На правах рукописи
ВЕТОШКИН
Константин Александрович
РАЗРАБОТКА КОМБИНИРОВАННОГО КРИОКОНСЕРВАНТА ДЛЯ
ЗАМОРАЖИВАНИЯ И ХРАНЕНИЯ ТРОМБОЦИТОВ ПРИ
НИЗКИХ И УЛЬТРАНИЗКИХ ТЕМПЕРАТУРАХ
(лабораторно-экспериментальное исследование)
14.01.21 – гематология и переливание крови
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание
ученой степени кандидата
медицинских наук
Санкт – Петербург
2015
Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки «Кировский научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови Федерального медико-биологического агентства»
Научный руководитель:
доктор медицинских наук, профессор
Официальные оппоненты:
Ганапиев Абдулбасыр Абдурахманович, доктор медицинских наук, врач высшей квалификационной категории, заведующий отделением трансфузиологии Федеральное государственное бюджетное учреждение «Всероссийский центр экстренной и радиационной медицины имени » Министерства Российской Федерации по делам гражданской обороны, чрезвычайным ситуациям и ликвидации последствий стихийных бедствий.
Баховадинов Бурхонидин Баховадинович, доктор медицинских наук, профессор кафедры гематологии, трансфузиологии и трансплантологии Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования "Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика " Министерства здравоохранения Российской Федерации
Ведущая организация:
Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Ижевская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации
Защита состоится 27 апреля 2015 года в ____ часов на заседании диссертационного совета Д 208.074.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении «Российский научно-исследовательский институт гематологии и трансфузиологии Федерального медико-биологического агентства» г. Санкт-Петербург, ул. 2-я Советская, д. 16.
С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФГБУ РосНИИГТ ФМБА России.
Автореферат разослан «____» _________________ 201__ г.
Ученый секретарь
диссертационного совета
доктор медицинских наук
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность исследования
Современная клиническая трансфузиология предусматривает применение компонентов крови, в том числе донорских тромбоцитных концентратов (ТК) (, 2005; и др., 2003; Brand A. et al., 2006). Трансфузии указанного гемокомпонента являются одним из основных средств профилактики и лечения угрожающей жизни тромбоцитопенической кровоточивости, обусловленной лечением по современным протоколам высокодозной химиотерапии, радиационного облучения больных с онкологическими, гематологическими заболеваниями, ДВС-синдромом и применением аппаратов экстракорпорального кровообращения (, 2002; Slichter S., 2011).
Увеличивающаяся частота трансфузий ТК, особенно в экстренных случаях, требует наличия постоянных запасов функционально полноценных клеток. В этой связи вопросы заготовки, консервирования и переливания тромбоцитов приобрели в последние годы большую актуальность. Однако если задача выделения больших количеств тромбоцитов отчасти решается внедрением в практику работы специальной аппаратуры (сепараторов клеток крови), то проблема долгосрочного их хранения далека от окончательного разрешения.
Степень разработанности темы исследования
Регламентированные в настоящее время методы консервирования тромбоцитов позволяют хранить ТК при +20o ÷ +24oС не более 5 дней. С целью удлинения срока хранения тромбоцитов были разработаны новые полимерные контейнеры (Yuasa T. et al., 2004; Hornsey V. S. et al., 2008), аддитивные растворы для сохранения концентратов тромбоцитов до 7 – 12 суток (J. Cid et al., 2014; Slichter S. J. et al., 2006).
Одним из способов увеличения сроков хранения кровяных пластинок является их замораживание. Совершенствование методов криоконсервирования тромбоцитов в значительной степени определяется разработкой хладоограждающих растворов, призванных защитить клетку от разрушающих факторов в процессе замораживания и хранения.
В настоящее время набор криопротекторов для криоконсервирования ТК весьма ограничен. Разрешенным Министерством Здравоохранения Российской Федерации криоконсервантом для замораживания и хранения тромбоцитов при -196оС является раствор «Тромбокриодмац» (Инструкция по криоконсервированию клеток крови, М., 1995) на основе диметилацетамида (ДМАЦ). В Кировском научно-исследовательском институте гематологии и переливания крови разработан хладоограждающий раствор на основе гексаметиленбистетраоксиэтилмочевины (ГМБТОЭМ), изучены его защитные свойства при замораживании тромбоцитов до температур -196оС ( М., 1996), -80оС (, 2006), -40оС (, 2007). Указанные криоконсерванты обладают выраженными хладоограждающими свойствами.
Тем не менее, анализ научных публикаций ( и др., 2010; и др., 2010; и др., 2008) показал, что разработка криоконсервантов с использованием комбинаций хладоограждающих агентов позволяет увеличить количественную и качественную сохранность ТК при замораживании. В связи с тем, что исследования в указанном направлении носят единичный характер, актуальна разработка нового ограждающего раствора на основе комбинации криопротекторов ГМБТОЭМ и ДМАЦ.
Цель работы
Создание нового комбинированного криоконсерванта для замораживания и хранения донорских тромбоцитных концентратов.
Задачи исследования
1. Разработать криоконсервант на основе комбинации криопротекторов ГМБТОЭМ и ДМАЦ для замораживания донорских тромбоцитов.
2. Изучить количественную и качественную сохранность тромбоцитных концентратов на этапах смешивания с криоконсервантом и после замораживания до температур -80°С и -196°С.
3. Определить оптимальный состав комбинированного криоконсерванта для замораживания тромбоцитов, оценить биологическое действие нового хладоограждающего раствора на лабораторных животных.
4. Сравнить эффективность замораживания и хранения кровяных пластинок с разрешенным к клиническому применению криоконсервантом («Тромбокриодмац») и разработанным криофилактиком.
Научная новизна
Впервые разработан и экспериментально изучен комбинированный хладоограждающий раствор на основе ГМБТОЭМ и ДМАЦ для замораживания и хранения ТК при низких и ультранизких температурах. Представлены доказательства того, что новый криоконсервант не оказывает существенного влияния на количество и функции тромбоцитов на этапах смешивания и экспозиции.
Теоретическая и практическая значимость работы
Разработанный комбинированный криоконсервант позволяет создавать запасы ТК для длительного хранения при температурах -80°С и -196°С. Показано, что тромбоциты после замораживания до низких (-80°С) и ультранизких (-196°С) температур со сроком хранения до 1 года и последующего оттаивания сохраняют свою функциональную активность по тестам in vitro на высоком уровне. На основании результатов изучения острой и хронической токсичности криозащитного раствора установлена его безвредность для лабораторных животных. Определена стабильность свойств криоконсерванта при длительном хранении.
Методология и методы исследования
В работе использованы общенаучные методы: анализ (проспективный и рестроспективный), синтез (сравнительно-сопоставительный), частно-научные методы (лабораторные методы исследования), методы математической статистики.
Основные положения, выносимые на защиту
1. Разработан оригинальный комбинированный криоконсервант на основе комбинации криопротекторов гексаметиленбистетраоксиэтилмочевины и диметилацетамида для замораживания тромбоцитов.
2. Криоконсервирующий раствор обеспечивает высокую количественную сохранность и функциональную полноценность донорских тромбоцитов при замораживании и хранении при -80°С ÷ -196°С.
3. Новый криофилактик для донорских ТК обладает хладоограждающей способностью, не уступающей раствору «Тромбокриодмац».
4. Разработанный криоконсервант отличается низкими токсическими свойствами при однократном и многократном введении лабораторным животным.
Внедрение
Результаты диссертационной работы используются в учебном процессе в ГБОУ ВПО ПГМА им. ак. Минздрава России.
Степень достоверности и апробация работы
Достоверность результатов подтверждается объемом фактического материала, использованием современных средств и лабораторных методов исследования.
Материалы по теме диссертации доложены и обсуждены на Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых с международным участием «Вопросы трансфузиологии и клинической медицины (Епифановские чтения)» (г. Киров, 2 - 3 октября 2012 г.); на заседаниях Кировского научного общества гематологов и трансфузиологов (сентябрь, 2013 г.); на Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии» (г. Санкт-Петербург, 24 – 25 июня 2014 г.).
Апробация диссертации состоялась 03 июня 2014 г. на заседании Ученого совета Федерального государственного бюджетного учреждения науки «Кировский научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови Федерального медико-биологического агентства».
Объем и структура диссертации
Диссертация представляет собой рукопись объемом 86 страниц машинописного текста и состоит из введения, 4 глав, заключения, выводов, списка литературы, который содержит 131 наименование работ, в том числе 66 отечественных и 65 зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 16 таблицами и 15 рисунками.
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 11 печатных работ, из них 2 – в журналах, рекомендованных ВАК РФ, получен один патент на изобретение.
Работа выполнена на базе лаборатории консервирования крови и тканей (руководитель – д. м.н., доцент ), вивария и станции переливания крови ФГБУН «Кировский научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови ФМБА России» (директор – ).
Личное участие автора в получении результатов
Автор принимал непосредственное участие в разработке нового криоконсерванта, приготовлении опытных образцов, определении их свойств, подготовке ТК к замораживанию, оценке количественной и функциональной сохранности донорских тромбоцитов до и после криоконсервирования. Автором лично проведена статистическая обработка и анализ полученных результатов.
Материалы и методы исследований
Объектом исследования служили опытные образцы комбинированного криоконсерванта, основными компонентами которого являлись ГМБТОЭМ и ДМАЦ. Растворы криофилактика готовили в условиях стерильного бокса в лаборатории консервирования крови и тканей, стерилизовали автоклавированием (1,2 атмосферы – 30 минут).
Осмолярность и температуру кристаллизации (криоскопическую точку) готовых образцов криофилактика, донорских ТК (нативных, в смеси с хладоограждающими растворами) определяли с помощью криоскопа ОМТ-5-01 по температуре (точке) переохлаждения раствора. Для определения показателя кислотности (рН) криоконсервирующих растворов и суспензий тромбоцитов использовали рН-метр – иономер «Эксперт-001».
Для проведения исследований использовали образцы концентратов тромбоцитов, полученных аппаратным тромбоцитаферезом (сепаратор клеток крови «MCS+», Haemonetics) от 44 доноров. ТК смешивали с растворами криоконсерванта в объемном соотношении 1:1. Экспозиция клеток с криофилактиками составляла до 15 минут.
Замораживание донорских ТК до -80°С проводили по экспоненциальной программе (, 2006). С целью хранения тромбоцитов в условиях ультранизких температур охлаждение биоматериала осуществляли в программном замораживателе PLANER INTEGRA со скоростью 3°С/мин до -90°С (Инструкция по криоконсервированию клеток крови, М., 1995) с последующим переносом образцов в биохранилище. ТК в замороженном состоянии хранили от 1 недели до 1 года. По окончании срока наблюдения размораживание тромбоцитов выполняли при +37 ÷ +38°С в водяной ванне при постоянном перемешивании.
Подсчет количества тромбоцитов проводили в камере Горяева с определением концентрации кровяных пластинок (х109/л). Исследование функций тромбоцитов осуществляли непосредственно после выделения их из цельной крови, после 5 – 15 минут экспозиции с испытуемыми криоконсервантами перед замораживанием и сразу же после размораживания образцов ТК. Функциональную активность тромбоцитов исследовали методом определения адгезии к стеклу (Marx R., 1957); индуцированную агрегацию тромбоцитов с АДФ (в концентрации 2,5 мкг/мл), адреналином (2,5 мкг/мл) турбидиметрическим методом (Born G. V.R., 1962) с помощью лазерного агрегометра «Биола» модели LA – 230. Агрегатограммы регистрировали в течение 10 минут после добавления индукторов агрегации. Определяли максимальную величину светопропускания и средний радиус агрегатов. Реакцию на гипотонический шок (РГШ) определяли на спектрофотометре СФ-46 при длине волны 610 нм (Handin R. I. et al., 1970). Регистрацию оптической плотности пробы кровяных пластинок проводили в течение 10 минут. Оценивали величину возврата к исходному значению (в %). Величины адгезии, агрегации и РГШ исследовали в пробах при стандартном количестве тромбоцитов 250 000 – 350 000 в мкл. Сравнение полученных результатов проводили с показателями нативных ТК.
С целью определения стабильности характеристик криофилактика (рН, осмолярность) проводили сравнение показателей сразу после приготовления раствора и по истечении 2 лет хранения при температуре +4 ÷ +6°С. Обработку цифровых результатов осуществляли с помощью методов описательной статистики, критериев Стьюдента, Уилкоксона. Вычисляли средние арифметические величины и стандартное отклонение. О статистической значимости различий судили по показателю р менее 0,05.
Количество проведенных лабораторных исследований представлено в таблице 1.
Таблица 1. Количество выполненных лабораторных исследований
№ п/п | Вид исследования | n |
1 | Осмометрия | 112 |
2 | рН-метрия | 125 |
3 | Подсчет количества тромбоцитов | 255 |
4 | Агрегометрия | 510 |
5 | Измерение РГШ тромбоцитов | 255 |
6 | Адгезия тромбоцитов | 255 |
7 | Регистрация термограмм | 35 |
Всего | 1547 |
Для определения биологических свойств криоконсерванта использовали лабораторных животных (белые мыши весом 19 – 21 г). Аномальную (острую) токсичность изучали согласно методике ГФ (2008 г.). Хроническую токсичность препарата определяли путем ежедневного внутрибрюшинного введения препарата мышам по 0,5 мл на протяжении 10 суток. Контрольную группу составили животные, получавшие 0,9% раствор натрия хлорида внутрибрюшинно в том же объеме. Влияние криоконсерванта при многократном введении лабораторным мышам оценивали по гистологической картине органов животных (печень, почки, сердце, головной мозг).
Результаты исследований и их обсуждение
Определение оптимальных концентраций компонентов криофилактика для замораживания ТК является одной из основных задач при разработке эффективного хладоограждающего раствора. Изучено 6 вариантов консерванта, включавших от 1 до 5% ГМБТОЭМ и от 1,25 до 4,5% ДМАЦ (таблица 2).
Таблица 2. Состав комбинированного криоконсерванта
Состав | Вариант раствора | |||||
1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | |
ГМБТОЭМ, г | 1 | 2 | 2 | 4 | 4 | 5 |
ДМАЦ, г | 1,25 | 1,75 | 2,5 | 3,5 | 4 | 4,5 |
лимонная кислота*, г | 0,1 | 0,2 | 0,2 | 0,4 | 0,4 | 0,5 |
вода для инъекций | до 100 мл |
* лимонная кислота применена с целью выравнивания уровня рН растворов.
Наблюдали возрастание осмолярности растворов (от 184 до 750 мосм/л) и снижение температуры их кристаллизации (от -0,327 до -1,402°С), определенной по криоскопической точке при увеличении концентрации компонентов криоконсерванта. Показатель кислотности криофилактика варьировал в пределах 5,6 – 6,0.
После смешивания ТК с криоконсервантами осмолярность и кислотность суспензии тромбоцитов изменялись в зависимости от варианта хладоограждающего раствора (таблица 3).
Таблица 3. Физико-химические свойства ТК после смешивания с растворами криоконсерванта (M±m)
Параметры | Нативный ТК | Варианты раствора | |||||
1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | ||
рН | 7,3 ±0,1 (n=24) | 7,1 ±0,1* (n=19) | 6,8 ±0,1* (n=18) | 6,8 ±0,1* (n=18) | 6,5 ±0,1* (n=10) | 6,3 ±0,1* (n=10) | 6,2 ±0,1* (n=10) |
Осмолярность, мосм/л | 309,0 ±13,0 (n=24) | 246,2 ±8,6* (n=19) | 299,9 ±11,3 (n=18) | 350,8 ±19,5* (n=18) | 439,0 ±7,1* (n=10) | 536,4 ±22,3* (n=10) | 541,0 ±23,0* (n=10) |
* p < 0,05 приведено в сравнении с показателями нативных ТК.
Показатель кислотности нативных кровяных пластинок определен на уровне 7,3±0,1 (n=24). При инкубации нативных тромбоцитов с криозащитными растворами выявлено достоверное снижение рН суспензии клеток во всех случаях (р<0,05). Тем не менее, искомый показатель клеточной суспензии при смешивании с растворами №№ 1 – 3 оставался выше значения 6,5. При экспозиции клеток с консервантами №№ 4 – 6 происходило снижение рН ТК ниже критического уровня 6,5.
Осмолярность нативных кровяных пластинок определена на уровне 309,0±13,0 мосм/л (n=24). При смешивании суспензии клеток с криоконсервантом № 1, содержащим наименьшие концентрации веществ, осмолярность составила 246,2±8,6 мосм/л, а в случае раствора № 6 (наибольшие концентрации компонентов) возрастала до 541,0±23,0 мосм/л. Осмолярность ТК в смеси с раствором № 2, включавшим 2% ГМБТОЭМ и 1,75% ДМАЦ, оставалась на физиологическом уровне (299,9±11,3 мосм/л).
Выявленные изменения физико-химических свойств донорских ТК при смешивании с растворами криоконсерванта приводят к изменениям функциональных характеристик клеток (таблица 4).
Таблица 4. Характеристика ТК после смешивания с растворами криоконсерванта (M±m)
Показатели | Варианты растворов | ||||||
1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | ||
Количество тромбоцитов | 93,5 ±4,0 (n=15) | 92,9 ±3,6 (n=15) | 96,2 ±3,8 (n=15) | 93,3 ±3,8 (n=10) | 95,5 ±3,7 (n=10) | 95,8 ±2,2 (n=10) | |
АДФ – индуцированная агрегация | степень агрегации | 83,5 ±7,2 | 84,0 ±9,0 | 69,0 ±10,9* | 60,4 ±7,8* | 69,1 ±10,9* | 45,2 ±23,4* |
средний размер агрегатов | 82,1 ±12,8 | 67,3 ±12,3 | 79,6 ±6,9 | 61,7 ±8,8* | 54,5 ±12,9* | 39,1 ±19,2* | |
Адреналин-индуцированная агрегация | степень агрегации | 80,3 ±15,1 | 87,6 ±8,0 | 42,2 ±18,5* | - | - | - |
средний размер агрегатов | 80,8 ±7,7 | 70,4 ±7,2 | 14,3 ±5,4* | - | - | - | |
Адгезия к стеклу | 77,8 ±16,6 | 75,9 ±12,8 | 61,5 ±14,5* | 49,5 ±6,5* | 38,5 ±10,9* | 20,4 ±8,5* | |
РГШ | 98,1 ±1,6 | 97,0 ±2,6 | 94,5 ±2,3 | 92,5 ±7,2 | 85,8 ±9,9 | 79,1 ±10,6 |
*p < 0,05 приведено в сравнении с раствором № 1
После смешивания с ТК, их экспозиции со всеми растворами не обнаружено существенного влияния на количество клеток. Функция кровяных пластинок в смеси с растворами №№ 4 – 6 определена в пределах от 20,4 до 69,1% и достоверно отличалась в меньшую сторону в сравнении с растворами №№ 1 – 3 (42,2 – 84,0%). В связи с тем, что функциональная активность тромбоцитов в большей степени сохранялась при смешивании с консервантами №№ 1 – 3, замораживание донорских ТК проводили с указанными образцами криофилактика.
Сравнение качественной сохранности ТК, замороженных с растворами №№ 1 – 3, показало, что при недельном сроке низкотемпературного хранения образцы №№ 1 и 3 обеспечивали достоверно меньший уровень функциональной активности клеток по сравнению с раствором № 2. Лучшие показатели сохранности и функции ТК обеспечивал консервант, включающий 2% ГМБТОЭМ и 1,75% ДМАЦ (образец № 2): количество тромбоцитов после размораживания составило 93,6±2,2%, агрегационная активность с АДФ – 67,9±11,8%, в ответ на адреналин – 82,7±11,7%, адгезионная способность к стеклу – 72,2±10,2%, а осмотическая резистентность – 86,3±7,6%. Указанный состав раствора был признан наиболее эффективным по своим физико-химическим характеристикам, воздействию на тромбоциты и хладоограждающим свойствам. В этой связи дальнейшие исследования проводили с криоконсервантом № 2.
Изучили количественные и качественные характеристики ТК при сроках хранения 1, 6 и 12 месяцев после замораживания до -80°С (таблица 5). Показатели сохранности тромбоцитов (в процентном отношении к уровню нативных ТК) в течение 6 и 12 месяцев сравнивали с аналогичными параметрами клеток, хранившихся 1 месяц.
Таблица 5. Сохранность ТК при низкотемпературном хранении в течении 1, 6 и 12 месяцев (M±m)
Показатель | Срок хранения ТК | |||
1 месяц | 6 месяцев | 12 месяцев | ||
Количество тромбоцитов | 91,1±4,4 (n = 20) | 94,6±4,5 (n = 20) | 90,3±4,2 (n = 20) | |
АДФ-индуцированная агрегация | степень | 70,5±5,2 | 71,9±8,9 | 65,9±15,1 |
размер агрегатов | 71,7±9,6 | 64,5±10,9* | 67,3±9,5* | |
Адреналин-индуцированная агрегация | степень | 77,0±11,2 | 78,1±12,6 | 75,3±16,6 |
размер агрегатов | 71,9±0,9 | 73,1±10,1 | 59,1±18,8* | |
Адгезия к стеклу | 74,4±9,8 | 75,2±7,5 | 63,5±6,1* | |
РГШ | 90,3±5,6 | 90,9±3,9 | 88,8±3,1 |
* p < 0,05 (приведено в сравнении со сроком хранения 1 месяц)
Сохранность количества тромбоцитов, степени их индуцированной агрегации и способности к РГШ достоверно не изменялась при изученных сроках хранения. Отмечено, что после 6 месяцев хранения достоверно снизилась сохранность среднего размера агрегатов в ответ на внесение АДФ (до 64,5±10,9%), а через 1 год – сохранность радиуса агрегатов при адреналин-индуцированной агрегации (59,1±18,8%) до и адгезионной способности тромбоцитов (до 63,5±6,1%).
Сравнили хладоограждающую способность нового криоконсерванта и раствора «Тромбокриодмац» при сроке хранения концентратов тромбоцитов 1 год в условиях температуры -80°С (рисунок 1). Количественная сохранность кровяных пластинок при их низкотемпературном хранении с новым криоконсервантом составила 90,3±4,2% (n = 20) и достоверно не отличалась от «Тромбокриодмац» (88,0±2,9%, n = 15).
Рисунок 1. Хладоограждающая способнось нового криоконсерванта и раствора «Тромбокриодмац»
Не выявлено статистически достоверных различий в функциональной активности тромбоцитов, замороженных с раствором № 2 (АДФ-индуцированная агрегация - 65,9±15,1%, адгезия стеклу - 63,5±6,1%), и «Тромбокриодмац» (соответствующие показатели составили 71,8±7,6% и 65,0±3,8%; р>0,05). Однако осмотическая резистентность кровяных пластинок при криоконсервировании с комбинированным криоконсервантом составила 88,8±3,1%, и была достоверно выше, чем при использовании раствора «Тромбокриодмац» (71,3±4,8%).
Исследованы количественные и функциональные свойства ТК, замороженных с новым криоконсервантом по линейной программе до ультранизких температур. После 1 года хранения ТК характеризовались высокой сохранностью количества клеток (88,1±5,6%). В то же время отмечено незначительное снижение показателей агрегационной активности кровяных пластинок (в ответ на внесение АДФ – до 74,8±11,2, на адреналин – до 71,5±14,8% от исходных показателей), адгезии к стеклу (до 67,1±4,0% от уровня, определенного для нативных клеток). Выявлено уменьшение среднего размера агрегатов до 62,9±18,3% (в случае индукции АДФ) и до 69,3±10,1% (при индукции адреналином). Сохранность способности ТК к РГШ составила 85,7±1,6% от значений, зарегистрированных до замораживания. Можно заключить, что, несмотря на некоторое снижение функциональных характеристик тромбоцитов, их активность осталась на высоком уровне.
При сопоставлении результатов замораживания и хранения ТК в течение 1 года при температурах -80°С и -196°С не выявлено достоверных различий как по количеству, так и качественным характеристикам клеток после декриоконсервирования (рисунок 2).
Рисунок 2. Сохранность ТК после 1 года хранения при низких (-80°С) и ультранизких (-196°С) температурах
Серия экспериментов по определению биологических свойств новой хладоограждающей среды (аномальная, хроническая токсичность), проведенная на белых лабораторных мышах, показала, что криоконсервант проявляет низкие токсические свойства. При оценке гистологических препаратов не выявлено существенных морфологических изменений внутренних органов лабораторных животных (сердце, печень, почки, головной мозг) на фоне многократного ведения препарата.
С целью определения стабильности свойств криофилактика (рН, осмолярность) проводили сравнение показателей сразу после приготовления раствора и по истечении 2 лет хранения при температуре +4 ÷ +6°С. Значение рН свежеприготовленных образцов криоконсерванта составило 5,73±0,18 (n = 10). По истечении 24 месяцев хранения раствора показатель оказался на том же уровне – 5,71±0,14 (n = 10) (р>0,05). Уровень осмолярности раствора до хранения составил 284,7±4,9 (n = 10) мосм/л, к концу срока наблюдения – 278,2±8,1 (n = 10) мосм/л (р>0,05). Следовательно, криоконсервант оставался стабильным по данному критерию также, как и по значению рН. Приведенные результаты демонстрируют стабильность свойств криоконсерванта при хранении в течение 2 лет.
Таким образом, на основании проведенных комплексных лабораторных и биологических исследований установлено, что разработанный комбинированный криоконсервирующий раствор не оказывает существенного влияния на тромбоциты крови человека на этапах смешивания и экспозиции. Новый криофилактик обеспечивает высокую количественную и функциональную сохранность ТК при их замораживании, хранении в течение 1 года и последующем оттаивании.
Выводы
1. Разработан криоконсервирующий раствор для замораживания тромбоцитных концентратов на основе комбинации гексаметиленбистетраоксиэтилмочевины (2%) и диметилацетамида (1,75%), позволяющий обеспечить высокую сохранность клеток при замораживании.
2. Новый криоконсервант не оказывает токсического влияния на функциональные свойства тромбоцитов на всех этапах криоконсервирования при различных температурных режимах.
3. Количественная сохранность тромбоцитных концентратов, замороженных с новым криоконсервантом и хранившихся в течение 1 года при температуре -80°С, после размораживания составила более 90%, их функции - от 63,5 до 88,8%, а при температуре -196°С оставалось более 88% количества тромбоцитов с функциональной активностью от 62,9 до 82,7%.
4. Разработанный хладоограждающий раствор безвреден при введении лабораторным животным (по результатам определения острой и хронической токсичности), обладает стабильностью при хранении в условиях температуры +4 ÷ +6°С в течение 2 лет.
5. Новая криозащитная среда для замораживания тромбоцитов не уступает по хладоограждающим свойствам раствору «Тромбокриодмац» в условиях низкой температуры, а по показателям реакции на гипотонический шок – превосходит его.
Рекомендации по использованию выводов и перспективы дальнейшей разработки темы
1. Разработка метода замораживания донорских тромбоцитных концентратов с новым комбинированным криоконсервантом.
2. Расширение спектра биологических испытаний нового криофилактика, в том числе проведение трансфузиологических исследований на лабораторных животных.
3. Новый криоконсервирующий раствор может быть рекомендован для апробации в отделениях долгосрочного хранения крови с целью замораживания и длительного хранения донорских ТК при низких и ультранизких температурах.
Список работ, опубликованных по теме диссертации
1. Разработка комбинированного криоконсерванта для замораживания тромбоцитов / , , // Трансфузиология. – 2011.- Т. 12. - №2.- С. 47 – 48.
2. Агрегационная активность донорских тромбоцитных концентратов / , , ... [и др.] // Трансфузиология.- 2011.- №2,Т. 12.- С.135-136.
3. Свойства разрабатываемого комбинированного консерванта для замораживания тромбоцитных концентратов / , , [и др.] // Всерос. науч.-практич. конф. молодых ученых с межд. участием «Вопросы трансфузиологии и клинической медицины (Епифановские чтения)». - Киров, 2012. - С. 13 – 15.
4. Сравнение эффективности трансфузий нативных и криоконсервированных тромбоцитных концентратов / , ... [и др.] // Всерос. науч.-практич. конф. молодых ученых с межд. участием «Вопросы трансфузиологии и клинической медицины (Епифановские чтения)».- Киров, 2012.- С. 114 – 115.
5. Сведенцов, криопротекторный раствор для замораживания тромбоцитов / , , [и др.] // Патент РФ №2 Приоритет от 01.01.2001., зарегистрирован 27.03.2013.
6. Сохранность донорских тромбоцитов при их замораживании под защитой комбинированного криоконсерванта // , , [и др.] // Трансфузиология. – 2012. – Т. 13. - № 3. – С. 39 – 40.
7. Биологические свойства разрабатываемого криоконсерванта /, , [и др.] // Трансфузиология. – 2012. – Т. 13. - № 3. – С. 38 – 39.
8. Свойства комбинированного консерванта для замораживания тромбоцитных концентратов / , , // Пермский медицинский журнал. – 2013. – Т. ХХХ. - № 6. – С. 87 – 92.
9. Результаты криоконсервирования донорских тромбоцитов под защитой нового криоконсерванта при температуре -80°С / ,
, , // Вестник службы крови России.- 2014. - № 2. – С. 14 – 17.
10. Сохранность донорских тромбоцитных концентратов при различных сроках низкотемпературного хранения / , , // Международная заочная научно-практическая конференция «Теоретические и практические аспекты современной криобиологии», сборник научных трудов. - г. Сыктывкар, 2014. – С. 117 – 120.
11. Экспериментальное изучение комбинированного криоконсервирующего раствора для замораживания тромбоцитов / , , // ТрансфузиологияТ. 15, № 2. – С. 42 – 43.
Автор выражает благодарность за помощь и содействие в выполнении работы научному руководителю д. м.н., профессору , заместителю директора, д. м.н., профессору , ученому секретарю, к. м.н., доценту , руководителю лаборатории консервирования крови и тканей, д. м.н. , в. н.с., к. м.н. , лаборанту с высшим образованием , врачам – трансфузиологам , , сотруднику вивария .
Сокращения и условные обозначения
АДФ – аденозиндифосфорная кислота
ГМБТОЭМ – гексаметиленбистетраоксиэтилмочевина
ГФ – Государственная Фармакопея
ДМАЦ – диметилацетамид
РГШ – реакция на гипотонический шок
ТК – тромбоцитный концентрат.
