липофектамина 2000 (Invitrogene, США) или набора для магнитной трансфекции MATra (PromoCell, Германия). Выделение мРНК из ДК проводили с помощью набора для выделения РНК (BioSilica, Россия). кДНК нарабатывали с помощью набора для обратной транскрипции (RevertAid H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit, Thermo scientific, Germany). Количественную оценку содержания целевой РНК в пробах проводили при помощи TaqMan-ПЦР в реальном времени.
Результаты. С использованием программы TEpredict сконструирована полиэпитопная ДНК-конструкция pBC2, содержащая высоко иммуногенные эпитопы белков HER2 и Маммаглобин-1, сайты протеасомного расщепления, N-концевой лидерный пептид, C-концевой фрагмент белка LAMP-1 человека, и маркерный пептид для оценки уровня экспрессии искусственного антигена. В качестве контрольных ДНК-конструкций использованы плазмиды, кодирующие основные опухолевые антигены рака молочной железы HER2 (pHER2) и Маммаглобин-1 (pMam). При помощи секвенирования генов, клонированных в вектор pcDNA3.1, было показано, что их нуклеотидная последовательность совпадает с теоретически рассчитанными последовательностями. Наработаны препаративные количества бактериальных штаммов продуцентов, выделены и охарактеризованы апирогенные препараты плазмидных ДНК в количествах, достаточных для проведения исследований их биологической активности. Отработан протокол получения зрелых дендритных клеток из моноцитов периферической крови человека, включающий разделение лейкоцитарной фракции в среде для выделения лейкоцитов (LSM), адгезию моноцитарной фракции на пластик и инкубацию моноцитов с интерлейкиновым коктейлем, индуцирующим созревание ДК. Полученные ДК охарактеризованы с использованием проточной цитофлуориметрии и микроскопии. Показано, что ДК в процессе созревания утрачивают моноцитарный маркер CD14 и приобретают маркеры зрелых ДК CD83 и CD86. Подобраны условия доставки плазмидной ДНК в ДК. Для оценки эффективности доставки вакцинной ДНК и уровня экспрессии соответствующей мРНК разработаны ПЦР системы в реальном времени, позволяющие количественно оценить содержание целевой РНК в пробах. Из ДК, трансфицированных плазмидными ДНК, выделена мРНК, наработана кДНК и с помощью разработанной TagMan-ПЦР определен относительный уровень экспрессии исследуемых генов. Показано, что после трансфекции плазмидные ДНК транскрибируются в клетках и количество РНК-продукта в два раза выше в случае магнитной трансфекции (рис. 1).
Рисунок 1. Оценка уровня экспрессии мРНК гена BC2 в ДК методом TagMan-ПЦР. 1 - не трансфицированные клетки; 2 - клетки, трансфицированные при помощи магнитной трансфекции; 3 - клетки, трансфицированные в присутствии липофектамина. Уровень экспрессии мРНК BC2 нормирован на уровень экспрессии гена HPRT1 методом 2 –DDCt.
При помощи иммуноферментного анализа были определены уровни продукции ИЛ-6 и ИЛ-10 дендритными клетками. Показано, что базовый уровень продукции ИЛ-6 незрелыми ДК варьирует в зависимости от донора от 50 до 500 пг/мл, и увеличивается при созревании ДК до пг/мл. Зрелые ДК, трансфицированные исследуемыми плазмидными антигенами сохраняют высокий уровень продукции ИЛ-6. Продукция ИЛ-10 ДК в процессе созревания не меняется (базовый уровень продукции 10 пг/мл), что в совокупности с данными по ИЛ-6 указывает на эффективное созревание ДК, способных индуцировать цитотоксический иммунный ответ.
Выводы. Сконструирована кандидатная полиэпитопная ДНК-вакцина, кодирующая ряд высокоиммуногенных эпитопов онкогенов, гиперэкспрессированных при раке молочной железы. Получены и охарактеризованы препараты плазмидной ДНК, кодирующей целевые полиэпитопные антигены. Получены и охарактеризованы зрелые ДК, способные к презентации антигенов, кодируемых вакцинной ДНК. Подобраны оптимальные условия доставки плазмидной ДНК в ДК. Оценена эффективность доставки вакцинной ДНК и уровень экспрессии соответствующей мРНК с помощью разработанной TagMan-ПЦР в реальном времени.
Работа выполнена при финансовой поддержке Минобрнауки РФ (Соглашение № 000).
Список литературы.
1. Маниатис, Т. Молекулярное клонирование. Методы генетической инженерии. Москва. Мир. 1984. С. 479.
2. Mailliard R. B., Wankowicz-Kalinska A., Cai Q., Wesa A., Hilkens C. M., Kapsenberg M. L., Kirkwood J. M., Storkus W. J., Kalinski P. 2004. Cancer Res.
