Лабораторная работа 22
Химические свойства пигментов листа
Важнейшими компонентами фотосинтетического аппарата растений являются пигменты. Пигменты делятся на два класса: тетрапиррольные соединения (хлорофиллы и фикобилины) и полиизопреноидные (каротиноиды).
Фикобилины — это пигменты водорослей. У высших растений обнаружены хлорофилл «а», хлорофилл «b» и каротиноиды. Основным функциональным пигментом является хлорофилл «a», который обнаружен у всех фотосинтезирующих организмов (кроме бактерий). Он служит непосредственным донором энергии для фотосинтетических реакций. Остальные пигменты, лишь передают поглощенную энергию хлорофиллу «а».
По химической природе хлорофиллы «a» и «b» — сложные эфиры дикарбоновой кислоты хлорофиллина и двух спиртов – метилового спирта и фитола (рис. 16). Хлорофилл «b» отличается от хлорофилла «a» лишь тем, что у третьего углеродного атома во втором пиррольном кольце его молекулы метильная группа (-СН3) заменена на альдегидную (-СНО).
Рис. 16 Структурная формула хлорофилла «а»
Функции хлорофилла: 1) поглощает энергию солнечного света; 2) запасает энергию кванта света в виде энергии электронного возбуждения молекулы; 3) преобразует энергию электронного возбуждения в химическую энергию первичного окислителя и восстановителя.
К каротиноидам относятся каротины и ксантофиллы (рис. 17). Каротины — непредельные углеводороды с эмпирической формулой С40Н56. По химической структуре они являются ациклическими, моноциклическими и бициклическими соединениями.
Рис. 17 Структурные формулы каротиноидов и последовательность их превращений
При этом в циклических каротинах шестичленные кольца представлены двумя типами: β-иононовыми и α-иононовыми.
В фотосинтезирующих организмах эта группа желтых пигментов представлена ликопином, α-каротином, β-каротином и γ-каротином. У высших растений основным каротином является β-каротин.
Ксантофиллы — кислородсодержащие производные каротинов, включающие в себя лютеин (С40Н56О2), зеаксантин (С40Н56О4), виолаксантин (С40Н56О4), неоксантин (С40Н56О4) (рис. 17). Среди названных ксантофиллов преобладает лютеин, который по химической структype очень близок к α-каротину, но в отличие от него является двухатомным спиртом, т. е. в каждом ионовом кольце, один атом водорода замещен на гидроксильную группу.
Функции каротиноидов: 1) являются дополнительными пигментами; 2) защищают молекулы хлорофилла от фотоокисления; 3) играют роль в кислородном обмене при фотосинтезе.
Принцип метода: пигменты из растительной ткани извлекают полярными растворителями (этиловый спирт, ацетон), которые разрушают связь хлорофиллов и ксантофиллов с липопротеидами пластид и обеспечивают их полное экстрагирование. Неполярные растворители (петролейный эфир, гексан, бензин и др.) не нарушают связи этих пигментов с белками.
Цель работы: познакомиться с химическими свойствами пигментов листа.
Ход работы: 1. Получение спиртового раствора пигментов. Для получения вытяжки пигментов используют как сырой, так и сухой растительный материал. Высушенные листья предварительно обрабатывают горячей водой, чтобы облегчить последующее извлечение пигментов.
Свежие листья растений (1 г) мелко измельчить ножницами, поместить в ступку и растереть с небольшим количеством СаСО3. Постепенно в ступку приливать 2…3 мл этилового спирта и тщательно растереть навеску до получения однородной массы. Затем прилить еще 5…8 мл спирта, содержимое перемешать. Носик ступки снизу смазать вазелином и по стеклянной палочке содержимое ступки перенести на бумажный фильтр. Полученный фильтрат поместить в пробирку. Спиртовая вытяжка содержит сумму зеленых и желтых пигментов.
2.Разделение пигментов по Краусу основано на различной растворимости пигментов в спирте и бензине. Эти растворители при сливании не смешиваются, а образуют две фазы верхнюю бензиновую и нижнюю спиртовую, благодаря чему и разделяются компоненты смеси пигментов.
В пробирку налить 2…3 мл спиртового экстракта пигментов и добавить 3…4 мл бензина. Содержимое пробирки сильно встряхнуть, предварительно закрыв ее пробкой или большим пальцем, и оставить отстояться. Для лучшего разделения добавить 1…2 капли воды.
По мере расслоения эмульсии верхний бензиновый слой будет окрашиваться в зеленый цвет, из-за лучшей растворимости в нем хлорофиллов. Кроме того, в бензин переходит каротин, но его окраска маскируется хлорофиллом. Ксантофилл остается в нижнем спиртовом слое, придавая ему золотисто-желтую окраску.
Если пигменты разделятся недостаточно четко, добавить 1…2 капли воды и снова встряхнуть. При избытке воды возможно помутнение нижнего слоя, тогда следует прилить немного этилового спирта и взболтать содержимое пробирки.
Зарисовать распределение пигментов в спирте и бензине, сделать выводы о различной их растворимости.
3. Омыление хлорофилла щелочью. При обработке хлорофилла щелочью происходит омыление эфирных групп, т. е. отщепление остатков метилового спирта и фитола (рис. 18). Образуется натриевая соль хлорофиллиновой кислоты, сохраняющая зеленую окраску и оптические свойства хлорофилла, но отличающаяся большей гидрофильностью, по сравнению с нативным пигментом.
.
Рис. 18 Омыление хлорофилла щелочью
В пробирку с 2…З мл спиртового раствора пигментов прилить 1 мл 20% раствора NaOH и взболтать. После смешивания экстракта со щелочью пробирку поместить в кипящую водяную баню, довести до кипения и охладить.
К охлажденному раствору прилить равный объем бензина и несколько капель воды для лучшего разделения смеси. Затем содержимое пробирки резко встряхнуть и дать ему отстояться.
В бензиновый слой перейдут каротин и ксантофилл, а в спиртовый — натриевая соль хлорофиллиновой кислоты.
Зарисовать окраску слоев, указав распределение пигментов3. Получение феофитина и обратное замещение водорода атомом металла. Атом магния слабо удерживается в порфириновом ядре хлорофилла и при осторожном воздействии сильных кислот легко замещается двумя протонами, что приводит к образованию феофитина бурого цвета.
Если на феофитин подействовать солями меди, цинка или ртути, то вместо двух протонов в ядро входит соответствующий металл и вновь восстанавливается зеленая окраска. Однако она несколько отличается от окраски хлорофилла. Следовательно, цвет хлорофиллов зависит от металлоорганической связи в их молекуле.
В пробирку налить 2…3 мл спиртовой вытяжки пигментов и прибавить 1…2 капли 10% раствора соляной кислоты. В ходе реакции зеленый цвет меняется на бурый, при этом хлорофилл превращается в феофитин. Содержимое пробирки разлить в две пробирки.
Одну пробирку с феофитином оставить для контроля, а во вторую поместить несколько кристаллов уксуснокислой меди и нагреть раствор на водяной бане до кипения. После нагревания бурый цвет раствора меняется на зеленый в результате образования хлорофиллоподобного производного меди.
Зарисовать окраску феофитина и медьпроизводного хлорофилла.
Обратное введение магния в феофитин происходит с большим трудом
хлорофиллоподобное производное меди
Оборудование и материалы: 1) свежие листья растений; 2) этиловый спирт; 3) бензин; 4) 20% раствор NaOH; 5) 10% соляная кислота в капельнице; 6) 10% соляная кислота; 7) водяная баня; 8) штатив с пробирками; 9) пипетки на 1 мл или мерные пробирки; 10) воронки; 11) фильтровальная бумага; 12) ступка с пестиком; 13) стеклянные палочки; 14) ножницы.
