EPISCREEN PLUS ™ - определение α - глюкозидазы (25 тестов)
Обновление 27.04.2012
Сокращения
CLSI – Институт клинических и лабораторных стандартов.
CV – коэффициент вариации
IU – международная единица
LOD – предел обнаружения
LOQ – предел линейности
NAG – нейтральная альфа-глюкозидаза
OD – оптическая плотность
PNP – пара (4)-нитрофенол
PNPG - пара (4)-нитрофенол-альфа-Д-глюкопиранозид
WHO – Всемирная организация здравоохранения
Набор EPISCREEN PLUS рассчитан на определение ферментативной активности не менее 25 образцов (в том числе корректирующее вещество).
Состав набора:
Реагент 1 (5 мл): реакционный буфер (pH6,8), содержащий 1% SDS.
Реагент 2 (0,15 мл): раствора субстрата (PNPG в DMSO).
Реагент 3 (5 мл): раствор ингибитора (буфер, содержащий глюкозу).
Реагент 4 (60 мл): остановочный (стоп) буфер (0,02 М NaOH).
Реагент 5 (1 мл): стандартный раствор (5мМ PNP).
Реагент 6 (60 мл): буфер для разведения (0,02 М NaOH + 0,1% SDS)
Материалы, не входящие в состав набора:
- Спектрофотометр с фильтром 405 нм.
- Теплая водяная баня /термошейкер.
- Расходные материалы: планшет на 96 лунок, наконечники на 1,5 мл, пробирки типа Eppendorf).
Основные сведения.
Нейтральная изоформа α-глюкозидазы секретируются исключительно в придатках яичек и является достоверным маркером функциональной способности придатков яичек. У пациентов с азооспермией и нормальной концентрацией андрогенов в крови, активность нейтральной альфа-глюкозидазы в семенной плазме является специфическим маркером секреторной функции эпидимиса.
У пациентов с двухсторонней обструктивной азооспермией «выше» придатков (между эпидидимисом и эякуляторным каналом) наблюдаются очень низкие концентрации этого фермента в эякуляте. И, наоборот, у пациентов с азооспермей, вследствие нарушений процессов сперматогенеза, обструкцией между придатками и яичками или в самих яичках, сохраняется нормальная активность этого фермента в эякуляте. Таким образом, определение активности α-глюкозидазы в семенной плазме мужчин с азооспермией,
в большинстве случаев позволяет дифференцировать причину азооспермии.
Низкая активность нейтральной α-глюкозидазы в семенной плазме пациентов с олигозооспермией, может указывать на частичную обструкцию эпидидимиса, связанную с инфекциями или воспалительными заболеваниями. У пациентов с нормальной концентрацией сперматозоидов активность α-глюкозидазы в семенной плазме коррелирует с изменениями морфологии средней части и хвоста сперматозоида при окраске по Шорру.
Принцип метода.
Альфа-глюкозидаза катализирует (pH= 6,8; Т=37°C) превращение субстрата 4-нитрофенил-ад-глюкопиранозида (PNPG) в глюкопиранозид и 4-нитрофенол, как показано ниже. Желтый цвет последнего продукта измеряется спектрофотометрически при 405 нм.
PNPG + альфа-глюкозидаза → альфа-D-глюкопиранозид + PNP (желтый)
Поскольку реакционный буфер содержит SDS, кислая форма альфа - глюкозидазы (простатическая), селективно ингибируется. Это позволяет определить непосредственно нейтральную форму фермента.
Определение активности фермента
Активность α-глюкозидазы выражается в МЕ в литре (или мМЕ/мл). Одна единица способна высвобождать 1 мкмоль PNP из молекулы PNPG в минуту, при определенных условиях (рН = 6,8, T = 37°C) - 7.
АНАЛИТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ EpiScreen Plus ™ был разработан для оценки нейтральной формы фермента.
Основными преимуществами нового комплекта являются:
1) оценка нейтральной формы фермента
2) сокращение времени инкубации
3) малый объем образца спермы
4) использование калибровочного графика для вычисления результатов
5) наличием ингибитора (коррекция фона)
В таблице 1 показано сравнение методов Episcreen ™, EpiScreen Plus ™, и метода ВОЗ.
Таблица 1: Сравнение Episcreen ™, EpiScreen Plus ™ и метода ВОЗ.
активность ферментов | Общая | Нейтральная | Нейтральная |
инкубационный | 4 ч | 2 ч | 2 ч |
Стандартная кривая | PNP | PNP | |
Коррекция фона | глюкоза | кастаноспермин | |
объем пробы | 125 мкл | 20 мкл | 15 мкл |
EpiScreen PlusTM и ВОЗ метод тестировались параллельно на 144 образцах семенной плазмы, полученной от 94 пациентов (доноры и 50 мужчин после vas-эктомии (отрицательный контроль) соответственно). Метод сравнения показал, что оба исследования дают одинаковые результаты. EpiScreen Plus ™ немного отличаются от ВОЗ:
а) реакционным буфером (рН 6,8)
б) использованием глюкозы вместо кастаноспермина в качестве ингибитора.
Процесс ингибирования α-глюкозидазы глюкозой (ингибирование продукта) является рН-зависимым и объясняется связыванием глюкозы с сайтом связывания моносахаридов
α–глюкозидазы. Наши экспериментальные данные показали дозозависимое снижение активности фермента. Концентрация глюкозы в растворе ингибитора EpiScreen Plus ™ была оптимизирована для получения показателей, коррелирующих с методом ВОЗ, использующем в качестве ингибитора кастаноспермин.
ВОЗ рекомендует применять только два образца для внутреннего контроля для коррекции фоновой концентрации.
Наши эксперименты показали, что вариабельность фона образцов спермы довольно большая (+ / - 20%). Мы рекомендуем использовать контроль коррекции фоновой концентрации для каждого образца семенной плазмы.
Выполнение исследования.
Все параметры были рассчитаны на основе руководства Института клинических лабораторных стандартов.
Диапазон измерений: 2.32-144 мМЕ/мл
Чувствительность: 96,0% (вазэктомия / нормоспермия)
Специфичность: 93,6% (вазэктомия / нормоспермия)
Точность:
Низкие значения: 0,96 мМЕ/мл
Высокие значения:: 3,70 мМЕ/мл
Коэффициент вариации в рамках одной постановки: 3,08%
Коэффициент вариации между постановками: 10,52%
Порог отсечки (Cutoff): 6,35 мМЕ / мл или19,98 мМЕ в эекляте (с поправкой на объем эякулята)
Условия и срок хранения. Набор EpiScreen Plus ™ необходимо хранить при температуре 2-8°C, в защищенном от солнечного света месте, стабильность набора 24 месяца.
Проверка перед использованием.
Не использовать продукт, в случае, если пробка на флаконах открыта или продукт поставлен в нарушенной упаковке.
Хранить при температуре 2-8°C.
В реагенте 1 может возникнуть осадок, который исчезает при нагревании до 37°C.
Типы образцов.
Анализ может быть выполнен на образце свежей или замороженной семенной плазмы.
Методика проведения исследования
Перед использованием нагрейте реагенты 1, 2, и 3 до 37°C в течение 30 минут.
Мы рекомендуем использование терморегулируемой водяной бани для оптимального нагрева образцов.
Не инкубируйте в воздушном инкубаторе, так как это может привести к нарушению результатов анализа.
Выполните следующие шаги: 1. Для каждого анализируемого образца:
- Приготовить реакционный раствор: 3 мкл реагента 2 в 147 мкл реагента 1
- Приготовить раствор ингибитора: 3 мкл реагента 2 в 147 мкл из реагента 3
2. Внести по 20 мкл образца в две пробирки типа Eppendorf объемом 1,5 мл
3. Добавить 130 мкл реакционного раствора в одну пробирку (образец) и 130 мкл раствора ингибитора в другую (проба с глюкозой, коррекция фона).
4. Перемешать и инкубировать точно 2ч при 37°C
5. За время инкубации необходимо подготовить растворы для построения калибровочной кривой. Приготовьте самый высокий стандарт (200 мкм) путем растворением 100 мкл реагента 5 в 2400 мкл реагента 6. Для приготовления других стандартов используйте разведения, как указано в таблице 2. Реагент 6 используется как «нулевой» стандарт.
Таблица 2: Стандартные разведения PNP
Стандарт «200 мкл» (мкл) | Reagent 6 (мкл) | Концентрация калибратора (мкл) |
375 | 125 | 150 |
250 | 250 | 100 |
125 | 375 | 50 |
25 | 475 | 10 |
0 | 500 | 0 |
6. Через 2 ч, остановите инкубацию путем добавления 1 мл 4 реагента 4 и перемешайте (с использованием Vortex).
7. Внесите по 200 мкл всех стандартов / образцов в лунки планшета.
8. Считайте абсорбцию при 405 нм.
Расчет результатов по калибровочному графику.
Вычтите значение ОП нулевого стандарта из всех значений ОП стандартов (дельта ОП). Отложите значения дельта ОП (Y-ось) против стандартных концентраций (по оси Х) и постройте график линейной регрессии. Коэффициент R2 должно быть не менее 0,99.
|
Пример показан ниже.
Вычисление активности фермента:
Вычтите значение ОП нулевого стандарта из всех значений ОП образцов и соответствующих образцов с глюкозой. Вычтите значение дельта OD образцов с глюкозой из значения дельта ОП образца (коррекция фона). Рассчитайте соответствующие значения концентрации PNP путем деления ОП скорректированного по фону образца на угол наклона стандартной калибровочной кривой. Окончательно активность фермента (мМЕ / мл) вычисляется путем умножения значения PNPх0,479. (См. ниже).
Пример расчета
1. ОП образца=0,845; ОП образца с глюкозой=0,06, угол наклона калибровочного графика 0,0097;
2. Коррекция по фону семенной плазмы=0,845-0,06=0,785;
3. Концентрация PNP=0,785/0,0097=80,93мкМ;
4. Активность фермена-80,93*0,479=38,76
Полученная активность фермента должна быть умножена на объем эякулята для оценки активности во всем объеме эякуляте.
Примечание
Стандартная кривая включает отдельные точки от 0 до 200 мкМ, поскольку значение PNP в большинстве случаев находятся в этих пределах. Экспериментально показана, что линейность гарантирована до 300 мкМ. При желании можно изменить калибровочный график до 300 мкМ,
что соответствует активности фермента 144 мМЕ/мл. При более высокой активности рекомендуется разведение образца.
Фактор коррекции.
Фактор получен с учетом разведения образца, времени инкубации (120 мин). В этом исследовании образец начальный объем пробы 20 мкл в конце доводится до объема 1150 мкл
(20 мкл образца + 130 мкл реакционного буфера + 1000 мкл стоп буфера). Окончательный фактор разведения - 57,5. Активность фермента определяется образованием PNP в минуту.
Таким образом, полученный результат надо умножить на фактор разведения и разделить на 120 для учета временного фактора (57,5/120=0,479).
Предупреждение.
Этот тест направлен на помощь в диагностике, как и другие биологические тесты: интерпретация результатов должна проводиться в рамках клинических и анамнестических данных. Должны быть исключены другие случаи недостаточности функции эпидидимиса, например, гипоандрогения или тяжелая атрофия яичек.
Библиография.
