Разработка мишеней для терапии колоректального рака на основе функциональной геномики (стр. 2 )

По результатам работы подана заявка на патент № 000 от 01.01.2001 «Способ индукции апоптоза клеток злокачественной опухоли колоректального рака и средство для его осуществления».

Работа апробирована и рекомендована к защите на заседании научного семинара ФГБУ «МГНЦ» РАМН 19 июня 2013 года.

Личное участие диссертанта

Автором проанализирована отечественная и зарубежная литература по теме диссертации. Все использованные в работе данные получены при непосредственном участии автора: на этапах постановки цели и задач, разработки методов их выполнения, проведении исследований, обработки, анализа и обобщения полученных результатов, написания и оформления рукописи. Результаты исследования опубликованы в научных журналах и доложены на конференциях.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 14 научных работ, из них 4 – в журналах, рекомендуемых ВАК МОН РФ для опубликования основных научных результатов диссертации на соискание учёной степени кандидата наук.

Структура и объём работы

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания использованных в работе материалов и методов, результатов исследований и обсуждения полученных результатов, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Диссертация изложена на 134 страницах машинописного текста, содержит 32 рисунка и 5 таблиц. Список цитируемой литературы включает 133 источника, из них 8 отечественных и 125 иностранных источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе использовали культивируемые in vitro клетки колоректального полипозного рака человека НТ-29 (АРС-/-), с мутацией в гене АРС, и Сасо-2 (АРС+/+), без мутации в гене АРС. Последовательность РНК олигонуклеотидов подбирались с помощью специализированной программы BLOCK-iT™ RNAi Designer (Invitrogen, Life Technologies, USA). Для каждого гена мишени подбиралось несколько вариантов миРНК, из которых выбирались наиболее эффективные. Эффективность в данном случае определялась наибольшим подавлением экспрессии гена при наименьшей концентрации миРНК. В дальнейшую работу отобраны олигонуклеотиды, проявляющие максимальную ингибирующую активность.

Трансфекцию клеток синтетическими олигонуклеотидами (миРНК) проводили липосомным методом согласно протоколу производителя с использованием реагентов Lipofectamine RNAiMAX (“Invitrogen”, США). Трансфекция сделана прямым методом, т. е. смесь для трансфекции вносили непосредственно в среду культивирования. За 2 дня до эксперимента (трансфекции) клетки высевали на 12-ти луночные плашки, в концентрации 7,5*104 клеток в 1 мл среды. Перед трансфекцией питательную среду с 10% сывороткой заменяли на ту же среду с 1% сывороткой, согласно протоколу.

Анализ апоптотических клеток проводили через 24 и 48 часов после трансфекции с помощью инвертированного микроскопа AxioObserver D1 (“Carl Zeiss”), оснащенного цветной цифровой камерой Icc1. Анализ фотографий проводили с помощью пакета прикладных программ AxioVision 3.1 (“Carl Zeiss”).

Число апоптотических клеток подсчитывали после прижизненного окрашивания с помощью набора для определения апоптоза Vybrant Apoptosis Assay Kit #5 (Invitrogen, USA), включающего флуоресцентные красители (Hoechst 33342 и пропидиум йодид (PI).

В ходе работы проведен анализ изменения уровня экспрессии мРНК набора генов в клетках НТ-29 и Сасо-2. Измерения уровня экспрессии клеток, обработанных оксалиплатином и/или миРНК, проводили относительно ничем не обработанных клеток. В процессе анализа выполнены следующие процедуры: выделение суммарной (тотальной) РНК из клеточных культур (РНК RNeasy Mini Kit (QIAGEN, США)); определение концентрации водного раствора суммарной РНК (Nanodrop 1000); проведение реакции обратной транскрипции (ImProm-II™ Reverse Transcriptase (Promega)); ПЦР в реальном времени (RT-PCR) с продуктами обратной транскрипции (Real time StepOnePlus (Applied Вiosystems)), оценка качества проведенной RT-ПЦР. Оценку чистоты реакции проводили по кривой плавления амплифицированных фрагментов ДНК, соответствующих каждому гену. Все эксперименты повторены несколько раз и оценивались только после получения одинаковых повторяющихся результатов в разных экспериментах. Для проверки зоны линейности сделаны серийные разведения кДНК. По результатам ПЦР в реальном времени построены калибровочные кривые для каждого гена.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1.  АНАЛИЗ ИНГИБИРОВАНИЯ ГЕНА C-MYC

Для исследований отобраны две культуры клеток полипозного рака кишечника - НТ-29 (с мутацией в гене АРС) и Сасо2 (без мутации в гене АРС). Культура Сасо2 выбрана как контрольная, т. к. вследствие отсутствия в ней мутации в гене АРС ген с-MYC не должен находиться в состоянии повышенной экспрессии.

Определена функциональная активность (экспрессия) гена с-MYC в обоих из указанных типах культивируемых клеток колоректального рака. Найдено, что экспрессия гена с-MYC в культуре НТ-29 более, чем в 5 раз превышает экспрессию этого гена в культуре Сасо2 (Рис. 1).

Рис. 1 Сравнение экспрессии гена с-MYC в культурах клеток полипозного колоректального рака

Чтобы выявить значения уровня экспрессии гена с-MYC для жизнеспособности раковых клеток, провели ингибирование гена с-MYC в обеих клеточных линиях.

Число апоптотических клеток подсчитывали после прижизненного окрашивания флуоресцентными красителями. Предварительно во всех лунках оценивали конфлюентность. Подсчет проводили визуально, не менее, чем в 10 полях на лунку. Вначале общее количество клеток подсчитывали под проходящим светом, потом микроскоп переводили во флуоресцентный режим и проводили подсчет апоптотических и мертвых клеток. В клетках обоих культур определили число апоптотических клеток.

Обнаружено, что после подавления гена с-MYC апоптоз в культуре клеток НТ-29 в 2-3 раза превышает апоптоз в культуре клеток Сасо2. При этом, в культуре НТ-29 наблюдался значительно больший апоптотический эффект относительно ничем не обработанных клеток, и клеток, обработанных случайной последовательностью нуклеотидов (Табл 1, Рис. 2).

Таблица 1 Сравнение апоптотического эффекта при ингибировании гена с-MYC на культурах клеток полипозного колоректального рака

Культура клеток	Гибель клеток в контроле, без подавления гена с-MYC	Гибель клеток при подавлении гена с-MYC	Гибель клеток при добавлении олигонуклеотида со случайной последовательностью нуклеотидов
НТ-29	1-2%	15-17%	8-10%
Сасо2	2-3%	6-7%	6-8%

1-Культура Caco2, контрольные клетки. Окрашиваются единичные апоптотические клетки (1-3%).	2-Культура НТ-29, контрольные клетки. Окрашиваются единичные апоптотические клетки (1-3%).	3–Культура Сасо2 с блокированным геном c-MYC. Гибель клеток 6-7%.	4–Культура НТ-29 с блокированным геном c-MYC. Гибель клеток 15-17%.

Рис. 2 Фотографии клеток рака толстой кишки НТ-29 и Caco2 под флуоресцентным микроскопом.

К генам, играющим ключевую роль в развитии колоректального рака, относится также ген KRAS. Изучен апоптотический эффект, вызываемый ингибированием гена KRAS «дикого» типа. В культуре клеток НТ-29 этот ген не имеет мутации. Поставлены эксперименты на культуре клеток НТ-29 с ингибированием гена KRAS. Апоптоз при этом составил 14%. Это значение не сильно отличалось от ингибирования гена с-MYC (17%). Для усиления апоптотического эффекта поставлены эксперименты по совместному ингибированию этих генов, в результате общий апоптотический эффект составил 30% (Рис. 3).

Рис. 3 Апоптотические эффекты при ингибировании генов c-MYC и KRAS

Полученный данные показывают, что эффект совместного ингибирования генов c-MYC и KRAS носит аддитивный характер.

В то же время, уровень стимулирования апоптоза при блокировании генов с-MYC и KRAS, относящихся к ключевым для развития колоректального рака, в исследованных клетках рака этой локализации недостаточен для применения такого подхода в терапевтических целях.

Актуальным является создание препаратов для комплексной терапии, включающей стандартную химиотерапию в сочетании с таргетными препаратами. Для химиотерапевтического воздействия выбран препарат оксалиплатин.

2.  ЗАВИСИМОСТЬ АПОПТОТИЧЕСКОГО ЭФФЕКТА ОТ ДОЗЫ И ВРЕМЕНИ ВОЗДЕЙСТВИЯ ОКСАЛИПЛАТИНА

Основным направлением настоящей работы явилась разработка основ нового перспективного противоопухолевого средства, которое могло бы свести к минимуму побочные эффекты от воздействия химиопрепарата и при этом добиться максимального апоптотического эффекта. Работу проводили на культивируемых клетках полипозного колоректального рака с мутацией в гене АРС (НТ-29). Для химиотерапевтического воздействия выбран один из наиболее современных препаратов, используемых при лечении рака кишечника, - оксалиплатин. Оксалиплатин – это препарат третьего поколения, имеющий в своем составе атом платины (Liu H. F. et al. 2010). При применении в стандартных дозировках, оксалиплатин имеет много побочных эффектов (Nannizzi S. et al, 2010).