Лабораторная работа №3
ОСНОВНЫЕ СВОЙСТВА ФЕРМЕНТОВ
Ферменты (энзимы) – это биокатализаторы преимущественно белковой природы, которые принимают участие в химических реакциях в организме.
Свойства ферментов как биокатализаторов:
1) Специфичность (избирательность) действия. Выделяют такие виды ее:
а) абсолютная специфичность – фермент катализирует превращение только одного субстрата (один фермент – один субстрат). Пример – уреаза, аргиназа, сахараза, лактаза и др.
б) стереоструктурная – фермент катализирует превращение определенного стереоизомера (лактатдегидрогеназа превращает только L-лактат)
в) относительная – фермент катализирует превращение группы веществ с одним типом химической связи (один фермент – одна связь). Пример - пептидазы, эстеразы, гликозидазы.
2) Зависимость скорости ферментативной реакции от температуры. Ферментативные реакции, как и все химические реакции, ускоряются при повышении температуры (в 2-4 раза на каждые 10оС). Однако скорость ферментативной реакции имеет свой температурный оптимум, превышение которого приводит к понижению активности ферментов из-за тепловой денатурации их молекул. Для большинства ферментативных реакций температурный оптимум - 38-40оС, а при 50-60оС и выше скорость ферментативных реакций сильно уменьшается из-за разрушения молекул фермента (искл. - миокиназа не инактивируется даже при 100оС). Зависимость активности ферментов от температуры называется термолабильностью. Ферменты лучше сохраняются при низких температурах – их активность снижается, но денатурации не происходит.
3) Зависимость ферментативной активности от рН среды. Каждый фермент имеет свой рН–оптимум - значение рН, при котором его активность максимальна.
4) Активность ферментов может изменяться под влиянием различных веществ, которые могут повышать (активаторы) или снижать (ингибиторы) скорость катализируемой реакции и т. д.
Работа 1. Специфичность действия ферментов
Каждый фермент действует только на одно веществ или на группу сходных субстратов, что обусловлено соответствием структуры фермента, точнее его активного центра и структуры субстрата. Например, амилаза действует только на крахмал, сахараза - только на сахарозу и т. п.
Оборудование и реактивы: 1% раствор крахмала, 2% раствор сахарозы, пробирки, раствор слюны (1:5), термостат или водяная баня, термометр, 1% раствор йода в йодиде калия, раствор сахаразы, 5% раствор сульфата меди (II) (CuSO4), 10% раствор гидроксида натрия (NaOH).
Приготовление раствора сахаразы: 100 грамм дрожжей (свежих) растирают и заливают водой (400 мл), Через 2 часа отфильтровывают готовый раствор. Хранить в холодильнике.
Ход работы. В две пробирки (№1 и №2) вносят по 10 капель 1% раствора крахмала, в две другие (№3 и №4) - по 10 капель 2% раствора сахарозы. Затем в пробирки №1 и №3 добавляют по 4 капли раствора слюны, а в пробирки №2 и №4 – такое же количество раствора сахаразы. Перемешивают и оставляют в термостате или на водяной бане на 15 минут при температуре 37-38°С. Затем содержимое каждой пробирки делят пополам и проделывают реакции с йодом и Троммера.
Реакция с йодом. К гидролизату добавляют 1 каплю 1% раствора йода в йодиде калия.
Реакция Троммера. К гидролизату добавляют 1 каплю 5% раствора сульфата меди и 4 капли 10% раствора гидроксида натрия и осторожно нагревают до кипения
Оформление результатов. Результаты заносят в таблицу.
пробирка | Субстрат | Фермент | Реакция с йодом | Реакция Троммера |
1 | Крахмал | амилаза | ||
2 | Крахмал | сахараза | ||
3 | Сахароза | амилаза | ||
4 | Сахароза | сахараза |
Вывод. В выводах следует отметить, в какой пробирке и при каких условиях обнаружено действие ферментов и почему.
Работа 2. Влияние температуры на активность ферментов
Ферменты весьма чувствительны к температуре и проявляют свою наивысшую активность при оптимальном ее значении, которая для ферментов тела человека находится в пределах 35-45°С. При высокой температуре (свыше 50°С) их активность снижается, а затем наступает инактивация, так как при этом нарушается структура активного центра и не происходит соединения его с субстратом.
Реактивы и оборудование: 1% раствор крахмала, пробирки, раствор слюны (1:5), термостат или водяная баня, термометр, спиртовка, 1% раствор йода и йодиде калия, 5% раствор сульфата меди (II) (CuSO4), 10% раствор гидроксида натрия (NaOH).
Ход работы. В две пробирки прилить по 10 капель 1% раствора крахмала. Затем в одну из них добавить 5 капель раствора слюны, а в другую - такое же количество предварительно прокипяченной в течение 10 минут слюны (амилаза инактивирована). Пробирки встряхнуть и поставить в термостат или на водяную баню на 15 минут при температуре 37-38°С, после чего с содержимым каждой пробирки (содержимое пробирок делят пополам) проделать реакции с йодом и Троммера.
Оформление результатов. Результаты опыта записать в таблицу:
№ пробирки | Субстрат | Фермент | Реакция | |
с йодом | Троммера | |||
1 | крахмал | амилаза | ||
2 | крахмал | амилаза инактивированная |
Вывод.
Работа 3. Влияние рН среды на активность ферментов
Для каждого фермента существует определение значение реакции среды, при которой он проявляет наивысшую активность. Изменения рН вызывают снижение или полное торможение деятельности фермента. В основе этого лежит нарушение структуры активного центра (при изменении реакции среды происходит изменение заряда функциональных групп, входящих в состав активного центра).
Оборудование и реактивы: 8 пробирок, дистиллированная вода, 0,2% раствор соляной кислоты (НСl), 1% раствор крахмала, раствор слюны (1:10), термостат или водяная баня, 1% раствор йода в йодиде калия.
Ход работы. В 8 пронумерованных пробирок приливают по 1 мл дистиллированной воды, а затем в пробирку №1 вносят 1 мл 0,2% раствора соляной кислоты, перемешивают и отбирают из нее 1 мл смеси, которую переносят в пробирку №2. Перемешивают, отбирают 1мл и переносят в пробирку №3 и так далее. Из пробирки №8 отбирают 1мл и выливают, Таким образом, получаются различные разведения соляной кислоты, которые соответствуют разным значениям рН среды. Показатели рН среды измерить при помощи универсального бумажного индикатора, результаты записать. После этого в каждую пробирку добавляют по 2 мл 1% раствора крахмала и по 1 мл раствора слюны. Пробирки встряхнуть и поставить в термостат или на водяную баню на 15 минут при 37°С. Затем охладить и добавить во все пробирки по 1 капле 1% раствора йода в йодиде калия. Отметить, в каких пробирках произошел полный гидролиз крахмала, какому это соответствует уровню рН, т. е. отметить оптимальные предел рН для амилазы.
Оформление результатов. Результаты заносят в таблицу.
№ пробирки | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 |
рН | ||||||||
Результат реакции |
Вывод.
МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТОВ
Работа 4. Количественное определение активности α-амилазы слюны
по Вольгемуту
Метод основан на определении наименьшего количества амилазы (при максимальном разведении слюны), полностью расщепляющего весь добавленный крахмал. Амилазная активность слюны выражается количеством 0,1% раствора крахмала в миллилитрах, которое расщепляется 1 мл неразведенной слюны при 38°С в течение 30 мин. В норме амилазная активность слюны равна 160-320. Амилазная активность обозначается «А 38°/30/».
Оборудование и реактивы: 10 пробирок, дистиллированная вода, 0,1% раствор крахмала, раствор слюны (1:10), термостат или водяная баня, 1% раствор йода в йодиде калия.
Ход работы. В 8 пронумерованных пробирок наливают по 1 мл воды. В 1-ю из них добавляют 1 мл разведенной в 10 раз слюны. Содержимое этой пробирки перемешивают, несколько раз втягивая и выпуская жидкость из пипетки. Набирают в пипетку 1 мл смеси и переносят ее во 2-ю пробирку. Содержимое этой пробирки перемешивают и 1 мл смеси переносят в 3-ю пробирку и т. д. до 8-й пробирки. Из 8-й пробирки отбирают 1 мл смеси и выливают. Во все пробирки добавляют по 1 мл воды и по 2 мл 0,1% раствора крахмала, перемешивают, встряхивая пробирки, и помещают в термостат при 38°С на 30 мин. После инкубации пробирки охлаждают водопроводной водой, добавляют по 1 капле 1% раствора йода и перемешивают. При реакции с йодом жидкость в пробирках окрашивается в желтый, розовый и фиолетовый цвета. Отмечают последнюю пробирку с желтой окраской, где гидролиз крахмала прошел полностью и делают расчет. Полученные данные заносят в таблицу.
Гидролиз крахмала в присутствии ферментов слюны
при различном ее разведении
Разведение слюны | ||||||||
1:20 | 1:40 | 1:80 | 1:160 | 1:320 | 1:640 | 1:1280 | 1:2560 | |
Пробирки | ||||||||
1-я | 2-я | 3-я | 4-я | 5-я | 6-я | 7-я | 8-я | |
Окраска раствора с йодом | ||||||||
Выводы |
Расчет. Отметив пробирку, где гидролиз крахмала прошел полностью при наименьшем количестве фермента (желтая окраска раствора), по количеству неразведенной слюны в данной пробирке рассчитывают амилазную активность слюны по следующей пропорции:
А мл слюны расщепили 2 мл 0,1% раствора крахмала;
1 мл слюны расщепил Х мл 0,1% раствора крахмала,
где А — количество неразведенной слюны.
Например, желтая окраска появилась в 4-й пробирке, где слюна была разведена в 160 раз;
1/160 мл слюны расщепила 2 мл 0,1% раствора крахмала;
1 мл неразведенной слюны расщепил Х мл 0,1% раствора крахмала:
Х = 2 · 1 · 160 / 1 = 320 мл 0,1% раствора крахмала.
Следовательно, амилазная активность А 38°/30' равна 320.
Контрольные вопросы
1. Какие вещества называют ферментами? Какова их химическая природа?
2. Перечислите основные свойства ферментов как биокатализаторов.
3. Что такое специфичность (избирательность) действия? Какие виды специфичности выделяют?
4. Приведите примеры ферментов, обладающих абсолютной специфичностью.
5. Что такое термолабильность? Каков температурный оптимум большинства ферментативных реакций?
6. Каким образом рН среды влияет на активность ферментов?
7. На чем основан метод определения активности α-амилазы слюны по Вольгемуту?
8. Чем выражается амилазная активность слюны?
