Молекулярно-генетический метод
Выделение и анализ молекул ДНК
Выделение ДНК из клеток. ДНК может быть выделена из любого типа клеток. Этапы выделения ДНК включают: быстрый лизис клеток, удаление с помощью центрифугирования фрагментов клеточных органелл, ферментативное разрушение белков и их удаление из раствора с помощью фенола и хлороформа, осаждение молекул ДНК с помощью этанола. У человека ДНК чаще всего выделяют из лейкоцитов крови, но можно использовать любые типы клеток, содержащие ядра.
Эндонуклеазы рестрикции. Открытие бактериальных ферментов, обладающих эндонуклеазной активностью – рестрикционных эндонуклеаз или рестриктаз, значительно продвинуло исследование структуры ДНК. Рестриктазы узнают специфические последовательности из 4-6, реже 8-12 нуклеотидов в двунитевой молекуле ДНК и разрезают ее на фрагменты в участках локализации этих последовательностей, называемых сайтами рестрикции. В настоящее время известно более 500 разных типов бактериальных рестриктаз, каждый из которых узнает свою специфическую последовательность.
Электрофорез в геле. Образующиеся в результате рестрикции фрагменты ДНК можно разделить путем электрофореза в агарозном или полиакриламидном геле. Под действием электрического тока фрагменты ДНК движутся в геле с разной скоростью в зависимости от их размера. Таким образом, можно упорядочить по длине фрагменты ДНК и выявить их в геле при специфическом окрашивании бромистым этидием и просматривании геля в ультрафиолетовой части спектра.
При обработке эндонуклеазами геномной ДНК, в частности, ДНК человека, образуется так много фрагментов ДНК различной длины, что их невозможно разделить с помощью электрофореза. Идентификация фрагментов ДНК в таком геле возможна при помощи метода блот-гибридизации по Саузерну, названного так по имени ученого, предложившего этот метод в 1971 году.
Блот-гибридизация по Саузерну. Вестерн и Нозерн – блоттинг
Водородные связи между парами оснований в молекуле ДНК являются непрочными, поэтому цепи ДНК могут легко разделяться (денатурировать) и восстанавливаться при изменении температуры или солевых концентраций. При каждом цикле денатурации-восстановления двунитевая структура - дуплекс. Устойчивость дуплекса определяется степенью комлементарности нитей ДНК. Наиболее устойчивые структуры представлены полностью комплементарными нитями ДНК.
Это свойство широко используется в молекулярной биологии для поиска и идентификации необходимых последовательностей в огромных молекулах ДНК с помощью специфических зондов – небольших фрагментов однонитевых ДНК, имеющих радиоактивную метку.
Метод блот-гибридизации по Саузерну является наиболее эффективным методом выявления определенных последовательностей среди электрофоретически разделенных фрагментов ДНК. Этапы Саузерн-блоттинга:
Геномную ДНК разрезают одной или несколькими рестриктазами Фрагменты ДНК разделяют в геле методом электрофореза Затем ДНК подвергается денатурации и переносится с геля на фильтр или мембрану Фиксированную на фильтре ДНК гибридизуют с радиоактивно меченым ДНК - зондом Методом авторадиографии определяют положение искомого фрагмента ДНК на электрофореграмме. Выявляться будут те фрагменты ДНК, которые комплементарны специфическому зонду.Дот-гибридизация – это гибридизация с меченым ДНК зондом препаратов ДНК или РНК, нанесенных в виде капли на твердый матрикс без предварительной рестрикции и электрофореза.
Существуют также методы гибридизации, применяемые для анализа молекул РНК или белков, которые называтся Нозерн-блот и Вестерн-блот, соответственно.
Нозерн-блот – метод гибридизации ДНК-зондов с электрофоретически разделенными молекулами РНК. Вестерн-блот (иммуноблот) – это связывание электрофоретически разделенных белков, нанесенных на фильтр, с мечеными антителами. Название этих методов – дань уважения профессору Э. Саузерну, который внес большой вклад в разработку экспериментальных методов для анализа ДНК.
Гибридизация in situ
Гибридизацию можно проводить не только на геле или на фильтре, но и на гистологических или хромосомных препаратах. Этот метод носит название гибридизации in situ.
Схема блот-гибридизация по Саузерну.
Полимеразная цепная реакция
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) - метод амплификации ДНК in vitro, с помощью которого в течение нескольких часов можно выделить и размножить определённую последовательность ДНК в миллиарды раз. Метод ПЦР широко применяется в молекулярно-биологических исследованиях ДНК и РНК, а также в клинической практике для диагностики наследственных болезней, вирусных и протозойных инфекций.
Если в анализируемом образце присутствует искомая ДНК (ДНК-мишень), то в процессе реакции амплификации с ней происходит ряд событий, обеспечиваемых определенными температурными циклами.
Все этапы ПЦР проводят в специальном приборе – автоматическом термоциклере (амплификаторе), в котором программируется время проведения ПЦР и все условия ее проведения.
Рис. 1. Схема полимеразной цепной реакции. Показаны этапы и их температурные режимы одного цикла ПЦР.
Необходимые компоненты для ПЦР:
1. ДНК матрица (геномная ДНК, выделенная из клеток)
2. Два ДНК - праймера, комплементарных концевым участкам изучаемого фрагмента ДНК. В качестве праймеров для ПЦР используют короткие цепочки ДНК (олигонуклеотиды), комплементарные концевым участкам ДНК-мишени.
3. Термостабильная Taq-полимераза
4. Дезоксирибонуклеозидтрифосфаты (дНТФ)
5. Ионы магния, необходимые для работы полимеразы
6. Буферный раствор, обеспечивающий необходимый pH среды
Этапы одного цикла ПЦР. Каждый цикл амплификации состоит из трех этапов:
1. Денатурация. На первом этапе необходимо денатурировать ДНК, находящуюся в образце. Для этого реакционную смесь нагревают до 92-95°С, в результате чего двухцепочечные молекулы ДНК расплетаются с образованием двух одноцепочечных молекул.
2. Отжиг с праймерами. На втором этапе праймеры комплеменарно присоединяются к одноцепочечной ДНК-мишени. Этот процесс носит название «отжиг», которое происходит от английского металлургического термина «annealing», означающего охлаждение сплавов в определенном режиме.
3. Элонгация (синтез новых цепей ДНК). После отжига праймеров Taq-полимераза начинает достраивание второй цепи ДНК, начиная с 3’-конца ДНК-праймера. На третьем этапе температуру в реакционной смеси доводят до оптимума работы Taq-полимеразы, и синтез второй цепи продолжается с максимальной эффективностью.
В дальнейшем этапы денатурации, отжига и элонгации многократно повторяются (30 и более раз). На каждом цикле количество синтезированных копий фрагмента ДНК удваивается.
