| федеральное государственное казенное общеобразовательное учреждение «Московский кадетский корпус «Пансион воспитанниц Министерства обороны Российской Федерации» |
"Эндофитные дрожжевые группировки в соплодиях ананаса"
Авторы:
обучающиеся 10 и 11 классов
ФГКОУ МКК Пансион воспитанниц МО РФ
Москва 2015 г.
Содержание
Введение ...................................................................................................................... 3
Цели и задачи……………………………………………………………………….... 4
Глава 1. Теоретические предпосылки исследуемой работы…………………. 5 - 11
1.1. Дрожжи. Что это такое?................................................................................... 5 - 7
1.2 Эндофитные дрожжи....................................................................................... 8 - 11
Глава 2. Практическая часть………………………………………………… .. 12 - 14
Результаты……………………………………………………………………... 15 - 16
Выводы………………………………………………………………………………. 17
Список литературы…………………………………………………………………..18
Приложение …………………………………………………………………19 - 20
Приложение ……………………………………………………………………... 21
Введение
В мире технологий и развивающейся науки все реже можно найти экологически чистые продукты. Несмотря на то, что в нашей жизни появились новые способы увеличения срока хранения продуктов, и, следовательно, питательных веществ, необходимых для здорового и правильного развития организма человека, мы не замечаем естественных «помощников», которые порой находятся совершенно в неожиданных местах.
Такими незаметными для невооруженного глаза организмами являются эндофиты - симбиотические грибы или бактерии, живущие внутри растений. Не обращая на них внимания, мы встречаемся с ними каждый день и употребляем в пищу намного больше, чем нам кажется.
Цель проектной работы
1. Исследовать эндофитные дрожжевые сообщества в соплодиях ананаса;
2. Сделать предположение о вероятной роли эндофитных дрожжей в сочных плодах и оценить их возможное влияние на здоровье человека.
Задачи:
1. Используя метод посева выделить дрожжевые грибы из внутренних сочных тканей плодов;
2. С помощью макро - и микроморфологических признаков, а также современных молекулярно-генетических методов идентифицировать выделенные штаммы дрожжей.
Гипотеза:
Так ли безопасно употребление в пищу продуктов, содержащих эндофитные дрожжи?
Какое влияние эти микроорганизмы оказывают на человека?
Возможное пагубное воздействие эндофитных дрожжей на организм и здоровье человека.
Глава 1. Теоретические предпосылки исследования
1.1. Дрожжи. Что это такое?
Как, наверно, многие знают, дрожжи — это грибы, но грибы не совсем обычные. Эти микроорганизмы, независимо от того, имеют ли они мицелиальные структуры, способны существовать и размножаться преимущественно в одноклеточной форме.
Дрожжи от общеслав. видоизменение под влиянием слов типа выжимки, сливки, помои и т. д. собирательного дрожжие, суф. производного (суф. -иj-) от той же основы дрозг-, что и сербо-хорв. дрожда «осадок, выжимки», др.-прус. dragios «дрожжи», англ. dregs — тж. и т. д.; сочетание zg перед j > ждж и затем жж. Первоначальное значение — «осадок, гуща, выжимки». Происхождение этого слова, по-видимому, связано с тем, что часто новое вино сливалось в бочки или чаны из-под старого, на дне которых оставался осадок, содержащий большое количество дрожжей, именно они и «запускали» процесс брожения.
В 1680 году голландский натуралист Антони ван Левенгук впервые увидел дрожжи в оптический микроскоп, но не распознал в них живые организмы, потому что у них отсутствовало какое-либо движение. Доказать связь спиртового брожения с жизнедеятельностью микроскопических грибов сумел лишь Луи Пастер в 1857 году. Он выяснил, что спиртовое брожение — не просто химическая реакция, как считалось ранее, а биологический процесс, производимый дрожжами. (Материал из Википедии — свободной энциклопедии: Версия 68196611, сохранённая в 10:59 UTC 27 января 2015 // Википедия, свободная энциклопедия. — Электрон. дан. — Сан-Франциско: Фонд Викимедиа, 2015.)
Современные молекулярно-биологические исследования показали, что дрожжи сформировались независимо среди аскомицетовых и базидиомицетовых грибов и представляют собой не единый таксон, а скорее жизненную форму. Среди дрожжей сейчас рассматривают даже одноклеточные стадии грибов, которые образуют макроскопические плодовые тела. В связи с этим границы между дрожжами и мицелиальными грибами становятся очень нечеткими, а их классификация сливается с общей системой грибов.
Аскомицеты – (сумчатые грибы), класс грибов. Для сумчатых грибов характерно наличие особого органа – сумки (аска), в которой происходят три важнейших процесса: слияние ядер, мейоз, образование аскоспор. Мицелий у этих грибов может быть истинным с перегородками (септированный) или псевдомицелием, по сути дела, это почкующиеся клетки, которые после почкования не расходятся, продолжают почковаться, образуя длинные, имитирующие мицелий, цепочки. К аскомицетам относятся такие деликатесы как сморчки, строчки и трюфели, спорыньевые, мучнисторосяные, некоторые плесневые грибы, а также грибы, входящие в состав лишайников. К этому классу относятся также многие дрожжевые грибы, в том числе такие важные для человека, как Saccharomyces. Saccharomyces cerevisiae – это пекарские, пивные и винные дрожжи, поэтому во многих областях, как практических – в биотехнологии, промышленных производствах, так и в чисто научных, понятие «дрожжи» часто ограничивается этим видом.
Базидиомицеты - класс высших грибов. Особенностью представителей этого класса является наличие в цикле развития двух типов мицелия: первичного – гаплоидного и вторичного – дикариотического. Органы размножения – базидии с базидиоспорами – погружены в плодовые тела, образованные мицелием гриба. К этой группе относятся съедобные и ядовитые шляпочные грибы, дереворазрушающие грибы и грибы-фитопатогены – возбудители головни и ржавчины растений.
Все дрожжи – гетеротрофы, т. е. они используют готовые органические вещества в качестве питания, прежде всего, сахара (глюкоза, фруктоза). В связи с этим местообитания дрожжей связаны преимущественно с богатыми сахарами субстратами – поверхностью плодов и листьев, где они питаются прижизненными выделениями растений, нектаром цветов, раневыми соками растений, мёртвой фитомассой и т. д., однако они распространены также в почве и природных водах. Большинство дрожжей относится к копиотрофам – организмам, предпочитающим высокие концентрации питательных веществ. Следовательно, можно предположить, что дрожжи должны наиболее активно развиваться в растительных тканях с высоким содержанием легкодоступных питательных веществ (сочные плоды, крахмалосодержащие семядоли, нектар цветов).
1.2. Эндофитные дрожжи
Как нам всем известно, в ходе эволюции организмы постепенно перебирались из водной среды в наземную. И чтобы избежать негативного влияния внешней среды (солнечная радиация, иссушение), одноклеточные грибы выбрали наиболее простой путь – они развили способность к эндофитному образу жизни.
Обычно «эндофитами» называют все микроорганизмы, обитающие во внутренних тканях растения. Их присутствие бессимптомно и не сопровождается патологическими изменениями, поэтому нельзя назвать такой образ жизни паразитическим. Данное взаимодействие принято называть комменсальным (т. е. один из партнеров системы вступает во взаимодействия с окружающей средой через посредника – хозяина) или мутуалистическим (в этом случае присутствие партнера обязательно для каждого из них).
Открыты они были в 1845 г. М. Шлейденом, который обнаружил многочисленные гифы в корнях орхидных растений, и в 1847 г. Рейссеком, который показал что эти гифы — самостоятельный организм, а не части самого растения (Материал из Википедии — свободной энциклопедии: Версия 62513934, сохранённая в 07:27 UTC 13 апреля 2014 // Википедия, свободная энциклопедия. — Электрон. дан. — Сан-Франциско: Фонд Викимедиа, 2014).
Внутри сочных плодов, корнеплодов или клубней растений почти всегда живут одноклеточные грибы, способные к активному размножению. Дрожжевые клетки наиболее часто располагаются в межклеточном пространстве, в мертвых клетках сосудистых пучков, в клетках с нарушенной оболочкой.
Выяснилось, что дрожжи предпочитают среду, где находится много углеводов и крахмала, другими словами, запасающую ткань растения. С одной стороны дрожжи находятся в изобилии питательных веществ, а с другой –растения не испытывают каких-либо неудобств, поддерживая стабильность обитания микроорганизмов. Более того, дрожжи стимулируют рост и развитие растений, а также защищают их от фитопатогенов и фитофагов.
На поверхности плодов дрожжи обнаруживаются практически всегда (встречаемость по видам растений – 100%, по отдельным плодам - 85%). Встречаемость дрожжей во внутренних частях плодов существенно ниже и варьирует у разных видов растений в пределах от 20% до 90% (по отдельным плодам), в среднем составляя около 70% (Чернов, 2013).
Как уже говорилось ранее, дрожжи проникают внутрь плода через устьица или механические повреждения. Кроме того, многие виды эпифитных дрожжей обладают липолитическими и пектинолитическими ферментами, что может позволить им проникнуть во внутренние ткани с поверхности, в результате локального разрушения кутикулы. В отличие от мицелиальных грибов одноклеточные дрожжи не способны распространяться за счет апикального роста в межклеточном пространстве. Как уже мы упоминали выше, дрожжи относятся к типичным копиотрофам, для роста и размножения которых требуется относительно высокая концентрация легкодоступных сахаров. Учитывая эти особенности можно предположить, что эндофитно дрожжи могут достаточно активно развиваться лишь в тех частях растений, которые характеризуются неплотным сложением и высокой концентрацией простых сахаров. Очевидно, попавшие в плод дрожжевые клетки способны к дальнейшему размножению в межклеточном пространстве и, может быть, даже внутри растительных клеток.
Следует отметить, что виды дрожжей, обилие которых на поверхности плодов несколько больше, чем внутри, относятся к типичным эпифитам и обладают адаптациями к эпифитному образу жизни. Такие дрожжи живут на поверхности растений и получают от них питательные вещества в растворенной форме, не принося при этом каких-либо неудобств самим растениям. Эпифиты являются более адаптированными для жизни в жестких условиях организмами:
1) они формируют полисахаридную капсулу, которая защищает их от высыхания;
2) у них присутствуют каротиноидные пигменты, защищающие от ультрафиолетовых лучей;
3) некоторые эпифитные дрожжи формируют баллистоспоры – споры, расположенные на тонких выростах (стеригмах) и с силой отбрасываемые на значительные расстояния, что облегчает их распространение.
Считается, что возникновение истинного эндофитного образа жизни у некоторых бактерий и мицелиальных грибов связано именно с избеганием негативного влияния факторов, ограничивающих рост эпифитных микроорганизмов. С другой стороны, виды, преобладающие на поверхности нуждаются в кислороде и должны хуже развиваться в микроаэрофильных условиях в тканях плодов.
Другим типом растительных субстратов, в которых постоянно обнаруживаются эндофитные дрожжи, являются подземные запасающие метаморфизированные органы (клубни, корнеплоды, запасающие корневища, корневые шишки и т. п.). На поверхности корней, также как и на поверхности клубней и корнеплодов дрожжи присутствуют практически всегда. При этом состав доминирующих видов эпифитных дрожжей на поверхности подземных органов растений существенно иной, чем на надземных. Во внутренних запасающих тканях метаморфизированных подземных органов дрожжи также присутствуют, хотя их встречаемость здесь значительно ниже, чем внутри сочных плодов, и составляет около 40 %.
Еще одно возможное местоообитание эндофитных дрожжевых грибов – запасающие ткани семян. Обычные кутикулярные покровы не являются серьёзным препятствием для их проникновения внутрь растительного организма. В то же время в плодах с толстыми плотными покровами также могут присутствовать дрожжевые грибы. В частности, в семядолях целых неповрежденных желудей дуба на определенных стадиях их созревания развиваются дрожжи, численность которых довольно высока (Чернов, 2013).
Таким образом, можно выделить три типа эндофитных дрожжевых группировок:
1) в сочных сахаристых плодах они представлены теми же видами, что и на поверхности;
2) в корневых запасающих метаморфозах (корнеплодах, клубнях, запасающих корневищах и т. п.);
3) в крахмалсодержащих семядолях.
Глава 2. Практическая часть.
В качестве объектов исследования нами были отобраны два соплодия ананасов: один – из Эквадора, другой – из Коста-Рики.
Основным методом нашего исследования был метод посева на плотные питательные среды. В качестве питательной среды нами был выбран глюкозо-пептонно-дрожжевой агар (глюкоза – 20 г/л, пептон – 10 г/л, дрожжевой экстракт – 5 г/л, агар – 20 г/л). Для подавления роста бактерий, в стерильную расплавленную среду перед разливом в чашки Петри, был добавлен левомицетин 500 (2 табл./л).
Поверхность стола, руки и всех инструментов обработали 96 % этиловым спиртом. Для предотвращения попадания эпифитных дрожжей внутрь, экзокарпий обоих плодов мы сначала вымыли под проточной водой, а затем так же обработали спиртом. Мы решили исследовать дрожжи двумя способами. В первом варианте опыта мы выделяли сок ананаса с помощью шприца – через экзокарпий, предварительно обработанный спиртом, внутрь соплодия мы вводили иглу шприца и, с ее помощью, вытягивали клеточный сок. Затем, приоткрыв чашку, с помощью шприца каплю сока наносили на поверхность среды и тщательно, но быстро, чтобы не нарушить стерильность и не допустить попадания микроорганизмов из воздуха, растирали по поверхности среды шпателем.
Во втором варианте опыта анализировали мякоть плода, для этого мы с помощью скальпеля, обработанного спиртом, вырезали часть мякоти из внутренней части плода, измельчали, делали навеску, чтобы получить разведение 1:10, помещали навеску в пробирку со стерильной водой и в течение 15 минут обрабатывали на вортексе (MultiReax, Heidolph, Germany) в режиме 1700 об./мин. Затем с помощью стерильной пипетки каплю полученной суспензии нанесли на поверхность среды и, как и в предыдущем случае, тщательно растерли с помощью шпателя. Оба варианта опыта мы сделали в трех повторностях для получения более достоверных результатов. После посева боковую поверхность чашек заклеили парафиновой пленкой, чтобы предотвратить высыхание, и оставили инкубироваться при комнатной температуре.
По прошествии 7 суток, выросшие колонии дрожжей мы разделили на морфологические типы и подсчитали число колоний каждого типа. В образце из эквадорского ананаса количество колоний оказалось столь велико, что подсчитать колонии невооруженным глазом не представлялось возможным, поэтому для учета колоний в этом случае мы воспользовались бинокулярной лупой. С ее помощью мы просчитали количество колоний выросших на чашках в 10 полях зрения и вычислили средние количества колоний всех обнаруженных нами типов. Затем измерили диаметры чашки и поля зрения с помощью обычной линейки, потом определили их площади (по формуле площади круга S=πr2). Затем, зная площади и количество колоний в поле зрения, составили пропорцию, и нашли реальное количество колоний выросших на чашке Петри (по формуле S1/S2=N1/N2 , где S1 – площадь поля зрения, S2 – площадь чашки Петри, N1 – количество колоний в поле зрения, N2– количество колоний в чашке Петри). (Приложение ).
Представителей каждого типа колоний выделяли в чистую культуру и идентифицировали по морфологическим признакам и с помощью анализа нуклеотидных последовательностей ДНК.
Выделение ДНК из дрожжевых клеток производили с помощью разрушения клеток стеклянной дробью в лизирующем буфере при температуре 65ºС. Часть полученного раствора, содержащего ДНК, была использована для проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР). ПЦР – метод молекулярной биологии, позволяющий добиться значительного увеличения малых концентраций необходимых фрагментов ДНК в биологическом материале (пробе). Метод основан на многократном избирательном копировании определённого участка ДНК при помощи фермента полимеразы в искусственных условиях.
Результат проведения ПЦР проверяли с помощью электрофореза в 1% агарозном геле. Электрофорез проводили при 200 В в течение 10 минут, с последующем окрашиванием в течение 6 мин бромистым этидием. Фотографирование результатов проводили в ультрафиолетовом свете на трансиллюминаторе. При обнаружении полоски (фрагмента ДНК) размером около 1000 пар нуклеотидов считали проведенную реакцию ПЦР успешной. Секвенирование ДНК проводили в Научно-производственной компании «Синтол» (Москва). Видовую идентификацию проводили на основании данных генбанка NCBI.
Результаты:
В итоге нами были получены следующие видовые группировки:
1. Коста-Рика – образцы 3, 4, 6, 7 - Wickerhamomyces anomalus (Candida pelliculosa);
2. Коста-Рика – образец 1 - Meyerozyma caribbica (Candida fermentati);
3. Эквадор - образец 2 (красный) - Rhodosporidium diobovatum(Rhodotorula glutinis);
4. Эквадор – образец 2 (белый) - Meyerozyma guilliermondii(Candida guilliermondii);
5. Эквадор - образцы 10, 11 - Candida parapsilosis
В данной таблице представлены более подробные описания полученных видов.
Вид | Патогенные свойства |
Wickerhamomyces anomalus (Candida pelliculosa) | Гриб Candida pelliculosa – редкий возбудитель кандидоза, известны случаи диссеминированных инфекций, в том числе фунгемии, катетер-ассоциированной инфекции, выделяется от больных СПИДом. О патогенных свойствах телеоморфы данных нет |
Meyerozyma caribbica (Candida fermentati) | О патогенных свойствах данных нет |
Rhodosporidium diobovatum (Rhodotorula glutinis) | Rhodotorula glutinis – редкий возбудитель микозов человека со слабыми патогенными свойствами. Описаны случаи фугнемии, сепсиса после использования загрязненного катетера. Обычный сапрофит различных субстратов. О патогенных свойствах телеоморфы данных нет |
Meyerozyma guilliermondii (Candida guilliermondii) | Гриб Candida guilliermondii – возбудитель кандидоза, выделяющийся в последние годы с возрастающей частотой. Возбудитель глубоких и диссеминированных форм кандидоза, включая кандидемию, катетер-ассоциированных инфекций, инфекций кожи и ногтей, возбудитель отомикозов. Гриб выделяется из почвы, воды, из гниющих органических остатков, растений; способен контаминировать продукты брожения, фруктовые соки, молочные продукты, рыбу. О патогенных свойствах телеоморфы данных нет |
Candida parapsilosis | Гриб Candida parapsilosis включают в группу основных возбудителей кандидоза. Возбудитель различных форм кандидоза – все чаще выделяется при сепсисе, ассоциирован с ожогами и эндокардитом, возбудитель онихомикоза. Отмечают значительную частоту инфекций у инъекционных наркоманов. В целом, лидирует среди других болезнетворных грибов Candida как возбудитель инфекций с экзогенным источником. Выделяется с кожи, полости рта и из кишечника человека. Выделяется из экскрементов птиц и человека, морской воды, способен контаминировать засоленное мясо, овощи, рассолы и приправы. |
Выводы:
Полученные результаты свидетельствуют о том, что большинство видовых группировок дрожжей относятся к случаям заражения очень больных людей. Другими словами, люди с изначально очень ослабленным иммунитетом заражаются и заболевают кандидозами или другими болезнями, вызванными дрожжами.
Для здоровых людей эти дрожжи опасности не представляют. Таким образом, можно сделать вывод о том, что они могут являться условно-патогенными (т. е. представляют опасность для людей со сниженным иммунитетом), а употребление их в пищу в большом количестве может представлять опасность для людей склонных к аллергическим реакциям.
Возможно, когда говорят, что у человека аллергия на тот или иной продукт, речь может идти об аллергии на микроорганизмы, которые в этих продуктах содержатся. Поэтому людям, склонным к аллергиям, необходимо с осторожностью употреблять экзотические фрукты и овощи, потому что они могут вызвать аллергические реакции.
Список литературы:
1. Кирица Елена. Направленный синтез каротиноидов у дрожжей и перспектива их использования. Диссертация на соискание ученой степени доктора биологии, Кишинев 2005
2. Википедия(https://ru. wikipedia. org)
3. Чернов в природе. М.: Товарищество научных изданий КМК. 2013. 336 с.
4. . Экология эндофитных дрожжей. Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва 2012.
Приложение
Внешняя характеристика | Мякоть Эквадор 1(1) | |||||
1(1) | 1(2) | 2(1) | 2(2) | 3(1) | 3(2) | |
Белые со слабым блеском | 4 | 6 | 5 | - | 8 | 5 |
Розовые блестящие | 1 | 1 | - | - | - | 1 |
Взяты образцы на посев:
1) Эквадор 9 – розовые блестящие (образец 3(1))
2) Эквадор 10 – белые (образец 3(2))
3) Эквадор 11 – белое образование с пушком (образец 3(1))
4) Эквадор 12 – розовые блестящие (образец 1(1))
Внешняя характеристика | Сок Эквадор | |||
1 | 2 | 3 | 4 | |
Белые | 500 | 1173 | 515 | Образец зарос грибами |
Красные | 12 | 18 | 18 |
Из 3 (сок) образца взяли дрожжи на посев:
1) Эквадор 1 – красные
2) Эквадор 2 – красные и белые (смешанные)
3) Эквадор 3 – белые
4) Эквадор 4 – белые
Посевы, взятые из образца 2 (сок):
1) Эквадор 5 – светло-розовые
2) Эквадор 6 – большое белое скопление
3) Эквадор 7 – блестящие розовые
4) Эквадор 8 – белые
Внешняя характеристика | Мякоть Коста-Рика 1(1) | |||||
1(1) | 1(2) | 2(1) | 2(2) | 3(1) | 3(2) | |
Белые со слабым блеском | 6 | 9 | 4 | 12 | 6 | 2 |
Розовые блестящие | - | - | - | - | - | - |
Взяты образцы на посев:
1) Коста-Рика 3 – белые морщинистые ( образец 2(2))
2) Коста-Рика 4 – бежевые (образец (2))
3) Коста-Рика 5 – белые (образец 2(2))
4) Коста-Рика 6 – бежевые шершавые (образец 3(1))
5) Коста-Рика 7 – бежевое матовое образование (образец 1(2))
6) Коста-Рика 8 – белые (образец 2(1)
Внешняя характеристика | Сок Коста-Рика | |
1 | 2 | |
Белые | 4 | Образец зарос грибами |
Красные | - |
1) Коста-Рика 1 – белые (сок)
2) Коста-Рика 2 – белые (сок)
Приложение .
Словарь
· Диссеминация - распространение возбудителя инфекционной болезни из первичного очага или опухолевых клеток из основного узла опухоли по кровеносным и лимфатическим путям в пораженном органе или организме в целом.
· Кандидо́з — одна из разновидностей грибковой инфекции, вызывается микроскопическими дрожжеподобными грибами рода Candida.
· Кате́тер — медицинский инструмент в виде трубки, предназначенный для соединения естественных каналов, полостей тела, сосудов с внешней средой с целью их опорожнения, введения в них жидкостей, промывания, либо проведения через них хирургических инструментов. Процесс введения катетера называется катетеризацией.
· Кандидемия - кандидозная инфекция.
· Микоз - заболевание человека и животных, вызываемое паразитическими грибками, поражающими кожу и внутренние органы, а также заражающими ядовитыми токсинами продукты и корма.
· Отомикоз - микоз, характеризующийся поражением уха.
· Онихомикоз — грибковое поражение ногтя.
· Сепсис - Общее заражение организма болезнетворными микробами, попавшими в кровь.
· Телеоморфа - половая форма гриба. После прохождения мейоза образуются половые споры.
· Фунгемия — грибковая инфекция, попадающая в кровоток.
· Эндокардит — воспаление внутренней оболочки сердца — эндокарда.
