Занятие 9
Комбинированная токсичность
Структура занятия:
I. Входной тест по теме занятия.
II. Семинар «Типы комбинированной токсичности. Физико-химические и биохимические методы в исследовании индивидуальной и комбинированной токсичности веществ органической и неорганической природы».
III. Лабораторная работа «Индивидуальная и комбинированная токсичность токсикантов разных химических классов с использованием инфузории Spirostomum ambigua».
Целевые задачи:
- научиться различать основные типы комбинированной токсичности химических веществ: суммирование, синергизм, потенцирование, антагонизм;
- на примере гликолевой, трихлоруксусной кислот и фенола рассмотреть их влияние как по отдельности, так и в различных комбинациях на жизнедеятельность инфузории Spirostomum ambigua;
- научиться оценивать токсичность ксенобиотиков по значениям энергии активации гибели клеточной культуры.
Краткое теоретическое введение
Типы комбинированных воздействий
При комбинированном действии токсикантов ответ организма может усиливаться, ослабляться или не изменяться в зависимости от природы ксенобиотиков и мишени их действия.
Аддитивным называют комбинированное действие токсикантов, если по силе оно равно сумме индивидуальных эффектов (2+3=5). Например, при остром ингаляционном отравлении белых крыс смесью фенола с формальдегидом (321:20 мг/кг) величины вероятного ожидаемого суммарного эффекта и полученного комбинированного эффекта равны (75 % погибших животных в группе).
Синергическим называют комбинированное действие токсикантов, в десятки раз превосходящее индивидуальный эффект (2+2=20). Например, CCl4 и C2H5OH являются гепатотоксичными веществами, но при совместном приеме они вызывают более выраженные повреждения печени, чем по отдельности.
Потенцирование эффекта наблюдается в тех случаях, когда вещество не вызывает повреждений органа/ткани, но при совместном приеме с другим ксенобиотиком усиливает эффект токсичного компонента (0+2=10). Например, изопропанол не является гепатоксичным соединением, но при приеме внутрь в комбинации с четыреххлористым углеродом, усиливает его гепатотоксичность.
Антагонизм при комбинированном воздействии возникает в случае взаимодействия двух токсичных веществ между собой или при их конкурирующем влиянии на мишень токсичности (3+5=1). Например, токсичность иона свинца Pb+2 снижается при внутривенном введении антидота – трилона Б (обладающего генотоксичностью) вследствие связывания токсичного иона лигандными атомами антидота.
Функциональным называют такой антагонизм, при котором оба химических вещества компенсируют действие друг друга, оказывая противоположное влияние на орган или систему.
Химический антагонизм, или инактивация, возникает при обычном химическом взаимодействии двух химических веществ. Например, хелатные соединения снижают токсичность металлов за счет образования координационных соединений (хелатов).
Диспозиционный антагонизм происходит при снижении абсорбции токсиканта, изменении механизмов его биотрансформации, распределения или экскреции, способствующих снижению токсичности одного из компонентов комбинированной смеси под влиянием другого. Так, можно снизить всасывание токсиканта с помощью активированного угля, усилить активность ферментов, участвующих в метаболизме, или ускорить экскрецию токсикантов из организма, назначая диуретики.
Рецепторный антагонизм возникает тогда, когда два токсиканта связываются с одним рецептором и их совместный эффект меньше, чем при индивидуальном воздействии или по действию на рецептор они являются антагонистами.
Комбинированное воздействие химических агентов редко дает аддитивный эффект (сумма индивидуальных эффектов), оценка которого принята в санитарно-эпидемиологической практике в России и в некоторых других странах по формальному параметру суммарной ПДК (предельно допустимой концентрации). В действительности гораздо чаще встречается синергический эффект (усиление воздействия по сравнению с теоретическим аддитивным эффектом) или антагонистический эффект (ослабление токсического воздействия по сравнению с теоретическим аддитивным эффектом).
Характеристика Spirostomum ambigua
Spirostomum ambigua (O. F. Müller, 1786) – одна из наиболее широко распространённых спиральноресничных инфузорий (Spirostomidae, Heterotricha, Ciliophora), классический объект исследований в биологии клетки и при биоиндикации. В природных условиях сапротроф-детритофаг часто обнаруживается в сильно загрязнённых и крайне микроанаэробных точках. Имеет лентовидную, несколько дорзовентрально уплощенную форму тела, около 1 мм длиной, соотношение длины тела к его ширине примерно 1:10, макронуклеус четковидный, ротовой аппарат доходит до задней трети тела. Будучи потревоженной, клетка даёт мгновенный ответ, сокращаясь по своей длине в 2-3 раза. Параметры сокращения зависят от температуры. При благоприятных условиях характеризуется высокой подвижностью как в горизонтальном, так и вертикальном направлении. Клетки S. аmbigua в благоприятных условиях (слабоминерализованная среда культивирования или дистиллированная вода, 19-29° С) не гибнут в течение времени, превышающем клеточный цикл (~20 ч). При внесении в среду химических веществ погибают в течение интервала времени, являющегося функцией как концентрации, так и температуры. Время жизни клетки рассчитывается как интервал от момента посадки до гибели клетки. Гибель клетки констатируется либо по разрыву мембраны с выходом содержимого протоплазмы наружу, либо по обездвиживанию с отсутствием сократительной реакции на механическое раздражение. Гибели клетки предшествует формирование промежуточного состояния с изменением морфометрических характеристик и оптических свойств (зернистости цитоплазмы), а также целый комплекс специфических поведенческих реакций. В норме S. аmbigua совершает свободные передвижения в толще раствора с характерным чередованием сжатия/вытягивания клетки. В среде, содержащей компоненты фармацевтических препаратов или иные ксенобиотики, такое передвижение может сопровождаться конвульсивными подергиваниями, фиксацией около стенки ячейки, прецессионными движениями и другими характерными отклонениями от нормального плавания в трехмерной среде.
Энергия активации процесса лиганд-индуцируемой гибели S. аmbigua
Энергия активации Ea является важнейшим критерием клеточных переходов и отражает условия катализа гибели клетки. Она может служить универсальным параметром токсичности при воздействии ксенобиотика. Для определения величины Ea применяют аррениусовские характеристики кинетики гибели (логарифм константы скорости реакции k от обратной температуры 1/T):
k = A · e –Ea/RT
lnk = lnA – (Ea/R) · (1/T),
где k – константа скорости процесса; A – предэкспоненциальный множитель; R – газовая постоянная; T – абсолютная температура по шкале Кельвина.
В полулогарифмических координатах lnk – 1/T по тангенсу угла наклона β прямой к оси абсцисс (tgβ) можно определить энергию активации гибели S. аmbigua при воздействии того или иного ксенобиотика: tgβ = - Ea/R.
Токсичность карбоновых кислот и фенола
Гликолевая кислота (HOCH2COOH, Mr 76,05)
Бесцветные или белые кристаллы без запаха. Легко растворимы в воде (0,1 г/мл), спирте, ацетоне и этилацетате, pH водного раствора 1,7-2,5.
В эксперименте 70%-ный р-р гликолевой кислоты проявляет слабую токсичность при введении внутрь крысам (DL50 – 1938 мг/кг), умеренную токсичность – при ингаляционном введения (время экспозиции – 4 ч, CL50 – 3,6 мг/л для крыс-самцов). Клинические проявления токсического действия гликолевой кислоты включали: шум в легких, затрудненное дыхание, нарушения зрения и обоняния, повреждения глаз и носа, раздражение слизистых оболочек, гиперплазию плоского эпителия, летаргию, алопецию, потерю в весе и др. В сравнительных испытаниях на кроликах-самцах и людях изучалось повреждающее кожу действие 70%-ной гликолевой кислоты. Время экспозиции на людях составило 30 мин, при pH 0,6 отмечали частичный некроз и слущивание эпидермиса, при pH 1,8 – слущивание эпидермиса, а при pH 2,25 и 2,75 – частичную потерю рогового слоя эпидермиса. В опытах на кроликах установлено также повреждающее глаза действие
64%-ной гликолевой кислоты.
Трихлоруксусная кислота (CCl3COOH, Mr 163,39)
Бесцветные, белые или с желтоватым оттенком кристаллы с острым характерным запахом. Гигроскопичны. Растворимы в воде, этаноле и диэтиловом эфире, pH водного раствора 1,2.
Острая токсичность трихлоруксусной кислоты (ТХУ) для людей
При вдыхании ТХУ вызывает повреждения тканей разной степени в зависимости от концентрации и длительности воздействия. Ранние симптомы включают: боль в горле, кашель, раздражение слизистой оболочки носа. При передозировке могут возникнуть одышка, затруднение дыхания, головная боль, головокружение, слабость, отек легких.
При контакте с кожей наблюдаются покраснение, вздутие, боль, раздражение или ожог также в зависимости от концентрации и длительности воздействия ТХУ.
При контакте с глазами появляются покраснение, боль, раздражение, а в случае передозировки возможны нарушения зрения, вплоть до слепоты.
При приеме внутрь концентрированных растворов ТХУ возникают серьезные ожоги губ, ротовой полости и горла. К другим признакам отравления относятся: саливация, рвота с кровью, жжение и боль во рту, горле и животе, диарея. Тяжелые расстройства дыхательной и пищеварительной системы могут привести к смерти.
Фенол (C6H5OH, Mr 94,11)
Бесцветные тонкие длинные игольчатые кристаллы или бесцветная кристаллическая масса с резким запахом. На воздухе постепенно розовеет. Гигроскопичен. Растворим в воде (87 г/л при 25° C), растворах щелочей, спирте, эфире, pH водного раствора 6,0.
Острая токсичность фенола для людей
Токсические дозы: смертельная доза установлена от 1 до 15 г.
После приема внутрь фенола в больших концентрациях возникают сильный ожог ротовой полости и глотки (некроз слизистой оболочки), боль в брюшной области, расстройство пищеварения, включая тошноту, рвоту и диарею. Лицо становится бледным, усиливается потоотделение, зрачки сужаются или расширяются, отмечается цианоз. Пульс обычно слабый и редкий, иногда он может учащаться, частота дыхания сначала увеличивается, затем снижается, температура тела непостоянна. Возбуждение быстро сменяется потерей сознания. Иногда наблюдаются подергивания отдельных мышечных волокон и даже конвульсии.
При вдыхании паров фенола происходит раздражение верхних дыхательных путей и глаз, может появиться хриплое дыхание. К другим симптомам относятся: анорексия, потеря в весе, головная боль, головокружение, саливация.
Местные проявления при контакте с кожей включают эритему, воспаление и некроз. Гипотензия, почечная недостаточность, одышка и острый респираторный дистресс-синдром, развивающиеся вскоре после воздействия фенола, приводят к смерти.
I. Примеры вопросов входного теста
Выберите один или несколько правильных ответов
1. Синергизм наблюдается:
a) если два химических вещества с идентичным механизмом действия при поступлении в организм производят эффект, превышающий сумму эффектов при индивидуальном введении;
b) если ксенобиотик с незначительным токсическим эффектом значительно увеличивает токсичность другого, более активного, ксенобиотика;
c) для ксенобиотиков с одинаковым токсическим эффектом при индивидуальном воздействии и двукратно возрастающим эффектом при комбинированном воздействии;
d) если два наркотических вещества при совместном поступлении в организм производят эффект, идентичный эффекту при индивидуальном воздействии.
2. Биоактивация (летальный синтез) может быть определена как процесс:
a) образования химического соединения, которое легче экскретируется из организма;
b) образования более токсичного химического соединения, взаимодействующего с ДНК;
c) при котором ферменты биотрансформации способствуют образованию более токсичных химических веществ;
d) в котором комбинированное действие химических веществ стимулирует синтез новых белков.
3. При комбинированном воздействии потенцирование наблюдается, если:
a) ксенобиотик, вызывающий недостаточный собственный токсический эффект, увеличивает эффект второго, активного ксенобиотика;
b) два ксенобиотика с одинаковыми эффектами совместно вызывают эффект, равный по величине сумме индивидуальных эффектов;
c) два ксенобиотика с одинаковым токсическим эффектом при совместном воздействии вызывают эффект, превышающий сумму индивидуальных эффектов
d) два лекарства с одинаковым эффектом при совместном использовании производят удвоенный эффект.
4. Аддитивный эффект:
a) равен сумме индивидуальных эффектов;
b) в десятки раз превосходит индивидуальные эффекты;
c) проявляется в усилении эффекта более токсичного компонента;
d) проявляется в конкурентном влиянии на мишень токсичности.
5 - 7. Экстраполяцией кривой доза (концентрация) – время жизни клеточной культуры к С = 0 мМ определить время жизни клетки в отсутствие токсиканта:
5 – токсикант - тяжелая вода D2O
6 – токсикант - этанол
7 – токсикант - сульфацил натрия
5
6
5
7
Примеры задач, включенных в карточки индивидуального задания:
1. Показать расчетным путем, что энергия активации процесса гибели S. аmbigua при комбинированном действия глицина и сульфата цинка составляет 149 кДж/моль. Для этого воспользуйтесь формулами:
k = A ∙ e –Ea/RT
lnk = lnA – (Ea/R)∙ (1/T),
tgβ = -Ea/R.
На графике ордината – скорость гибели (величина, обратная времени жизни – 1/tж), абсцисса - величина, обратная абсолютнй температуре (1/Т).
2. Найти и исправить ошибку на графике В. Рассчитать энергию активации процесса гибели S. аmbigua при инкубации инфузории в 10% растворе диметилсульфоксиде.
III. Лабораторная работа «Индивидуальная и комбинированная токсичность токсикантов разных химических классов с использованием инфузории Spirostomum ambigua»
Постройте линейные зависимости ln(1/tж) – 1000/T и по тангенсу угла наклона прямой к оси абсцисс рассчитайте энергию активации Ea гибели клетки при индивидуальных и комбинированных воздействиях органических кислот.
Сравните полученные значения Ea для каждого конкретного токсиканта и при комбинированном действии (5 значений). Сделайте вывод.
Значения времени жизни S. Ambigua в растворе гликолевой кислоты с концентрацией 4,5 ммоль/л при разной температуре:
Температура (T),° C | Время жизни (tж), с |
20,5 | 2883 |
23 | 643 |
25 | 294 |
27 | 192 |
29 | 89 |
31 | 81 |
Значения времени жизни S. Ambigua в растворе ТХУ с концентрацией 3,5 ммоль/л при разной температуре:
Температура (T),° C | Время жизни (tж), с |
20,5 | 1010 |
23 | 493 |
25 | 208 |
27 | 115 |
29 | 95 |
31 | 67 |
Значения времени жизни S. ambigua в растворе фенола с концентрацией 3,04 ммоль/л при разной температуре:
Температура (T),° C | Время жизни (tж), с |
21 | 145 |
23 | 109 |
25 | 82 |
27 | 66 |
29 | 41 |
31 | 25 |
Значения времени жизни S. ambigua при комбинированном действии гликолевой кислоты (10 ммоль/л) и ТХУ 5 (ммоль/л):
Температура (T),° C | Время жизни (tж), с |
23,5 | 79 |
25,5 | 49 |
28 | 38 |
30 | 31 |
32 | 25 |
Значения времени жизни S. ambigua при комбинированном действии гликолевой кислоты (10 ммоль/л) и фенола (5 ммоль/л):
Температура (T),° C | Время жизни (tж), с |
24,5 | 63 |
27 | 42 |
29,5 | 30 |
31,5 | 25 |
33,5 | 22 |
Сделайте вывод о характере комбинированных воздействий по значениям рассчитанных значений Еа.
Литература
1. Материалы лекций.
2. Токсикологическая химия: учебник для вузов / под ред. . – М.: ГЭОТАР-Медиа, 2005. – С. 145-161.
3. Нагорный действие химических веществ и методы его гигиенического изучения. – М. Медицина. – 1984. – С. 5-171.
