Занятие 11.
Валидационные характеристики методов анализа, применяемых в токсикологической химии. Статистическая обработка результатов количественного анализа биоматериалов и вещественных доказательств.
Структура занятия:
I. Входной тест
II. Лабораторно-практическое занятие «Статистическая обработка результатов количественного анализа биоматериалов и вещественных доказательств».
Целевые задачи:
- изучить показатели валидации аналитических методов;
- закрепить знания по статистической обработке результатов анализа при решении химико-токсикологических и судебно-химических задач.
Краткое теоретическое введение
Аналитические методы, используемые в химико-токсикологических исследованиях должны быть валидированы (метрологически аттестованы). Валидация метода анализа обеспечивает отсутствие систематической ошибки при его последующем использовании.
Валидация (validation), метрологическая аттестация метода анализа, - это лабораторная оценка степени пригодности аналитических методов. Валидацию проводят, используя стандартные образцы, например образцы аналитических наркотических средств и психотропных веществ (Приложение 11.1).
Процесс валидации регламентируют:
- ГОСТ Р ИСО 5725-1-2002. Точность (правильность и прецизионность) результатов измерений. Части 1-6. Изд-во стандартов. 2002 г
- ОСТ 91500.13.0001-2003 «Правила проведения внутрилабораторного контроля качества количественных методов клинических лабораторных исследований с использованием контрольных материалов» (Минздравсоцразвития).
Валидация аналитического метода предполагает его оценку по следующим показателям:
- точность = (правильность – accuracy, trueness) + (прецизионность – precision), прецизионность включает понятия сходимости и воспроизводимости;
- сходимость (повторяемость – repeatability)
- воспроизводимость (reproducibility);
- специфичность – specifity (селективность – selectivity);
- предел обнаружения - limit of detection;
- предел количественного определения - quantitation limit;
- линейность - linearity.
- устойчивость
Приведенные англоязычные названия показателей валидации необходимы для исключения неоднозначности при использовании терминов в отечественной и зарубежной литературе.
Валидация аналитического метода оформляется в виде документа, в котором должны быть представлены:
- обоснование выбора метода с подтверждением его приемлемости для соответствующего вида испытаний, а также доказательства их преимуществ, если метод планируется для замены ранее существовавшего;
- полное описание методики выполнения испытания, обеспечивающее его воспроизводимость специалистом, включая параметры и условия выполнения всех аналитических процедур, тесты на пригодность системы, меры предосторожности, расчетные формулы;
- экспериментальные результаты и рассчитанные параметры валидации.
Правильность аналитического метода характеризует близость результатов испытаний, полученных данным методом, к истинному значению. Показателем правильности метода обычно является значение систематической погрешности. Систематическая погрешность выражается как разность между математическим ожиданием результатов измерений и истинным (или в его отсутствии — принятым опорным) значением.
Прецизионность аналитического метода характеризует степень близости независимых результатов индивидуальных испытаний, полученных в конкретных установленных условиях. Эта характеристика зависит только от случайных факторов и не связана с истинным значением измеряемой величины. Она выражается величиной стандартного отклонения. Экстремальные показатели прецизионности — сходимость (повторяемость) и воспроизводимость.
Сходимость, повторяемость характеризует степень согласованности результатов измерений (испытаний), полученных одним и тем же методом на идентичных объектах испытаний, в одной и той же лаборатории, одним и тем же оператором, с использованием одного и того же оборудования, в пределах короткого промежутка времени. Для оценки сходимости (повторяемости) результатов измерений определяют относительное стандартное отклонение, которое не должно превышать 2%.
Воспроизводимость оценивается при разных условиях
а) каждодневная воспроизводимость - тестирование проводят разные аналитики, в разные дни, на разных сериях стандартных образцов, с разными растворами стандартов, на разном оборудовании;
б) межлабораторная воспроизводимость - тестирование проводится двумя или несколькими лабораториями при одинаковых условиях.
Для оценки воспроизводимости результатов измерений также определяют относительное стандартное отклонение, которое не должно превышать 3%.
Специфичность, селективность аналитического метода определяется его способностью достоверно определять токсикант в присутствии примесных соединений (т. е. отсутствие влияния других веществ на точное определение анализируемого вещества).
Предел обнаружения выражается минимальным содержанием определяемого вещества в образце, которое может быть обнаружено данным методом. Одним из способов определения предела обнаружения является определение концентрации, соответствующей отношению сигнал-шум, равному 1:2 или 1:3.
Предел количественной оценки — это минимальное количество определяемого вещества, которое может быть оценено количественно с приемлемой правильностью и прецизионностью. Это характеристика методов количественного определения малых содержаний веществ в образце (например, примесей или продуктов деградации). Предел количественного определения выражается как концентрация анализируемого вещества в образце (в %, ррm). При этом для шести последовательных измерений относительное стандартное отклонение не должно превышать 20%, а соотношение сигнал шум не должно быть меньше, чем 1:10.
Линейность устанавливается на основании результатов испытаний, которые пропорциональны концентрации анализируемого вещества в образце в пределах аналитической методики. Линейность результатов может быть представлена графически в виде зависимости аналитических сигналов от концентрации вещества (не менее 5). Для подтверждения линейности аналитической методики применяются следующие параметры: коэффициент регрессии, который должен быть не менее 0,995, угол наклона линии регрессии.
Устойчивость. В рабочие параметры сознательно вносят небольшие изменения, например, немного изменяют состав, скорость потока или рН мобильной фазы в методах ВЭЖХ, температуру в газовой хроматографии, длину волны в спектрофотометрических методах, рН среды растворения и т. п. Изучают стабильность раствора образца и стандарта при комнатной температуре и при 50С в течении длительного времени, обычно вплоть до 7 суток.
После того, как лабораторное оборудование прошло валидационные испытания, его можно использовать для определения токсичных веществ в биоматериалах и вещественных доказательствах. Получаемые при анализе результаты должны быть метрологически оценены (статистически обработаны). Их статистическая обработка заключается в расчете ряда метрологических параметров. При оптимальном объеме выборки (n≥5) определяют:
- среднее значение определяемой величины
;
- случайное отклонение i-ой варианты от среднего 
;
- дисперсию V (s2), показывающую рассеяние вариант относительно среднего
;
- стандартное отклонение (или среднее квадратичное отклонение) s
s = 
= 
;
- стандартное отклонение среднего
- относительное стандартное отклонение
Дисперсия V, стандартное отклонение s и стандартное отклонение среднего 
, относительное стандартное отклонение 
характеризуют воспроизводимость анализа. Чем меньше их значения, тем лучше воспроизводимость анализа.
Далее определяют доверительный интервал среднего, т. е. интервал значений определяемой величины, в котором с заданной доверительной вероятностью Р (например, 0,95 или 0,99) находится действительное значение определяемой величины 
. Полуширину доверительного интервала находят по формуле: 
, где t P,f – коэффициент Стьюдента, зависящий от доверительной вероятности Р и числа степеней свободы f = n-1 (Приложение 11.2).
Окончательно результат может быть представлен в виде относительной ошибки среднего результата
I. Примеры вопросов входного теста
1. Дайте определение понятия «Валидация».
а) процедура подтверждения соответствия, посредством которой независимая от изготовителя (продавца, исполнителя) и потребителя (покупателя) организация удостоверяет в письменной форме, что методика анализа соответствует установленным требованиям;
b) процесс лабораторного изучения степери пригодности аналитических методов;
c) определение степени близости независимых результатов индивидуальных испытаний, полученных в конкретных установленных условиях;
d) процесс изучения способности аналитического метода достоверно определять токсичное вещество в биоматериале.
2. Валидации подвергаются аналитические методы, используемые для:
a) идентификации сильнодействующих лекарственных веществ;
b) идентификации тяжелых металлов
c) количественного определения любого ксенобиотика;
d) количественного содержания остаточных органических растворителей в лекарственных средствах.
3. Оценку метода анализа при валидации проводят по следующим характеристикам:
a) точность;
b) правильность;
c) прецизионность;
d) селективность;
e) линейность.
4. Случайные ошибки анализа:
a) характеризуют воспроизводимость анализа;
b) можно оценить методами математической статистики;
c) может быть устранена.
5. Систематическая ошибка:
a) характеризует правильность результатов;
b) это статистически значимая разность между средним 
и действительным а значением содержания определяемого вещества;
c) может быть выявлена при использовании стандартных образцов, метрологически аттестованных методов или методом добавок.
6. Прецизионность включает в себя оценку:
a) точности;
b) повторяемости;
c) сходимости;
d) предела обнаружения;
e) воспроизводимости;
7. Специфичность метода анализа оценивают по:
a) линейности;
b) пределу обнаружения;
c) пределу количественного определения;
d) воспроизводимости.
8. Надежность аналитического метода определяется:
a) степенью воспроизводимости;
b) правильностью;
c) степенью сходимости;
d) линейностью метода.
9. По формуле s = рассчитывают:
a) правильность;
b) случайную погрешность;
c) систематическую погрешность;
d) точность.
10. Укажите соответствия:
Критерий оценки качества выполняемых лабораторных исследований | Сущность критерия |
| повторяемость; воспроизводимость; правильность; точность; предел обнаружения. | a) степень близости результата истинному значению; b) минимальное содержание искомого компонента; c) степень близости друг к другу независимых результатов единичного анализа, полученных по одной и той же методике, на одних и тех же пробах, в одинаковых условиях и практически одновременно; d) степень близости друг к другу независимых результатов анализа, полученных по одной и той же методике, на одних и тех же пробах, в различных условиях; e) степень близости среднего значения из серии результатов единичного анализа к истинному значению. |
II. Лабораторно-практическое занятие «Статистическая обработка результатов количественного анализа биоматериалов и вещественных доказательств».
Подготовить ответ по индивидуальной карточке заданий для участия в семинаре.
Образцы задач, входящих в карточки индивидуального задания:
1) Описан случай [Am. J. Forensic Med. Pathol. 17(4).- 343-346.-1996] смерти 31-летней женщины после нанесения ей незначительных телесных повреждений. Хроматографическим методом в крови погибшей были обнаружены ацетальдеид, этанол и метронидазол. В акте судебно-химического заключения было указано, что смерть наступила из-за сердечной недостаточности в связи с передозировкой метронидазола в комбинации с этанолом. Рассчитайте дисперсию V% по экспериментальным данным, полученным при определении метронидазола в крови:
№ | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 |
X, мкг/л | 420 | 450 | 425 | 430 | 438 | 421 | 440 |
2. Рассчитайте относительное стандартное отклонение результатов определения ртути в суточной моче рабочего, полученных методом атомно-абсорбционной спектрометрии с холодным паром при судебно-химическом исследовании после воздействия паров ртути в условиях производства (в норме содержание ртути в моче не должно превышать 20 мкг/л):
№ | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
Х, мкг/л | 93,6 | 95,3 | 92,4 | 90,9 | 94,2 |
3. Рассчитайте относительную ошибку среднего результата при судебно-химическом исследовании цельной крови человека, который при попытке суицида ввел внутримышечно 40 мл металлической ртути (в норме содержание ртути в крови <8 мкг/л). Результаты получены методом атомно-абсорбционной спектрометрии с холодным паром после предварительной кислотной минерализации пробы крови в тефлоновых «бомбах» в микроволновой печи:
№ | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
Х, мкг/л | 61,4 | 59,3 | 62,1 | 58,6 | 59,8 |
4. Через 18 суток после попытки суицида в моче человека был обнаружен таллий (метод атомной абсорбции с графитовой кюветой; предварительная минерализация в открытой системе кислотами-окислителями; норма таллия в моче 0,05-1,69 мкг/л):
Рассчитайте полуширину доверительного интервала среднего результата при доверительной вероятности Р=0,95.
№ | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
Х, мкг/л | 204,4 | 205,3 | 204,8 | 204,7 | 205,1 |
По каждой задаче сделайте вывод о воспроизводимости полученных результатов.
Литература
1. Материалы лекций.
2. Токсикологическая химия: Учебник для вузов / Под ред. . – М.: ГЭОТАР-Медиа, 2005. – С. 182-186
3. , Григорьева и задачи по аналитической химии.-М: ГЭОТАР-Медиа,2007.-С. 8-46
4. , , Харитонов аналитических методов // Фармация, 4. – 2006.- С. 8-12.
