Детерминация и регуляция

ДЕТЕРМИНАЦИЯ И РЕГУЛЯЦИЯ

В онтогенезе непрерывно происходят процессы дифференцировки – возникновения различий между первоначально однородными частями зародыша (клетками, тканями, органами). В ходе дифференцировки изменяется судьба отдельных клеток или частей зародыша. Судьба – совокупность всех изменений, которые произойдут с данной клеткой или участком зародыша в ходе последующего развития.

Важнейшая задача БИР – выяснение причин дифференцировки. Впервые четко вопрос о факторах определения судьбы частей зародыша был поставлен механикой развития (школой В. Ру) в 1880-х годах. Представители этого направления были убеждены, что с помощью грамотно спланированных и тщательно проведенных экспериментов можно составить полный список причин, определяющих судьбу зародыша и его частей. Впоследствии выяснилось, что невозможно однозначно определить причины и механизмы, заставляющие клетку или участок зародыша развиваться в определенном направлении. Но экспериментальная эмбриология, выросшая из механики развития, сыграла огромную роль в расширении знаний и создании системы понятий, без которых невозможно выявить причины развития.

Так, стало ясно, что внутри проблемы дифференцировки важнейшей является проблема взаимоотношений детерминации и регуляции.

ПОНЯТИЕ ДЕТЕРМИНАЦИИ И СВЯЗАННЫЕ С НИМ ПОНЯТИЯ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ЭМБРИОЛОГИИ

Детерминация (от греч. determinare – предопределяю) – процесс определения судьбы данной части зародыша = латентная дифференцировка; возникновение качественных различий между частями зародыша на стадиях, предшествующих появлению морфологически различимых закладок и органов. Термин введен К. Гайдером в 1900 году.

Между понятиями «детерминация» и «дифференцировка» нет четкой границы: детерминация – состояние начальной дифференцировки.

Если судьба закладки уже определена, говорят, что она детерминирована. При пересадке в чуждое ей место она развивается в тот орган, который образует в норме, т. е. не меняет свою судьбу (состояние стабильной детерминации).

Если судьба закладки еще не определена – она не детерминирована: при пересадке она может изменить свою судьбу и развиться в не свойственный ей в норме орган.

Промежуточное положение – лабильная детерминация. У бесхвостых амфибий характерна для стадии бластулы, когда зачатки всех зародышевых листков уже определены, но, будучи пересаженными в другое место зародыша, могут пойти на построение любого органа. Относительно стабильная детерминация наступает на стадии нейрулы, но и она не окончательна.

С понятием детерминации тесно связан целый букет родственных понятий.

Потенция некоторой части зародыша – то, что она может дать вообще (при любых воздействиях, отличных от нормальных).

Тотипотентность (от лат. totus –весь, целый) – способность части зародыша дать начало всем клеточным типам взрослого организма (состояние недетерминированности). Тотипотентна, например, зигота.

Мультипотентность – способность дать начало многим, но не всем клеточным типам взрослого организма (состояние лабильной детерминации).

Унипотентность – способность развиваться лишь в одном-единственном направлении (окончательная или стабильная детерминация).

Проспективный = презумптивный – предполагаемый, будущий.

Проспективная потенция – та, которая может при определенных условиях (отличных от нормы) осуществиться в будущем.

Проспективное значение – то, что данная закладка даст в норме.

Проспективная потенция может быть значительно шире проспективного значения. Например, проспективное значение брюшной ЭКТД – формировать покровы и их производные. Проспективная же потенция брюшной ЭКТД, помимо покровов, позволяет ей развиваться в нервную трубку. Однако, обязательным условием будет воздействие на нее материала хордомезодермы, который в норме располагается под спинной ЭКТД. Возвращаясь к определению детерминации, можно сказать, что

детерминация – это процесс сужения проспективной потенции до проспективного значения.

Одна из главных задач экспериментальной эмбриологии выяснение, на каких стадиях развития происходит это ограничение и насколько оно сильно.

ДЕТЕРМИНАЦИЯ НА РАННИХ СТАДИЯХ РАЗВИТИЯ

1. Стадия яйца. Различия между частями зародыша могут быть выявлены уже на стадии яйца: это различия между частями ооплазмы (ведущий фактор – ООПС, происходящая при оплодотворении). Судьба БМ жестко предопределена тем, какая часть ооплазмы в них попадет. Такие яйца называют мозаичными (характерны для спирально дробящихся – кольчецов, моллюсков и билатерально дробящихся – гребневиков, круглых червей, асцидий). Их развитие – детерминированное.

Особенно наглядно проявляется мозаичность яиц в развитии гребневиков, обладающих в норме восемью радиально симметричными рядами гребных пластинок, расположенных меридионально. При развитии зародыша из ½ яйца получается только 4 ряда гребных пластинок, из ¼ – только 2 ряда.

Если различия в участках цитоплазмы яйца не выявляются – такие яйца называют регуляционными (кишечнополостные, иглокожие, почти все хордовые), а развитие – недетерминированное (регулятивное). При таком развитии детерминация наступает позже: на стадии бластулы или гаструлы.

Одними из наиболее «регуляционных» являются яйца многих гидромедуз, например, Aegineta. У них нормальная особь развивается из 1/32 яйца (из одного БМ на стадии 32 БМ)

NB! Это разграничение относительно: всегда можно найти стадию, когда детерминация еще не наступила, и можно создать условия, при которой у детерминированных зародышей может произойти регуляция. Например, развитие целых организмов из соматических клеток – тоже регуляционный процесс.

2. Стадия дробления. Уже с первых делений дробления между БМ возникают различия не только в качестве цитоплазмы, но и в величине, форме, расположении, количестве соседей и т. п. Все это также способствует ранней детерминации. Ведущим фактором по-прежнему является ООПС (в том числе, происходящая при дроблении), но не меньшую роль приобретает и взаимодействие БМ.

Например, уже на стадии четырех БМ у Spiralia два БМ (А и С) имеют двух соседей, а два (В и D) – трех. У яиц неспирального типа это не имеет значения. В дальнейшем у яиц Spiralia в ходе дробления между БМ вегетативного полюса происходит нечто вроде «борьбы» за «право» уйти с поверхности и вступить в контакт с «анимальными» БМ. Шансы на победу имеют лишь потомки БМ с тремя соседями.

NB! Несмотря на детерминированное развитие, неизвестно, из какого участка цитоплазмы возникнет этот БМ. В экспериментах показано, что из любых, лишь бы в дальнейшем у него было три соседа.

У некоторых моллюсков один из БМ (обычно это 3D) увеличивается в размерах и устанавливает контакты со всеми остальными БМ. В дальнейшем он дает начало МД и значительной части ЭНТД. В эксперименте этот БМ может быть заменен любым другим: если он установит те же контакты, то будет обладать той же морфогенетической судьбой.

У круглых червей, БМ, установивший максимальное количество контактов, дает всю ЭНТД. Этот БМ выделяется уже после третьего деления дробления.

Карты презумптивных зачатков

Независимо от типа развития (детерминированного или недетерминированного) любая бластула, так же как и ЯК, может быть схематически подразделена на территории (участки) судьба которых при нормальном развитии может быть предсказуема. Такие участки называются презумптивными зачатками (от лат. praesumptio – предположение, основанное на вероятности). Обнаружены немецким эмбриологом В. Фогтом, в 1920-х годах. Он прикладывал кусочки агара, пропитанные витальными красителями (кармином, нильским голубым и др.) к бластулам амфибий и прослеживал судьбу окрашенных участков. (Для мелких яиц и яиц с плотными покровами используют другие маркеры: тушь, частички мела, инъекции некоторых флуоресцирующих веществ.) Таким способом создаются карты презумптивных зачатков (fate maps– карты судьбы в англоязычной литературе). Ни одна эмбриональная работа без таких карт немыслима. Современные методы позволяют получить карты презумптивных зачатков и для более ранних стадий, в том числе раннего дробления. В то же время карты не дают сведений о детерминации зачатков, т. е. может или нет их судьба быть переопределена при пересадке.

NB! При детерминированном развитии презумтивные зачатки не меняют свою судьбу при пересадке. При недетерминированном – могут изменить свою судьбу, но в зависимости от стадии развития.

Детерминация при регулятивном развитии

(опыты Г. Шпемана и И. Гольтфретера на амфибиях)

Как уже отмечалось, при регулятивном развитии детерминация наступает позже, начиная со стадии бластулы. В какой последовательности это происходит, можно выяснить, проведя эксперименты с пересадкой отдельных закладок и культивированием их in vitro. Результаты многочисленных экспериментов могут быть сведены к следующим выводам.

Стадия бластулы характеризуется следующими особенностями детерминативных процессов:

·  Бластула делится всего на две области: ЭКТД + МД и ЭНТД.

·  Внутри себя эти области эквипотенциальны (равноправны), т. е. ЭКТД может переходить в МД и наоборот. Точно также глоточная ЭНТД может переходить в кишечную и наоборот. Между собой их потенции различны, т. е. они мультипотентны.

·  При пересадке ЭКТД и МД на место ЭНТД и наоборот, пересаженные участки не меняли характера развития, т. е. эти области уже детерминированы.

·  При эксплантации и культивировании in vitro презумптивная МД проявляла тотипотентность, т. е. давала все ткани зародыша (особенно, дорзальная губа бластопора). Презумптивная ЭКТД давала только покровную, но никогда нейральную ЭКТД. Таким образом, в отсутствие других тканей МД расширяет свои потенции, а ЭКТД сужает.

Более поздние опыты с использованием флуоресцентных маркеров позволили установить, что меняются потенции не только зародышевых листков в целом, но и отдельных клеток. Так, отдельные клетки ЭНТД до стадии средней бластулы тотипотентны, а затем сужают свои потенции.

Сужение потенций клеток ЭНТД в раннем развитии

Стадия	Средняя бластула	Поздняя бластула	Поздняя бластула
Что дают клетки ЭНТД	ЭКТД, МД, ЭНТД	МД, ЭНТД	ЭНТД
потенции	тотипотентность	мультипотентность	унипотентость

Подобные результаты получены и для клеток ЭКТД. Отсюда следует, что процесс детерминации постепенный и проходит три фазы:

·  тотипотентную;

·  мультипотентную;

·  унипотентную. Причем на первых двух фазах в зародыше имеются эквипотенциальные области.

Точность детерминации

Высокая точность встречается очень редко. Например, у коловраток все тело состоит из 959 клеток, при этом: кожа включает 302 клетки; мышцы – 122 клетки; нервная система –247 клеток; глотка – 165 клеток; выделительная система– 24 клетки; половой аппарат – 19 клеток.

У большинства организмов точность утрачивается уже на первых делениях дробления, либо на последующих стадиях. Даже у круглых червей с их высоко детерминированным развитием существует неточность в расположении БМ, а иногда несколько разных, но равноправных способов их взаиморасположения. Таким образом, детерминация связана не со свойствами отдельных клеток, а со свойствами целого организма. Основное свойство детерминации – она идет от целого к частному. Например, можно сказать, что ЯК в целом детерминирована на развитие определенного организма, но до какого-то момента ни одна ее часть в отдельности еще не детерминирована и может изменить свою судьбу в случае нарушения целостности ЯК.

Детерминация при органогенезах.

Поля органов

В период органогенезов, как и при раннем развитии, проявляется основное свойство детерминационных процессов Metazoa – сначала детерминируется целое, а затем его части. Можно сказать, что некий зачаток в целом детерминирован на развитие определенного органа, но до какого-то момента ни одна его часть в отдельности не детерминирована и может изменить свою судьбу. Выделяют:

·  фазу зависимой дифференцировки, когда судьба зачатка зависит от индукторов и других внешних условий;

·  фазу независимой дифференцировки, когда зачаток в целом детерминирован и сохраняет свою судьбу независимо от окружения (например, при пересадке в «чужое» место).

Эмбриональные территории, на которые распространяется состояние целостной детерминации, (т. е. способность развиваться в зачаток того или иного органа) называются полями органов = образовательными полями. Они состоят из зачатка = почки и окружающей территории. Расположение полей органов и представляет собой карту презумптивных зачатков. Можно составлять карты презумптивных зачатков не только целого зародыша, но и отдельных органов.

Свойства полей

1.  Унитарность – внутри поля развивается лишь один зачаток, даже при его экспериментальном увеличении (если к зачатку конечности подсадить другой такой же, то все равно разовьется только одна конечность).

2.  Регуляционность – из любого малого участка поля (у амфибий можно удалить до ¾ зачатка глаза или конечности) возникает столь же целостный орган, хотя и меньшего размера.

3.  Автономность (независимость) – какое-либо воздействие на одно поле не влияет на соседнее (принцип мозаичности зародыша).

4.  Централизованность – по мере удаления от зачатка образовательные возможности поля снижаются.

Поля могут частично перекрываться. Например, в точке, равноудаленной от передней и задней конечности индуктор вызывает образование гибридной конечности.

Поля органов очень небольшие (максимум 1 мм = 100 диаметров клеток), т. к. пространственные сигналы, поддерживающие целостность поля на большие расстояния не распространяются.

ЭМБРИОНАЛЬНЫЕ РЕГУЛЯЦИИ. ЗАКОН ДРИША. ПОЗИЦИОННАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Эмбриональная регуляция – возобновление нормального хода развития зародыша после его естественного или искусственного нарушения, т. е. переопределение судьбы части зародыша (сравни с детерминацией).

Открытие этого процесса в 1891 г. является важнейшим событием в эмбриологии, сопоставимым по значению (наряду с эмбриональной индукцией) с открытием законов Ньютона в физике. Его автор – немецкий эмбриолог Г. Дриш.

Эмбриональная регуляция была обнаружена при разделении путем встряхивания первых двух БМ морского ежа, культивируемых в морской воде без ионов Са2+ (которые способствуют сохранению контактов между клетками). Каждый БМ дробился и дал открытую полушарную «полубластулу», которая затем замкнулась в шар, прошла нормальную гаструляцию, и в результате образовался нормальный зародыш, но в два раза меньше обычного. При этом

·  часть презумптивной ЭКТД ушла внутрь («энтодермализовалась»);

·  часть презумптивной ЭНТД осталась снаружи («эктодермализовалась»);

Таким образом, закладки изменили свою судьбу, т. е. произошло возвращение к нормальному ходу развития зародыша – эмбриональная регуляция.

Рис. 1. Схема, иллюстрирующая процесс эмбриональной регуляции

ЗАКОН ДРИША

На основании этих экспериментов, Г. Дриш сформулировал знаменитый закон:

Судьба каждой части зародыша зависит не от внешних условий или внутренних свойств, а от ее положения в целом зародыше или другими словами

Проспективное значение каждого элемента зародыша есть функция его положения в целом зародыше.

Дриш полагал, что его закон – доказательство исключительности биологических систем и в его основе не могут лежать физико-химические свойства. Он сформулировал философское учение витализм, основанное на признании автономности жизненных явлений и их полной противоположности законам неживой природы.

Однако большинство биологов это учение не приняли, а к середине ХХ века стало очевидно, что в основе закона Дриша все-таки лежат физико-химические факторы. Первым на это указал советский эмбриолог , который предположил, что явления, подобные закону Дриша, объясняются дистантными взаимодействиями клеток неизвестной пока физической природы. Английский эмбриолог Л. Вольперт в связи с законом Дриша ввел широко используемое ныне понятие позиционной информации – т. е. информации, которой клетка располагает о своем положении в целом зародыше. Каждая клетка зародыша в каждый данный момент времени «знает» свое место и в соответствии с ним активирует различные области своего генома.

Факторы позиционной информации, вероятно, универсальны для всех видов, но к настоящему времени изучены недостаточно. Существуют две точки зрения:

·  Факторами позиционной информации являются механические силы растяжения и сжатия, а также давления;

·  Такими факторами являются градиенты концентраций некоторых веществ (морфогенов) в разных участках зародыша. В настоящее время под химическими факторами позиционной информации понимаются градиенты концентрации продуктов особых генов, управляющих развитием – Нох­-генов.

Обе точки зрения имеют экспериментальные подтверждения и, скорее всего, возможны разные варианты у разных видов животных. считает, что на ранних этапах развития решающую роль играют физические, а не химические факторы, которые вступают в силу позже.

Дришевские и недришевские регуляции

1. Дришевские регуляции – это те регуляции, при которых некоторая часть зародыша может дать целый организм (как в классических опытах Дриша). Они возможны лишь при наличии тоти - или мультипотентности и могут рассматриваться как их критерий. К ним, разумеется, применим закон Дриша.

Но имеются такие регуляции дришевского типа, к которым закон Дриша неприменим, т. к. отсутствует «целое». Так, нормальные личинки морского ежа могут развиваться (но не в 100% случаев) из суспензии клеток, взятых со стадии бластулы или гаструлы – яркий пример самоорганизации из совершенно однородного состояния, когда клетки не обладают позиционной информацией, а создают ее заново. При этом ход развития отклоняется от нормы, например, кишечник развивается не инвагинацией, а шизоцельно (путем кавитации), скелет развивается раньше покровов. Однако, в конце концов результатом этого развития будет нормальная личинка. Здесь особенно наглядно проявляется основное свойство регуляции –эквифинальность – достижение одного и того же результата разными способами.

2. Недришевские регуляции (явления сортировки клеток) Гольтфретером в середине 1930-х г. г. Он диссоциировал зародыши амфибий на стадии гаструлы и нейрулы (в воде без Са2+ и Mg2+ они рассыпаются на отдельные клетки) и перемешивал клетки различных зародышевых пластов, а затем (при добавлении Са2+ клетки собираются в агрегаты) наблюдал отмешивание различных типов клеток друг от друга. При этом ЭНТД в виде плотного клеточного агрегата располагалась в центре конгломерата клеток, ЭКТД – на поверхности, а МД – между ними, что соответствует нормальному положению зародышевых пластов.

Недришевские регуляции основаны не на изменении судьбы клеток согласно их изменившемуся положению, а на стойком сохранении каждым типом клеток своих исходных свойств. В основе явлений сортировки – избирательная адгезия клеток, т. е. способность «узнавать» клетки своего типа и слипаться с ними (определяется свойствами клеточных мембран). У большинства многоклеточных (кроме миксомицетов) регуляции этого типа имеют второстепенное значение. Нарушаются при раковых заболеваниях.

Показано, что у низших животных (губки) видовая специфичность перекрывает органную, а у высших – наоборот. Так, диссоциация и перемешивание зародышей различных видов губок приводит к тому, что клетки отмешиваются не по признаку принадлежности к одному зародышевому листку, а по видовому признаку. При перемешивании зародышей амфибий разных видов их клетки отмешаются по признаку принадлежности к зародышевому листку независимо от принадлежности к виду.

Вероятно, недришевские регуляции более древние. Дришевские возникли в связи с образованием крупных ЯК и эпителизированных зародышевых листков, клетки которых не способны в нормальных условиях к перемешиванию и должны подчиняться занятому ими в зародыше положению.

Регуляции на разных стадиях развития

Изучались в основном в двух типах экспериментов: по разделению и слиянию частей зародыша.

Стадия яйца

·  Отрыв части яйца путем отсасывания (даже 1/3 объема) обычно не препятствует развитию (кишечнополостные, полихеты, моллюски, иглокожие, асцидии);

·  Нарушение ООПС путем центрифугирования (в течение 20 мин) не нарушает развития (у червей, моллюсков, морского ежа, амфибий);

·  Слияние ЯК дает нормальных зародышей, но в два раза больших по размеру.

Стадия дробления

·  У морского ежа на втором делении дробления каждый из четырех разделенных БМ даст нормальную личинку, но меньших размеров. На стадии 8-ми БМ нормальное развитие осуществляется из вегетативных БМ, а из анимальных это становится возможным при помещении в слабый раствор Li–.

· При слиянии зародышей на стадии 2-х БМ у тритона получаются целые организмы, но в два раза больше.

·  Случаи, когда разделенные БМ могут дать начало целым зародышам, широко распространены у позвоночных: примерами могут служить монозиготные близнецы и двойниковые уродства.

Так, у кроликов при разделении – на стадии 2-х БМ нормальные крольчата образуются в 30% случаев; – на стадии 4-х БМ – в 19% случаев; – на стадии 8­-ми БМ – в 11% случаев.

У мыши из 4-х БМ образуются 3 бластоцисты, (которые в дальнейшем могут дать нормальных зародышей) и один трофоплазматический пузырек.

Монозиготные близнецы. в человеческой популяции возникают при естественном случайном разделении БМ в 0,25% рождений. В 33% случаев двойни имеют два полных раздельных хориона. Такое возможно при разделении зародыша до пятых суток развития, т. е. до образования трофобласта. Все остальные близнецы имеют общий хорион – их разделение происходит после образования трофобласта. Закладка амниона заканчивается к девятым суткам эмбриогенеза: следовательно, если разделение произошло между пятыми и девятыми сутками (после образования хориона, но до образования амниона), близнецы имеют общий хорион, но разные амнионы. У человека это случается примерно у 75% монозиготных близнецов. Примерно, в 5% случаев встречается один хорион и общий амнион, т. е. разделение имело место после девятых суток. Если у таких эмбрионов еще и было неполное разделение зародышевого щитка, можно ожидать варианты сросшихся «сиамских близнецов».

Стадия бластулы. Проводились в основном, эксперименты по слиянию:

·  У морского ежа слияние двух бластул дает нормальный, но в два раза больше по размерам организм.

·  У мыши слияние диссоциированных клеток разных морул, имеющих различный фенотип (например, по окраске шерсти) приводит к образованию химер (аллофенных особей).

·  Аллофенные особи возможны и у человека. Например, встречаются люди, содержащие половые хромосомы XX и XY в одном организме. Такое может произойти при спонтанном объединении двух ранних зародышей разного пола, до процесса имплантации.

Подводя итог вышесказанному, можно сказать, что в природе не обнаружены виды, у которых отсутствует явление эмбриональной регуляции (она наблюдается даже у высокодетерминированных нематод), так же как и виды, у которых регуляционные возможности беспредельны.

Таким образом, детерминация и регуляция – два взаимодополняющих фундаментальных принципа индивидуального развития организмов. Это подтвердило открытие эмбриональной индукции. При изучении регуляционных явлений у амфибий Г. Шпеман обнаружил, что БМ может дать нормальный зародыш, только если в него попала хотя бы часть материала серого серпа (дорзальной губы бластопора). Именно этот факт подвел его к обнаружению индукционных явлений.