Полимеразная цепная реакция
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) - метод амплификации ДНК in vitro, с помощью которого в течение нескольких часов можно выделить и размножить определённую последовательность ДНК в миллиарды раз. Метод ПЦР широко применяется в молекулярно-биологических исследованиях ДНК и РНК, а также в клинической практике для диагностики наследственных болезней, вирусных и протозойных инфекций.
Если в анализируемом образце присутствует искомая ДНК (ДНК-мишень), то в процессе реакции амплификации с ней происходит ряд событий, обеспечиваемых определенными температурными циклами.
Рис. 1. Схема полимеразной цепной реакции. Показаны этапы и их температурные режимы одного цикла ПЦР.
Этапы одного цикла ПЦР. Каждый цикл амплификации состоит из трех этапов:
1. Денатурация. На первом этапе необходимо денатурировать ДНК, находящуюся в образце. Для этого реакционную смесь нагревают до 92-95°С, в результате чего двухцепочечные молекулы ДНК расплетаются с образованием двух одноцепочечных молекул.
2. Отжиг с праймерами. На втором этапе праймеры комплеменарно присоединяются к одноцепочечной ДНК-мишени. Этот процесс носит название «отжиг», которое происходит от английского металлургического термина «annealing», означающего охлаждение сплавов в определенном режиме.
3. Элонгация (синтез новых цепей ДНК). После отжига праймеров Taq-полимераза начинает достраивание второй цепи ДНК, начиная с 3’-конца ДНК-праймера. На третьем этапе температуру в реакционной смеси доводят до оптимума работы Taq-полимеразы, и синтез второй цепи продолжается с максимальной эффективностью.
В дальнейшем этапы денатурации, отжига и элонгации многократно повторяются (30 и более раз). На каждом цикле количество синтезированных копий фрагмента ДНК удваивается.
Необходимые компоненты для ПЦР:
1. ДНК матрица (геномная ДНК, выделенная из клеток)
2. Два ДНК - праймера, комплементарных концевым участкам изучаемого фрагмента ДНК. В качестве праймеров для ПЦР используют короткие цепочки ДНК (олигонуклеотиды), комплементарные концевым участкам ДНК-мишени.
3. Термостабильная Taq-полимераза
4. Дезоксирибонуклеозидтрифосфаты (дНТФ)
5. Ионы магния, необходимые для работы полимеразы
6. Буферный раствор, обеспечивающий необходимый pH среды
Все этапы ПЦР проводят в специальном приборе – автоматическом термоциклере (амплификаторе), в котором программируется время проведения ПЦР и все условия ее проведения.
