Биобезопасность пищевых продуктов и кормов

(Логотип)

BIOO SCIENTIFIC

MAXIMIZE SCIENCE FOR LIFE®

Биобезопасность пищевых продуктов и кормов

Инструкция по применению

Набора реагентов Max Signal ®

для определения охратоксина

Каталожный номер 1036-02

© «BIOO Scientific Corp.» • 2008 г.

СОДЕРЖАНИЕ

Общая информация. 3

Описание набора. 3

Принцип метода. 3

Состав набора, хранение и срок годности. 4

Чувствительность (предел обнаружения). 4

Специфичность (перекрестная реактивность). 4

Требуемые материалы, не поставляемые в наборе. 5

Предупреждения и предосторожности. 5

Приготовление пробы.. 6

Сухое мясо/ рыба, зерно, корм, молоко

Приготовление реагентов. 7

Проведение иммуноферментного анализа. 7

Расчет содержания охратоксина8

Возможные проблемы и их устранение. 9

Отсутствует окрашивание или стандарты не определяются. 9

Низкие показатели оптической плотности (ОП). 9

Высокие фоновые показатели или высокие показатели оптической плотности (ОП). 9

Высокая вариабельность показателей в одном планшете. 10

Высокая вариабельность показателей в разных планшетах. 10

Одна или несколько точек на кривой стандарта выходят за допустимые пределы.. 10

Набор реагентов MaxSignal® для определения охратоксина А методом ИФА предназначен для лабораторного использования, если в инструкции не указано иное. Данный продукт НЕ предназначен для клинической диагностики. MaxSignal является зарегистрированной торговой маркой корпорации «BIOO Scientific Corporation» («BIOO»).

Общая информация

Описание набора

Набор реагентов MaxSignal® предназначен для количественного определения охратоксина А в злаках, сушеном мясе/рыбе, корме, молоке и семенах. В основе исследования лежит конкурентный иммуноферментный анализ.

Набор реагентов MaxSignal® для определения охратоксина методом ИФА позволяет международным и правительственным регулирующим ведомствам, производителям и переработчикам пищевых продуктов, а также организациям, осуществляющим контроль качества, обнаруживать охратоксин А в различных пробах и удовлетворять озабоченность потребителей в отношении безопасности пищевых продуктов. Уникальными характеристиками данного набора являются:

·  Эффективное выделение (>80%), быстрые (10-20 минут) и экономичные методы экстракции.

·  Высокая чувствительность (0,015 нг/г или ppb).

·  Быстрый анализ методом ИФА (менее 1 часа независимо от количества проб).

·  Высокая воспроизводимость.

Принцип метода

Метод основан на конкурентном колориметрическом иммуноферментном анализе. Лунки планшета покрыты токсином. Во время анализа в лунки планшета помимо пробы добавляют первичные антитела, специфичные к исследуемому токсину, и конъюгат. Если в пробе присутствует исследуемый токсин, он конкурирует за связывание с антителами, препятствуя, таким образом, их связыванию с токсином, прикрепленным к лункам планшета. Антитела коньюгата связываются с токсином, прикрепленным к лункам планшета. Интенсивность окрашивания после добавления субстрата находится в обратной зависимости от концентрации в пробе остаточного количества охратоксина А.

Состав набора, хранение и срок годности

Набор реагентов MaxSignal® для определения охратоксина А методом ИФА рассчитан на проведение 96 исследований либо анализ 42 проб в повторах (12 лунок оставляют для стандартов). Все неиспользованные микролунки можно положить назад в фольгированный пакет и запечатать его с влагопоглотителем, прилагаемым в оригинальной упаковке. Хранить набор при температуре 2 - 8°С*. Срок годности при правильном хранении составляет 12 месяцев.

Состав набора	Количество	Хранение
Планшет, покрытый охратоксином А	1 х планшет на 96 лунок (12 стрипов по 8 лунок)	2 – 8°С
Стандарты охратоксина А: Отрицательный контроль (пробирка с белой крышкой) 0,015 нг/мл (пробирка с желтой крышкой) 0,03 нг/мл (пробирка с оранжевой крышкой) 0,06 нг/мл (пробирка с розовой крышкой) 0,12 нг/мл (пробирка с пурпурной крышкой) 0,24 нг/мл (пробирка с синей крышкой) 10 нг/мл пиковый стандарт(пробирка с красной крышкой)	0.8 мл 0.8 мл 0.8 мл 0.8 мл 0.8 мл 0.8 мл 0.8 мл	2 – 8°С
Антитела к охратоксину А #1	12 мл	2 – 8°С*
100X конъюгат антител с пероксидазой #2	250 мкл	2 – 8°С*
Разбавитель коньюгата антител #2 **	20 мл	2 – 8°С
20Х промывочный раствор **	28 мл	2 – 8°С
Стоп-реагент**	20 мл	2 – 8°С
Субстрат (ТМБ)**	12 мл	2 – 8°С

* Если Вы не собираетесь использовать набор более 1 месяца, храните Стандарты охратоксина А, Антитела к охратоксину А #1 и 100X конъюгат антител #2 при температуре -20°С или в морозильной камере.

** Компоненты набора с одинаковыми номерами взаимозаменяемы, их можно использовать с другими наборами «BIOO», если их срок годности не истек.

Чувствительность (предел обнаружения)

Вид пробы	Предел обнаружения (нг/г или ppb)
Сухое мясо/рыба, зерно, корм, семена	0,15
Молоко	0,15

Специфичность (перекрестная реактивность)

Анализируемое вещество	Перекрестная реактивность (%)
Охратоксин А Охратоксин В Охратоксин С Охратоксин а	100 9,3 46 <0.2

Требуемые материалы, не поставляемые в наборе

·  Микропланшетный ридер (450 нм)

·  Инкубатор

·  Гомогенизатор тканей (например, гомогенизатор Omni Tissue Master)

·  Вортекс (например, Gneie Vortex от компании «VWR»)

·  Дозаторы на 10, 20, 100 и 1000 мкл

·  Многоканальный дозатор: 50 – 300 мкл (необязательно)

·  Метанол

Предупреждения и предосторожности

Компания «BIOO» настоятельно рекомендует ознакомиться со следующими предупреждениями и предосторожностями, чтобы получить полное представление о методах ИФА и иных аспектах, на которые следует обращать пристальное внимание при выполнении анализа. Более подробная информация представлена также в разделе «Возможные проблемы и их устранение». И набор, и инструкция к нему подвергаются регулярной оптимизации и пересмотру. Поэтому важно придерживаться протокола, прилагаемого к набору. Если вам потребуется дополнительная информация, можно обратиться к местному дистрибьютору или в компанию «BIOO» *****@***com.

·  Стандарты содержат токсин Т-2. Обращайтесь с ними осторожно.

·  Не используйте наборы с истекшим сроком годности.

·  Не смешивайте реагенты из разных наборов или партий, за исключением компонентов из партий с одинаковыми номерами с неистекшим сроком годности. Антитела и планшеты предназначены для конкретного набора и конкретной партии. Убедитесь, что коньюгат антител #2 разведен и смешан в правильном объеме.

·  Старайтесь поддерживать в лаборатории температуру на уровне 20 – 25°С. Не проводите анализ под воздушными вентиляторами или вблизи таковых, поскольку это может вызвать излишнее охлаждение, нагревание и/или испарение. Также не проводите анализ под прямыми солнечными лучами, так как это может вызвать излишнее нагревание и испарение реагентов. От холодной поверхности рабочего стола может защитить сложенное несколько раз бумажное полотенце или иной изоляционный материал, положенный на время инкубации под планшеты с пробами.

·  Убедитесь, что Вы используете только дистиллированную или деионизированную воду, поскольку качество воды играет крайне важную роль.

·  При раскапывании проб или реагентов в пустой микротитровальный планшет старайтесь поместить наконечник дозатора в нижний угол лунки таким образом, чтобы он дотрагивался до пластмассы.

·  Следует максимально точно придерживаться времени инкубации планшетов для анализа. Будьте внимательны при внесении в планшет стандартов. Сначала следует внести стандарты, а затем добавить пробы.

·  Добавляйте в планшет стандарты, начиная со стандарта наименьшей концентрации и заканчивая стандартом наивысшей концентрации, так как это сведет к минимуму риск искажения стандартной кривой.

·  Помещайте планшеты в холодильник всегда в запечатанных пакетах с добавлением влагопоглотителя для поддержания стабильности. Не допускайте образования на планшетах, находящихся в упаковке, конденсата, при выдерживании их при комнатной температуре (20 – 25°С).

Компания «BIOO» не дает никаких других гарантий – ни явных, ни скрытых – кроме гарантии того, что материалы, из которых изготовлены продукты, имеют качество, соответствующее стандартам. Нет гарантий в отношении продаваемости данного продукта или пригодности данного продукта для каких-либо целей. Компания «BIOO» не несет ответственности за повреждения, включая намеренные или вытекающие повреждения, а также за затраты, связанные прямо или косвенно с использованием данного продукта.

Приготовление пробы

Убедитесь, что пробы хранились надлежащим образом. Как правило, пробы следует хранить в холодильнике при температуре 2 – 4°С не более 1 – 2 дней. Если пробы нужно сохранить в течение большего времени, их следует заморозить при температуре не выше -20°С. Замороженные пробы перед использованием можно размораживать при комнатной температуре (20 – 25°С) или в холодильнике.

Сушеное мясо/Рыба, Зерно, Корм, Семена

1.  Гомогенизируйте умеренное количество пробы в подходящем для этих целей миксере.

2.  Взвесьте 5 г гомогенизированной пробы и поместите в соответствующий контейнер.

3.  Добавьте 25 мл 70%-го метанола* и перемешивайте 20 минут на шейкере.

4.  Центрифугируйте образец 10 минут при 4,000 rpm.

5.  Разведите 1 мл супернатанта в 1 мл дистиллированной или деионизированной воды.

6.  Используйте 50 мкл полученного разведенного супернатанта на лунку для теста.

Примечание: Фактор разведения: 10. По необходимости, размер пробы может быть увеличен, но объем метанола/воды должен быть изменен соответственно. К примеру, если использовать 10 г пробы, то нужно взять 50 мл 70%-го метанола. Если концентрация охратоксина А ожидается высокой, проба может быть разбавлена. Пожалуйста запомните, что пробы, вносимые пипеткой в лунки микропланшета, должны быть в 35%-ном метаноле (35% метанола, 65% воды).

Молоко

1.  Для обезжиренного молока, разведите пробу молока в 35% метаноле (1:9) (к примеру, 20 мкл молока + 180 мкл 35%-го метанола). Вносите по 50 мкл разведенной пробы на лунку микропланшета.

2.  Для простого молока с жиром, центрифугируйте пробу молока на 4,000 rpm 5 минут, слейте верхний слой, содержащий жир. Разведите пробу молока в 35% метаноле (1:9) (к примеру, 20 мкл молока + 180 мкл 35%-го метанола). Вносите по 50 мкл разведенной пробы на лунку микропланшета.

Примечание: Фактор разведения: 10.

Протоколы для приготовления проб, не описанных в данной инструкции, можно получить по запросу. Пожалуйста, свяжитесь со своим местным дистрибьютором или напишите нам по электронной почте: [e-mail]

Протокол определения охратоксина А методом ИФА

Приготовление реагентов

ВАЖНО: Перед использованием все реагенты необходимо выдержать при комнатной температуре (20 – 25°С) в течение 1 – 2 часов. Обязательно прочитайте раздел «Предупреждения и предосторожности». Растворы следует готовить непосредственно перед проведением иммуноферментного анализа. F Перед использованием все реагенты следует перемешать, аккуратно переворачивая или вращая. Готовьте реагенты только в тех объемах, которые нужны для соответствующего количества лунок. Не выливайте реагенты обратно в оригинальные пробирки/флаконы. Применение одноразовых емкостей при работе с реагентами снижает риск контаминации.

1.  Приготовление 1Х раствора коньюгата антител #2.

Смешайте 1 объем 100Х коньюгата антител #2 с 99 объемами растворителя для антител #2.

2.  Приготовление промывочного раствора 1Х

Смешайте 1 объем 20Х промывочного раствора с 19 объемами дистиллированной воды.

Проведение иммуноферментного анализа

Пометьте отдельные стрипы, которые будете использовать, и рассчитайте аликвоты реагентов следующим образом:

Компонент	Объем для 1 реакции	24 реакции
Антитела к охратоксину А #1	100 мкл	2,4 мл
1Х Коньюгат антител #2	150 мл	3,6 мл
1Х промывочный раствор	1,0 мл	24 мл
Стоп-реагент	100 мкл	2.4 мл
Субстрат (ТМБ)	100 мкл	2.4 мл

Примечание: Исходным раствор 150 ppb и рабочие стандарты должны приготавливаться непосредственно перед постановкой ИФА. После использования рабочих стандартов, пустые пробирки храните при температуре 4°С. Допускается их повторное использование при следующем приготовлении стандартов.

1.  Внесите по 50 мкл каждого стандарта охратоксинаА в разные лунки в двух повторах (Добавляйте стандарты в планшет только в порядке возрастания концентрации).

2.  Внесите по 50 мкл каждой пробы в разные лунки в двух повторах.

3.  Внесите по 100 мкл Антител к охратоксину А #1 и тщательно перемешайте, осторожно покачивая планшет в руке в течение 1 минуты.

4.  Инкубируйте планшет в течение 30 минут при комнатной температуре (20 – 25°С) в защищенном от света месте.

5.  Промойте планшет трижды 250 мкл 1Х промывочного раствора. После последнего промывания удалите влагу из лунок, аккуратно постукивая перевернутым планшетом по бумажному полотенцу (F Выполните следующий этап сразу после промывания планшета. Не допускайте высыхания планшета на воздухе в перерывах между этапами работы).

6.  Добавьте 150 мкл 1Х Коньюгата антител #2. Инкубируйте планшет в течение 30 мин при температуре 20-25 гр. C. Избегайте охлаждения и попадания прямых солнечных лучей, придерживайтесь рекомендаций.

7.  Промойте планшет трижды 250 мкл 1Х промывочного раствора. После последнего промывания удалите влагу из лунок, аккуратно постукивая перевернутым планшетом по бумажному полотенцу (F Выполните следующий этап сразу после промывания планшета. Не допускайте высыхания планшета на воздухе в перерывах между этапами работы).

8.  Внесите по 100 мкл субстрата TMБ в каждую лунку. Установите время реакции сразу после добавления субстрата. Перемешайте раствор, осторожно покачивая планшет в руке в течение 1 минуты. ( F Не помещайте остатки субстрата в оригинальный контейнер, во избежание возможного загрязнения. На время инкубации лунки микротитровального планшета рекомендуется заклеивать).

9.  После инкубации в течении 15 минут при комнатной температуре, внесите 100 мкл стоп-реагента для остановки ферментативной реакции.

10.  Измерьте оптическую плотность сразу после добавления стоп-реагента, используя ридер с длиной волны 450 нм. (F Перед снятием показаний протрите дно планшета, чтобы на точность измерений не повлияла влага или отпечатки пальцев).

Расчет содержания охратоксина А

Стандартную кривую можно построить, отметив величины относительной оптической плотности (ОП) (%), полученные для каждого референтного стандарта относительно величин его концентрации в нг/мл на логарифмической кривой.

Относительная оптическая плотность (%) =	Оптическая плотность стандарта (или пробы) х 100
Оптическая плотность нулевого стандарта

Используйте средние величины относительной оптической плотности по каждой пробе для определения соответствующей концентрации исследуемого токсина в нг/мл на стандартной кривой. Для оценки результатов анализа методом ИФА можно получить по запросу специальную программу в формате Excel – MaxSignal® ELISA Detection Analysis Program in Excel. Для получения дополнительной информации обратитесь к местному дистрибьютору или по электронной почте: *****@***com.

На следующем рисунке представлена типовая стандартная кривая охратоксина А. Предел обнаружения и предел количественного определения для данного набора рассчитывают, как показано далее.

Предел обнаружения = (0,015 нг/г или ppb) х (фактор разведения)

Предел количественного определения = (0,03 нг/г или ppb) х (фактор разведения)

Относительная ОП (%)	точный калибровочный график см. Инструкцию от производителя
	Стандарт, нг/мл

Возможные проблемы и их устранение

Отсутствует окрашивание или стандарты не определяются

Возможные причины	Рекомендуемые действия
Реагенты были использованы в неправильном порядке или какой-то этап был пропущен.	Повторите анализ, тщательно соблюдая требования протокола.
Были использованы неподходящие антитела или коньюгат антител #2 приготовлен не правильно.	Убедитесь, что используете именно те антитела, которые входили в состав набора. Все пероксидазные конъюгаты являются специфичными для данного набора и партии.
Субстрат TMБ испортился.	Используйте субстрат TMБ из нового набора «BIOO».

Низкие показатели оптической плотности (ОП)

Возможные причины	Рекомендуемые действия
У реагентов истек срок годности или были смешаны реагенты из разных партий.	Проверьте сроки годности и номера партии.
Промывочный раствор был приготовлен неправильно.	Используйте промывочный раствор, предназначенный для данного набора, и убедитесь, что он был приготовлен правильно.
Было проведено слишком много промывочных циклов.	Убедитесь, что количество промываний соответствует инструкции, предусмотренной протоколом.
Длительность инкубации была недостаточной.	Убедитесь в точности определения длительности инкубации для каждого планшета в отдельности, следуйте требованиям протокола.
Температура в лаборатории была слишком низкая.	Поддерживайте в лаборатории комнатную температуру (20 – 25°С). Не выполняйте анализы под воздушными вентиляторами или вблизи холодных окон.
Реагенты и планшеты были слишком холодными.	Убедитесь, что планшеты и реагенты имеют комнатную температуру. Достаньте компоненты набора из упаковки не менее чем за 1 час до начала проведения анализа.
У считывающего устройства была установлена неправильная длина волны, или ридер работал неправильно.	Убедитесь, что длина волны составляет 450 нм, и снимите показания еще раз. Проверьте калибровку считывающего устройства и настройку лампы.
Набор подвергся излишнему воздействию.	Проверьте записи о том, сколько раз набор доставали из холодильника. Проверьте, не оставался ли набор при экстремальной температуре слишком долго.
Планшеты подверглись воздействию.	Всегда помещайте планшеты в холодильник в запечатанных пакетах с влагопоглотителем для поддержания стабильности. Не допускайте образования на планшетах, находящихся в упаковке, конденсата, при выдерживании их при комнатной температуре (20 – 25°С).

Высокие фоновые показатели или высокие показатели оптической плотности (ОП)

Возможные причины	Рекомендуемые действия
В промывочном растворе использована вода плохого качества.	Если качество воды вызывает сомнения, постарайтесь при приготовлении промывочного раствора использовать дистиллированную воду из другого источника.
Раствор субстрата испортился.	Убедитесь, что субстрат бесцветный, перед добавлением его в планшет.
Было проведено недостаточное количество промывочных циклов или промывка была выполнена плохо.	Количество промываний должно соответствовать инструкции, предусмотренной протоколом. Убедитесь, что в каждую лунку планшета попадает не менее 250 мкл промывочного раствора. Проверьте работу промывочной системы; отремонтируйте систему, если отмечаются протекания, плохое разбрызгивание или всасывание.
Считывающее устройство работало плохо или не было откалибровано. Вероятность этого велика, если показатели ОП высокие, а окраска бледная.	Проверьте работу считывающего устройства, используя калибровочный планшет, проверьте настройку лампы. Проверьте процедуру выведения спектрофотометра на нулевой уровень, а при необходимости – повторите ее.
Температура в лаборатории была слишком высокая.	Поддерживайте в лаборатории комнатную температуру (20 – 25°С). Не выполняйте анализы вблизи нагревательных приборов или под прямыми солнечными лучами.
Реагенты были перемешаны, загрязнены или неправильно приготовлены.	Убедитесь, что были использованы соответствующие реагенты, рабочие растворы приготовлены правильно, не произошло загрязнения.

Высокая вариабельность показателей в одном планшете

Возможные причины	Рекомендуемые действия
Стандарты, реагенты или пробы были добавлены в планшет для анализа в неправильные сроки.	Убедитесь, что все материалы подготовлены, и их можно использовать. Используйте многоканальный дозатор для одновременного внесения реагентов в лунки, где это возможно. Не делайте перерывов во время внесения стандартов, реагентов и проб.
Многоканальный дозатор работал плохо.	Проверьте калибровку дозатора и убедитесь, что наконечники держатся крепко. Убедитесь, что все каналы дозатора набирают и высвобождают одинаковые объемы жидкости.
Была проведена недостаточная промывка или промывочная система работала плохо.	Проверьте работу промывочной системы. Отремонтируйте систему, если отмечаются протекания, плохое разбрызгивание или всасывание.

Высокая вариабельность показателей в разных планшетах

Возможные причины	Рекомендуемые действия
В разных планшетах затрачено разное время на инкубацию.	Устанавливайте длительность инкубации для каждого планшета в отдельности.
В разных планшетах по-разному выполнено промывание.	Убедитесь, что количество промываний соответствует инструкции, предусмотренной протоколом. Проверьте работу промывочной системы, отремонтируйте систему, если отмечаются протекания или плохое разбрызгивание/всасывание.
Дозатор работал неправильно.	Проверьте калибровку дозатора. Перед использованием дозатора убедитесь, что наконечники держатся крепко, и что все каналы дозатора набирают и высвобождают одинаковые объемы жидкости.
Планшеты, реагенты, стандарты и пробы хранились при разных температурах.	Убедитесь, что планшеты, реагенты, стандарты и пробы достигли комнатной температуры (20 – 25°С). Большим объемам понадобится больше времени для достижения комнатной температуры. Если для ускорения процесса используется водяная баня, убедитесь, что в ней поддерживается комнатная температура; не используйте для подогрева реагентов, проб и стандартов набора теплую воду.
Использованные реагенты были взяты из наборов из разных партий или наборы были с разными сроками годности.	Аккуратно обозначьте все реагенты, чтобы их не перепутать. Диапазон значений оптической плотности реагентов из наборов, имеющих разный срок годности, может отличаться. Тем не менее, значения относительной оптической плотности можно сопоставить. Как правило, значение нулевого стандарта меньше 0,6 может указывать на некоторое ухудшение качества реагентов.

Одна или несколько точек на кривой стандарта выходят за допустимые пределы

Возможные причины	Рекомендуемые действия
Стандарты добавляли в неправильном порядке или регистрацию осуществляли в неправильных позициях.	Выполните анализ еще раз, соблюдая требования протокола. Убедитесь, что стандарты применялись правильно и результаты были зарегистрированы корректно.
Стандарты были загрязнены или смешаны с другими стандартами.	Используйте стандарты из нового набора. Вносите стандарты в планшет только в порядке повышения концентрации.
Была проведена недостаточная промывка или промывочная система работала плохо.	Выполните промывание правильно. Проверьте работу промывочной системы. Отремонтируйте систему, если отмечаются протекания или плохое разбрызгивание/всасывание.
Стандарты и реагенты были добавлены в планшет в неправильные сроки.	Убедитесь, что все материалы подготовлены и их можно использовать. Вносите в планшет стандарты непрерывно и только в порядке повышения концентрации. Используйте многоканальный дозатор для одновременного заполнения нескольких лунок.
Дозатор работал неправильно.	Проверьте калибровку дозатора и убедитесь, что наконечники держатся крепко. Убедитесь, что все каналы дозатора набирают и высвобождают одинаковые объемы жидкости.
(Логотип)	«Bioo Scientific Corporation» 3913 Тодд Лэйн, комн. 312 Остин, TX 78744 США Тел.: [phone] Факс: [phone]	Сделано в США «BIOO Food & Feed Safety Products» *****@***com *****@***com www.