Занятие №15
Иммунохимический анализ при химико-токсикологических исследованиях
Структура занятия
I. Входной тест по теме занятия.
II. Лабораторно-практическое занятие. «Проведение химико-токсикологического анализа биоматериалов методами иммуноферментного, радиоиммунного анализа, флуоресцентно-поляризационного иммуноанализа, (ИФА/РИА/ФПИА) и методом иммунохроматографии».
III. Итоговый тест.
Целевые задачи:
- изучить классификацию методов ИФА; провести сравнительную оценку различных схем проведения ИФА
- изучить метод иммунохроматографии (тест-полоски), освоить подходы к интерпретации результатов;
- изучить принцип метода флуоресцентно-поляризационного иммуноанализа и его применение в химико-токсикологическом анализе (прибор TDx). Оценить преимущества метода по сравнению с ИФА и РИА.
Краткое теоретическое введение
Количественное определение наркотических или лекарственных веществ в сыворотке крови и других биологических жидкостях при низких содержаниях (10-6–10-9 нг/мл) в присутствии других соединений можно проводить методами иммунохимического анализа.
Основные понятия, используемые в иммунохимическом анализе
Антигены – чужеродные для организма вещества, способные вызывать образование специфических антител и соединяться с ними. Роль антигена могут играть клетки микроорганизмов, вирусы, белки, высокополимерные нуклеиновые кислоты, сложные полисахариды. Это полноценные антигены; их молекулярная масса превышает 10 000 г/моль.
Существуют также неполноценные антигены - гаптены. Они лишены иммуногенности, т. е. не способны вызывать образование иммуноглобулинов, но могут соединяться с искусственно полученными специфическими антителами. Антитела к гаптенам образуют при их посадке на полимерную матрицу, в качестве которой используют белки, синтетические полиэлектролиты. Таким способом получают антитела к лекарственным и наркотическим веществам и другим низкомолекулярным соединениям.
Антитела – группа структурнородственных гликопротеидов, вырабатываемых клетками иммунной системы в ответ на введение антигена и способных специфически связываться с ним. В иммунохимических методах предпочтение отдается моноклональным антителам (МАт). Они секретируются in vitro иммунокомпетентными клетками, происходящими от единственной антителообразующей клетки. Поэтому МАт направлены только против определенной антигенной детерминанты иммуногенного вещества.
Для детектирования результатов иммунохимической реакции один из компонентов реакции (гаптен или антитело) метят специальной меткой. В зависимости от природы применяемой метки и способа ее детектирования существуют несколько видов иммунохимического анализа (табл. 15.1).
Таблица 15.1
Классификация иммунохимических методов анализа
Метод | Способ детектирования |
Иммуноферментный анализ (ИФА) | Ферментная активность |
Флуоресцентно-поляризационный иммуноанализ (ФПИА) | Интенсивность флуоресцентной поляризации |
Радиоиммунный анализ (РИА) | Радиоактивность |
Люминесцентный иммуноанализ (ЛИА) | Интенсивность люминесценции |
Иммуносенсорные методы | Электрический сигнал |
Спин-иммунологический анализ (СИА) | Электронный спин-резонанс сво-бодных радикалов |
Металлоиммуноанализ (МИА) | Атомарные спектры поглощения |
Нефелометрические иммунометоды | Преломление света |
1. Иммуноферментный анализ
ИФА – иммунохимический метод анализа, заключающийся в выявлении антигенов (Аг) с помощью специфичных к ним антител (Ат); при этом один из участников иммунологической реакции конъюгирован с ферментом-меткой.
Данный метод основывается на принципиальном научном открытии, заключающемся в способности комплекса антитело–фермент (Ат*) или антиген–фермент (Аг*) сохранять функциональную активность каждого компонента, т. е. расщеплять субстрат и связывать антигены/антитела.
Возможность применения ферментов в качестве меток обусловлена чрезвычайно высокой чувствительностью регистрации ферментов в растворе, которая обеспечивается способностью одной молекулы фермента катализировать превращение большого числа молекул субстрата. Наибольшее распространение в ИФА получили пероксидаза, щелочная фосфатаза, β-галактозидаза.
Количественная оценка содержания определяемого вещества после протекания иммунохимической реакции может быть проведена без предварительного физического разделения меченых (*) лигандов (Ат* или Аг*) от образовавшихся иммунокомплексов. Такой ИФА может быть реализован в однофазной системе и поэтому называется гомогенным. Другой подход заключается в разделении продуктов иммунохимической реакции с помощью твердой фазы, связывающей меченый реагент. Это – гетерогенный, или твердофазный, ИФА.
Принцип твердофазного иммуноферментного анализа состоит в том, что антитело иммобилизуется на каком-либо твердом носителе, например, полистирольных планшетах. Возможен конкурентный и неконкурентный вариант анализа.
Образцы сыворотки крови, содержащие определяемое вещество (Аг), помещают в лунки планшета, на стенках которых сорбированы антитела Ат, способные специфически связывать Аг (рис. 15.1).
Рис. 15.1 Конкурентный вариант гетерогенного ИФА
Одновременно в инкубационную смесь вносят известное количество антигена, химически связанного с ферментом, так называемый конъюгат (Аг*). Конъюгат и определяемый антиген биопробы конкурируют между собой за связывание с ограниченным числом сорбированных антител. После того как связывание антигенов произошло, поверхность полистирола отмывают для удаления несвязанных Аг и Аг*. Для определения количества связавшегося конъюгированного антигена в лунки вносят раствор хромогенного субстрата, и окрашенные продукты ферментативной реакции определяют фотометрически. Чем большее количество конъюгата свяжется с антителами, сорбированными на стенках лунки, тем выше содержание окрашенного продукта ферментативной реакции. Вместе с тем, чем больше определяемого антигена в тестируемой пробе, тем меньше конъюгата будет связываться с антителами. Количественная оценка осуществляется с помощью градуировочной кривой, которую строят по стандартным образцам.
Неконкурентный вариант ИФА– ELISA (enzyme linked immunoadsorbent) assay – метод определения фермента, связанного с иммуносорбентом.
В лунки полистирольного планшета с сорбированными антителами (Ат1) вносят аликвоту анализируемого образца, содержащего антиген (Аг) (рис.15.2). При этом определяемый антиген образует иммунокомплекс (Ат1-Аг) на поверхности лунок. Планшет отмывают от несвязавшихся компонентов и добавляют меченные ферментом вторые антитела (Ат2*). После вторичной инкубации и удаления избытка конъюгата антител с ферментом определяют ферментативную активность носителя, которая пропорциональна содержанию исследуемого антигена. На стадии выявления специфического иммунокомплекса антиген оказывается как бы зажатым между молекулами иммобилизованных и меченых антител, что послужило поводом для широкого распространения в литературе названия сандвич-метод, или двухцентровый метод. Схема может быть использована для анализа только тех антигенов, на поверхности которых существуют по крайней мере две расположенные далеко друг от друга антигенные детерминанты, а для определения большого числа моновалентных антигенов (например, низкомолекулярные гормоны, лекарственные и наркотические вещества, пестициды) метод неприемлем.
Рис. 15.2. Неконкурентный вариант гетерогенного ИФА.
В гомогенном ИФА все компоненты реакции — антитела, определяемое вещество (Аг), меченое определяемое вещество (Аг*), хромогенный субстрат —находятся в растворе. На первой стадии в реакционной среде присутствуют одновременно три компонента: аликвота анализируемой биопробы, конъюгат (определяемое вещество с ферментной меткой) и антитело. Вследствие обратимости реакции связывания антитело — антиген определяемое вещество биопробы и конъюгат конкурируют между собой за ограниченное число мест связывания антитела.
На второй стадии анализа к реакционной смеси добавляют хромогенный субстрат, который под действием фермента-метки претерпевает химическое изменение, превращаясь в окрашенное соединение. Полученная окраска регистрируется визуально или с помощью спектральных методов. При связывании меченого антигена с антителом активность фермента-метки в реакции с хромогенным субстратом снижается за счет пространственных изменений белка (фермента), т. к. блокируется доступ субстрата к ферментативным центрам (рис. 15.3).
Рис. 15.3. Торможение активности ферментной метки после образования иммунокомплекса.
В этом случае окраска анализируемого раствора после добавления субстрата будет прямо пропорциональна концентрации не вступившего в связь с антителом меченого антигена, т. е. прямо пропорциональна концентрации конкурента — наркотика, лекарственного вещества или иного ксенобиотика, находящегося в биопробе. Гомогенный ИФА – всегда конкурентный.
Достоинства ИФА: высокая чувствительность, специфичность и воспроизводимость; экологическая чистота; возможность автоматизированного одновременного тестирования множества образцов; отсутствие сложного процесса пробоподготовки (не требуются тонкая очистка и/или концентрирование).
Гомогенный ИФА более экспрессный, время проведения анализа занимает от 1 до 30 мин. Предел обнаружения составляет от 10-4 до 10-6г/мл. Гомогенный ИФА используется при скрининге большого числа образцов для предварительного установления факта употребления наркотических средств.
Недостатки ИФА: влияние фона на результат анализа, наличие в тестируемых образцах модификаторов активности ферментов (кофакторов, ингибиторов); возможность денатурации ферментов под действием внешних факторов; применение метода возможно лишь к хорошо изученным системам, где есть очищенные антигены и высокоспецифичные антитела.
Для уменьшения вероятности получения ложноположительных результатов ИФА используют в сочетании с соответствующими хроматографическими подтверждающими методами.
2. Радиоиммунный анализ
РИА – иммунохимический метод анализа, основанный на выявлении комплекса антиген–антитело с помощью радиоизотопной метки. Наиболее часто в качестве метки используют изотопы 14С, 3Н (β-излучатели) и 125I (γ-излучатель). Необходимым условием высокой чувствительности РИА является высокая специфическая радиоактивность меченого вещества, что может быть достигнуто в основном при использовании изотопов с γ - излучением.
Определяемое наркотическое или лекарственное вещество является антигеном, а радиоактивным индикатором служит меченый антиген. При оптимальном подборе концентраций основных реагентов и условий проведения происходит конкурентная реакция меченого Аг* и немеченого Аг с определенным количеством специфического Ат. По завершении инкубации количество меченных иммунных комплексов обратно пропорционально количеству немеченого антигена в пробе. Затем к реакционной смеси добавляют вещество с большой молекулярной массой, которое специфически связывается с антителами в составе иммунных комплексов. При этом иммунные комплексы, имеющие большую молекулярную массу, чем свободные антигены, осаждают центрифугированием и измеряют радиоактивность осадка. Оценку радиоактивности производят с помощью сцинтилляционных счетчиков. Концентрацию антигена в пробе определяют по калибровочной кривой. Для ее построения используют несколько стандартных калибровочных растворов с известными концентрациями немеченого антигена.
Достоинства РИА: определение веществ в минорных концентрациях 10-3 –10-6 нг/л; высокая специфичность – способность системы измерять только одну, строго определенную субстанцию; высокая воспроизводимость получаемых результатов.
Недостатки РИА: короткий срок «жизни» антител и антигенов, меченных радиоактивными изотопами, ограниченный периодом полураспада изотопа; высокая стоимость разового определения, обусловленная стоимостью регистрирующей аппаратуры; отсутствие полевых вариантов регистрирующей аппаратуры; усиленные меры по технике безопасности, связанные с радиационным риском для персонала; риск загрязнения окружающей среды радиоактивными продуктами.
3. Флуоресцентно-поляризационный иммуноанализ
ФПИА - гомогенный конкурентный метод иммунного анализа, основанный на двух принципах: конкурентного связывания белков и флуоресцентной поляризации. Для проведения этого анализа используется метка – флуоресцеин, который поглощает голубой свет и флуоресцирует зеленым после времени жизни в возбужденном состоянии примерно в течение 4 нс. Если молекулу флуоресцеина возбуждать плоско-поляризованным светом, то она будет излучать также поляризованный свет. Степень поляризации обратно пропорциональна углу поворота молекул за время между возбуждением и излучением. Время, требуемое молекуле для поворота на определенный угол–период вращательной релаксации для молекулы. Период вращательной релаксации мал (1 нс) для небольших молекул(флуоресцеин) и значительно возрастает(100 нс) для крупных молекул, например для иммуноглобулина. Период вращательной релаксации молекулы в растворе прежде всего зависит от ее размера.
Взаимосвязь между размером молекулы и поляризацией флуоресценции может быть применена для реакции антиген-антитело. Флуоресцентная поляризация и период вращательной релаксации маленькой метки возрастают, как только антиген свяжется с антителом. Участниками реакции в методе ФПИА являются определяемый в биологической жидкости антиген, конъюгат антигена с меткой-флуоресцеином и специфические антитела к ним (рис. 15.4).
Антитело
Определяемый свободный
антиген
Конъюгат антиген-флуоресцеин
Рис. 15.4. Участники реакции в методе ФПИА.
Антиген, предположительно присутствующий в образце, и антиген с флуоресцентной меткой конкурируют между собой за места связывания на антителах.
Если образец имеет высокую концентрацию определяемого антигена, то по закону химического равновесия произойдет его преимущественное связывание, а меченый антиген останется свободным (рис. 15.5).
Рис. 15.5. Иммунохимическая реакция при высоком содержании определяемого Аг в биопробе
При возбуждении линейнополяризованным в вертикальной плоскости светом конъюгаты Аг с флуоресцеином быстро вращаются, излучая неполяризованный свет, в результате чего интенсивность вертикально поляризованного света уменьшается.
Если образец имеет низкую концентрацию определяемого антигена, то меченый антиген преимущественно связывается с антителами (рис. 15.6).
Рис. 15.6. Иммунохимическая реакция при низком содержании определяемого Аг в биопробе
Большие молекулы (комплексы, состоящие из молекулы меченого Аг, связанной с Ат) вращаются медленнее, излучая линейнополяризованный свет в той же вертикальной плоскости. В результате интенсивность вертикально поляризованного света возрастает.
Оптическая система ФПИА измеряет интенсивность света, линейно поляризованного в вертикальной плоскости. Изменение интенсивности поляризованного света обратно пропорционально содержанию Аг в образце.
Точная взаимосвязь между интенсивностью поляризации и концентрацией вещества устанавливается путем построения калибровочного графика.
Преимущества ФПИА: высокая чувствительность (до 200 нг/мл); стабильность метки; малая подверженность метки влиянию температуры и рН среды, характерному для фермент-субстратных отношений, а также быстрота и простота проведения анализа.
Под эгидой Постоянного комитета по контролю за наркотиками (ПККН МЗ РФ) выпущены (27.08.2002) «Методические указания по поляризационному флуороиммуноанализу наркотических и одурманивающих веществ в моче и сыворотке крови на TDx-,FLx-анализаторах фирмы “Abbott”. Ниже приведены некоторые извлечения из этого документа, которые касаются особенностей проведения анализа описываемым методом:
1) Отбор и хранение проб: образцы мочи и сыворотки крови собирают и хранят при температуре 2 ÷ 4° С не более 48 ч или замораживают при -20° С;
2) Характеристика набора: набор реагентов предназначен для применения in vitro, рассчитан на проведение 100 определений образцов биожидкостей. Набор состоит из 4 виал с реагентами, и полностью готов к использованию;
3) Реагенты: W - промывочный реактив; S - антисыворотка в разведении, с консервантом и стабилизатором; Т - трейсер в разведении, с консервантом и протеиновым стабилизатором; Р - подготовительный реактив.
4) Работа прибора: в ходе анализа TDx-FLx автоматически выполняет следующие операции:
-отбор заданного объема образца мочи или калибратора и его разбавление буфером в лунке картриджа; отбор 250 мкл буфера и слив в кювету; отбор первой половины разбавленного образца из лунки и слив его в кювету вместе с 750 мкл буфера;
-измерение фоновой интенсивности флуоресценции; отбор 25 мкл раствора трейсера из флакона и слив его вместе с 250 мкл буфера в кювету; отбор 25 мкл раствора, содержащего Ат, из флакона и слив его вместе со второй половиной разбавленного образца и 750 мкл буфера в кювету;
-измерение конечной интенсивности флуоресценции поляризованного света; распечатку значений интенсивности поляризации и найденной концентрации (по калибровочному графику в памяти прибора).
4.Иммунохроматография
Иммунохроматографический тест сочетает в себе хроматографию в тонком слое (ТСХ) и принципы иммунохимии. При погружении полоски в физиологическую жидкость, например в мочу, она выступает в качестве подвижной фазы и начинает мигрировать вдоль полоски. Вместе с жидкостью движутся конъюгаты моноклональных антител с меткой – Ат* (рис. 14.7). Если в этой жидкости присутствует исследуемый Аг (наркотическое или лекарственное вещество), то происходит конкурентная иммунохимическая реакция, в результате которой конъюгат антигена с химической меткой (Аг*), иммобилизованный в тест-зоне (Т), конкурирует с таким же немеченым веществом, предположительно присутствующим в моче, за ограниченное число участков связывания на антителе с меткой (Ат*).
При достаточном количестве Аг в пробе он полностью связывает Ат*, что препятствует их присоединению к конъюгату определяемого вещества в тестовой области. Окрашивание контрольной зоны наблюдается при взаимодействии конъюгатов моноклональных антител с меткой и связанного с ними исследуемого Аг со вторичным Ат, иммобилизованным в контрольной зоне. Таким образом, отсутствие окрашенной полосы в тестовой области и наличие ее в контрольной области указывает на положительный результат анализа.
При отсутствии Аг в моче окрашенный конъюгат антитела с меткой перемещаясь по тест-полоске вместе с пробой, достигает тестовой области полоски с иммобилизованным в ней конъюгатом Аг* и связывается с ним, образуя окрашенную полосу. Таким образом, появление визуально различимой полосы в тестовой (Т) области тест-полоски наблюдается при отрицательном результате теста. Контрольная полоса при этом также окрашена.
|
I
II
 |
Рис. 15.7. Формирование окрашенных зон при иммунохроматографическом анализе с использованием тест-полосок
В Таблице 15.2 представлены пределы обнаружения и кроссреактивность наркотических веществ при использовании тест-полосок:
Таблица 15.2
Пределы обнаружения и перекрестная реактивность для веществ, определяемых методом иммунохроматографии
Анализируемое вещество | Предел обнаружения, нг/мл | Перекрестная реактивность |
Амфетамин | 1000 | Отсутствует на морфин, каннабинол, метамфетамин, фенциклидин, деоксиэфедрин и фенобарбитал (в конц ≥10мкг/мл), имеется на D-Метамфетамин (в конц≥ 15нг/мл) |
3,4-метилен- диокси-N-метиламфет- амин | 500 | Отсутствует на ацетаминофен, алпразолам, аспирин, амфетамин, бромфенирамин малеат, кокаин, кофеин, клонидин, дифенгидрамин, эфедрин, флуоксетин, галоперидол, ибупрофен, метамфетамин, налоксон, пентабарбитал, псевдоэфедрин (в конц≥ 500нг/мл) |
Бензодиазепины | 300 | Отсутствует на морфин, каннабинол, метамфетамин, фенциклидин, деоксиэфедрин и фенобарбитал (в конц 100мкг/мл) |
Кокаин | 300 | Отсутствует на атропин, кофеин, эпинефрин, амитриптилин, фуросемид, лидокаин, прокаин, налоксон, 3-гидрокситирамин (в конц ≥100мкг/мл), имеется на бензоилэкгонин в конц≥ 300нг/мл |
Метадон | 300 | Отсутствует на морфин, каннабинол, метамфетамин, фенциклидин, деоксиэфедрин и фенобарбитал (в конц 10мкг/мл) |
Морфин | 300 | Отсутствует на амфетамин, метамфетамин, каннабинол, деоксиэфедрин, фенциклидин, бензоилэкгонин и фенобарбитал (в конц ≥100мкг/мл), имеется на кодеин, этилморфин, морфина глюкуронид (в конц ≥ 300нг/мл) |
Барбитураты | 300 нг/мл | Отсутствует на морфин, каннабинол, амфетамин, фенциклидин, деоксиэфедрин, бензодиазепин, метамфетамин, кофеин, имипрамин, атропин, кофеин (в конц ≥100 мкг/мл) |
Ограничения иммунохроматографического метода: положительный результат теста указывает лишь на присутствие в пробе наркотического вещества или его метаболитов, тест не является количественным; существует возможность ложного результата ввиду различных факторов, таких как технические ошибки, а также интерференций с некоторыми веществами; анализ не позволяет дифференцировать вещества внутри их структурных групп; данный тест является предварительным, для подтверждения результатов следует применить более специфичный химический метод.
I. Примеры вопросов входного теста
Выберите один или несколько правильных ответов:
1. В основе иммунохимических методов лежит взаимодействие:
a) преципитата с субстратом;
b) антитела с антигеном;
c) сыворотки с иммуноглобулином;
d) комплемента с носителем;
e) флуоресцентной метки с наркотическим веществом.
2. К методам иммунохимического анализа относятся:
a) радиоиммунный анализ;
b) иммуноферментный анализ;
c) поляризационный флуороиммуноанализ;
d) нефелометрический иммуноанализ;
e) гель-электрофорез.
3. При поведении флуоресцентно-поляризационного иммуноанализа значение поляризации будет низким при:
a) высоком содержании наркотического вещества;
b) низком содержании наркотического вещества;
c) независимо от концентрации наркотического вещества.
4. Метка, используемая в иммуноферментном анализе:
a) флуоресцеин;
b) пероксидаза;
c) моноклональные антитела;
d) изотоп йода 125I;
e) глутатионредуктаза.
5. Работа автоматического анализатора ТDx для определения наркотических веществ в крови и моче основана на:
a) нефелометрическом иммуноанализе;
b) люминесцентном иммуноанализе;
c) флуоресцентно-поляризационном иммуноанализе;
d) радиоиммунном анализе;
e) иммуноэлектрофорезе.
6. При положительном результате иммунохроматографического теста проведение подтверждающего анализа:
a) возможно, но необязательно;
b) обязательно;
c) не требуется, если концентрация наркотического вещества превышает 300 нг/мл.
7. К достоинствам флуоресцентно-поляризационного иммуноанализа относятся:
a) стабильность метки;
b) быстрота проведения анализа;
c) простая процедура пробоподготовки;
d) отсутствие влияния фона на результат анализа;
e) проведение подтверждающего анализа при отрицательном результате анализа.
8. Иммунохроматографический анализ характеризуется:
а) отсутствием внутригрупповой специфичности;
b) внутригрупповой специфичностью;
с) вероятностью ложноположительного результата из-за кросс-реактивности.
9. Для проведения иммуноферментной реакции необходимы:
a) хромогенный субстрат;
b) конъюгаты антигена с ферментной меткой;
c) радиоактивный изотоп йода 125I;
d) флуоресцеин;
e) специфичные антитела.
10. При отрицательном результате определения наркотических веществ в моче методом флуоресцентно-поляризационного иммуноанализа проведение подтверждающего теста:
a) возможно, но необязательно;
b) обязательно;
c) требуется, если концентрация наркотического вещества не превышает 200 нг/мл.
11. В иммунохроматографическом методе появление одной окрашенной полосы (только в контрольной зоне) на тест-полоске указывает на:
a) отсутствие наркотического вещества в анализируемом образце;
b) присутствие наркотического вещества в анализируемом образце;
c) ошибку определения.
II. Лабораторно-практическое занятие «Проведение химико-токсикологического анализа биоматериалов методами иммуноферментного, радиоиммунного анализа, флуоресцентно-поляризационного иммуноанализа, (ИФА/РИА/ФПИА) и методом иммунохроматографии».
Подготовьте ответ по индивидуальной карточке заданий для участия в семинаре.
1. Выявление наркотических веществ с помощью тест-полосок.
Отбор пробы и хранение образцов:
Образцы мочи должны быть собраны в стеклянные или пластиковые флаконы, опломбированы и оформлены сопроводительными документами. Хранить образцы мочи следует в холодильнике при температуре -12÷-18° С в замороженном состоянии. Перед выполнением анализа размороженные образцы следует хорошо перемешать. Образцы мочи и компоненты набора полосок должны выдерживаться при комнатной температуре до начала проведения анализа не менее 5 мин.
Материалы и оборудование:
Наборы полосок для иммунохроматографического выявления амфетамина, метамфетамина, морфина, кокаина, барбитуратов, бензодиазепинов в моче; секундомер; емкость для образцов.
Проведение анализа:
В чистую сухую емкость внести анализируемый образец мочи человека (1,5-2,0 мл).
Вскрыть упаковку полоски, разрывая ее вдоль прорези, извлечь полоску и погрузить ее строго вертикально концом со стрелками в мочу до уровня ограничительной линии на 30-60 сек.
Извлечь полоску из мочи, положить ее на ровную чистую сухую поверхность тестовой зоной вверх и через 5 мин визуально оценить результат реакции.
При проведении химико-токсикологического анализа двух образцов мочи на барбитураты с помощью иммунохроматографического метода на тест-полосках наблюдалось следующее (рис. 15. 8).
А Б
Рис. 15.8 Результаты определения барбитуратов в моче помощью тест-полосок
1) В каком случае результат положительный?
2) Какие компоненты входят в состав тест-полоски и как они взаимодействуют с содержащимися в пробе веществами?
3) О чём говорит отсутствие линий на тест-полоске?
2. Выявление наркотических и лекарственных веществ методом ФПИА на приборе TDx.
На рис. 15.9 представлен график, построенный по результатам определения концентрации морфина в моче методом флуоресцентно-поляризационного иммуноанализа.
- Какой параметр отмечен на оси ординат?
- Как этот параметр зависит от концентрации определяемого вещества (прямая или обратная зависимость)?
- Объясните, почему наблюдается данный тип зависимости параметров.
- Назовите достоинства и недостатки данного метода для определения ксенобиотиков в биожидкостях.
Рис. 15.9. Результаты определения концентрации морфина в моче методом флуоресцентно-поляризационного иммуноанализа
3. Расшифровка методов иммунохимического анализа по схемам взаимодействия в системах антиген-антитело.
3.1. Какой метод иммунохимического анализа представлен на схеме (ИФА, РИА, ФПИА, иммунохроматография)?
- Конкурентный или неконкурентный вариант анализа представлен на схеме?
- Какие детекторы используются для данного метода иммунохимии?
- Назовите достоинства и недостатки метода.
Сокращения: АГ–антиген, Ат–антитело, Ф–фермент, С–субстрат.
3.2. Какой метод иммунохимического анализа представлен на схеме (ИФА ФПИА, иммунохроматография)?
- К какой модификации относится данный тип проведения анализа: гетерогенной или гомогенной?
- Возможно ли определение низкомолекулярных веществ (гаптенов) данным методом? Почему?
- Назовите участников данной иммунохимической реакции. Приведите примеры использования данного метода в медицине.
- Объясните причины ограниченного применения данного иммунохимического метода в химико-токсикологическом анализе.
3.3. Какой метод иммунохимического анализа представлен на схеме (ИФА, РИА, ФПИА, иммунохроматография)?
- Назовите основные преимущества данного метода.
- Какие детекторы используются для данного метода иммунохимии?
- Какая часть рисунка (б, в) демонстрирует отсутствие определяемого антигена, как влияет уменьшение количества определяемого вещества на величину аналитического сигнала?
III. Итоговый тест
Образец варианта итогового теста
1. При анализе образца для определения присутствия опиатов методом ФПИА концентрация определяемого вещества превысила пороговую концентрацию(Cut-Off). Это свидетельствует о:
a) присутствии опиатов в образце;
b) отсутствии опиатов в образце;
c) ошибке анализа.
2. Найдите соответствия
1. Специфичность метода 2. Предел обнаружения 3. Надежность метода | a) наименьшая концентрация, которую можно определить над уровнем фонового сигнала; b) мера того, насколько согласованно и воспроизводимо метод дает одинаковый аналитический результат при небольших изменениях рабочих параметров; c) cпособность системы измерять только определенное вещество в присутствии других компонентов пробы; d) возможность одновременного определения нескольких компонентов. |
3. На тест-полоску для определения наркотических веществ в моче наносят:
a) конъюгат выявляемого наркотического вещества в тестовой зоне;
b) конъюгат антител к выявляемому наркотическому веществу в тестовой зоне;
c) моноклональные антитела к наркотическому веществу, перемещающиеся вместе с растворенной пробой;
d) вторичные антитела в контрольной зоне;
e) фермент-пероксидазу;
f) вторичные антигены в контрольной зоне.
4. Найдите соответствия
1. Гаптен 2. Антитело 3. Полноценный антиген | a) при попадании в организм животных и человека вызывают образование иммуноглобулинов; b) лишены иммуногенности; с) гликопротеиды, вырабатываемые в ответ на введение генетически чужеродных веществ в организм; d) имеют 2 и более эпитопа на своей поверхности; е) лекарственные вещества, гормоны, наркотические вещества, пестициды. |
5. При проведении гомогенного иммуноферментного анализа с использованием в качестве субстрата метилумбеллиферил-β-галактозида интенсивность флуоресценции:
a) возрастает с увеличением количества определяемого вещества в пробе;
b) снижается с увеличением количества определяемого вещества в пробе;
c) не зависит от количества определяемого вещества.
6. Определение наркотических и других низкомолекулярных веществ сандвич-методом гетерогенного иммуноферментного анализа:
a) невозможно;
b) возможно;
c) возможно после активации антигена ферментом.
7. Предел обнаружения порядка 10-3–10-6 нг/мл характерен для:
a) радиоиммунного анализа;
b) иммуноферментного анализа;
c) флуоресцентно-поляризационного иммуноанализа;
d) спектрофотометрического анализа;
e) иммунотурбидиметрии.
8. Для скрининга образцов при предварительном установлении факта употребления наркотических средств применяют:
a) гетерогенный ИФА;
b) гомогенный ИФА;
c) неконкурентный ИФА;
d) иммунорадиометрический анализ.
9. Детектор, применяемый в радиоиммуноанализе:
a) фотометр;
b) флуориметр;
c) поляриметр;
d) сцинтилляционный счетчик;
e) масс-спектрометр.
10. Недостатки радиоиммунного метода:
a) короткий срок «жизни» меченых антител и антигенов;
b) высокая стоимость разового определения;
c) отсутствие полевых вариантов регистрирующей аппаратуры;
d) влияние фона на результат анализа;
e) необходимость проверки результата другими методами (ГЖХ, ВЭЖХ).
11. При иммуноферментном определении производных 1,4-бензодиазепина в моче используют конъюгат фермента с:
a) феназепамом;
b) тофизопамом;
c) оксазепамом;
d) лоразепамом;
e) алпразоламом.
12. В иммунохроматографическом методе появление двух окрашенных полос (в тестовой и контрольной зоне) на тест-полоске свидетельствует об:
a) отсутствии наркотического вещества в анализируемом образце;
b) наличии наркотического вещества в анализируемом образце;
c) ошибке тестирования.
13 . К достоинствам иммуноферментного анализа относятся:
a) возможность использовать минимальные объемы исследуемого материала
b) стабильность при хранении всех ингредиентов (до года и более)
c) простота проведения реакции; наличие как инструментального (в качественном и количественном варианте), так и визуального учета
d) возможность автоматизации всех этапов реакции
e) отсутствие влияния фона на результат анализа
Литература
1.Материалы лекций.
2.Токсикологическая химия: Учебник для вузов / Под ред. . – М.: ГЭОТАР-Медиа, 2006. – С. 252-262.
3.Иммуноферментный анализ в клинико-диагностических лабораториях /Издательство «Триада», 2007.–320 с.
4.Иммунология: Учебное пособие/–РИОР Издательский дом, 2007. – 183с.
