Применение полимеразной цепной реакции для оценки генетической стабильности Lactobacillus bulgaricus при замораживании

УДК 637.146:573

ПРИМЕНЕНИЕ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ ДЛЯ ОЦЕНКИ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ СТАБИЛЬНОСТИ LACTOBACILLUS BULGARICUS ПРИ ЗАМОРАЖИВАНИИ

, д. т.н., , д. т.н.

ФГБОУ ВПО «Кемеровский технологический институт пищевой промышленности», г. Кемерово

Введение

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – экспериментальный метод молекулярной биологии, позволяющий добиться значительного увеличения малых концентраций определённых фрагментов дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) в биологическом материале. Метод ПЦР позволяет за несколько часов проверить генетический материал на наличие в его составе чужеродной или измененной генетической информации путем избирательной амплификации определённого участка ДНК при помощи ферментов в искусственных условиях [1].

Качество кисломолочных продуктов напрямую зависит от применяемой технологии, тщательной селекции, сохранения и последующего культивирования микрофлоры закваски. Замораживание, как и другие существующие на сегодняшний день методы консервации микроорганизмов (высушивание и лиофилизация), заключаются в переводе вегетативных микроорганизмов клеток в анабиотическое состояние. Возникающие при этом стрессовые ситуации вызывают гибель значительной части популяции микроорганизмов, а также приводят к фенотипическим и генотипическим изменениям. Известно, что у клеток бактерий при холодовом шоке индуцируется нуклеаза, поэтому летальное действие низких температур связано с разрушением ДНК [2, 3].

Целью данной работы являлось исследование влияния различных температурных режимов и условий замораживания на генетическую стабильность термофильных молочнокислых микроорганизмов вида Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus.

Материалы и методы

Для получения лабораторных заквасок были использованы лиофилизированные бактериальные заквасочные культуры производства биофабрика»: L. bulgaricus (БПВ – болгарская палочка вязкая, БПНВ – болгарская палочка не вязкая); штаммы L. bulgaricus В-3964 и L. bulgaricus В-6516 из Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) ФГУП ГосНИИгенетика.

В качестве среды культивирования молочнокислых бактерий использовали восстановленное сухое обезжиренное молоко, соответствующие требованиям ГОСТ Р 52090-2003, без посторонних привкусов и запахов, не содержащее ингибирующих веществ.

Стерилизацию молока проводили в автоклаве (стерилизатор паровой серии DGM модель DGM-500) в течение 10-15 минут при давлении 0,1 МПа и при температуре 121 ± 2° С.

Приготовление лабораторной закваски осуществляли в стерильных условиях в боксе БАВ-ПЦР - «Ламинар-С». Заквасочные культуры вносили в охлажденное до 38 – 39° С стерильное молоко и тщательно перемешивали. Сквашивание проводили в термостате ТСО-1/80 СПУ при температуре 40 – 41° С до образования сгустка требуемого качества.

Замораживание заквасок производили при температурных режимах: -45, -25 и -10° С на воздухе и в хладоносителе (этанол). Для замораживания использовали специальные низкотемпературные камеры.

Выделение ДНК бактерий осуществляли с помощью «Набора для выделения геномной ДНК из бактерий» компании «Синтол» (Москва) [4]. Амплификацию гена 16S рРНК проводиди на приборе типа «Терцик» (Москва) с применением термостабильной Taq-полимеразы ("СибЭнзим", Новосибирск) согласно рекомендациям фирмы-производителя полимеразы. Для амплификации использовали видоспецифичные праймеры: 16SbulF: 5’- CAA CAG AAT CGC ATG ATT CAA GTT TG (26) и 16SbulR: 5’- ACC GGA AAG TCC CCA ACA CCT A (22) [4].

Морфологические характеристики культур термофильных молочнокислых бактерий изучали микроскопированием, используя микроскоп фирмы «Rathenow» в иммерсионной системе с объективом 90. Предварительно готовили препараты, окрашенные по Граму и метиленовым синим. Идентификацию бактерий проводили согласно ГОСТ 10444.11-89.

Результаты и их обсуждение

Устойчивость микроорганизмов к замораживанию зависит от нескольких факторов таких как: род и вид микроорганизмов, стадии их развития, температуры, скорости замораживания, среды замораживания и времени хранения. Действие низких температур на микроорганизмы характеризуется внутри - и внеклеточными изменениями. Максимальное повреждающее действие оказывает внутриклеточное образование льда, при этом происходит нарушение плазматических мембран и клеточных оболочек. Кроме того, образование льда приводит к повышению концентрации внутри - и внеклеточных растворов, что ведёт к денатурации белков и нарушению барьеров проницаемости [5].

Свежеприготовленные закваски в стерильных условиях разливали в стерильные пробирки объемом 10 мл и далее замораживали. После замораживания пробирки с заквасками оставляли на хранение в термоизолированных контейнерах при температурах, соответствующих температурам замораживания. Замороженные закваски хранили в течение 6 месяцев. Перед проведением исследований закваски, замороженные при -10° С, размораживали в холодильной камере при температуре 4 – 8° С. Закваски, замороженные при -25° С, -45° С размораживали в водяной бане при 20° С.

Была изучена морфология клеток L. bulgaricus до и после замораживания. Морфология клеток зависит от многих факторов: условий культивирования, возраста культуры, состава среды. При культивировании на среде Lactobacillus MRS Agar бактерии L. bulgaricus имели вид палочек отдельных или собранных в цепочки. Микроскопические картины бактериальных заквасок до замораживания представлены на рис.1.

0,05 (0,01) мл   а	б
Рис. 1. Клетки L. bulgaricus в жидких заквасках – а) БПВ, б) БПНВ

Как видно из рисунка, у вязких заквасочных культур БПВ клетки имеют типичную форму и величину, расположены поодиночке и в цепочках (рис. 1 а,). У невязких заквасочных культур БПНВ клетки удлинены, имеют валютиновые зёрна, расположены поодиночке и в цепочках (рис. 1 б).

Морфологические характеристики изучаемых штаммов L. bulgaricus (В-3964, В-6516) исследовали, используя препараты, окрашенные по Грамму и метиленовым синим, микроскопированием с иммерсией при увеличении 90 × 15. Анализ приготовленных клеточных препаратов штаммов термофильных молочнокислых бактерий разного происхождения с последующим их микроскопированием показал, что все штаммы, выделенные из различных источников, являются грамположительными палочками, одиночными либо расположенными цепочками (табл. 1).

Микроскопическая картина молочнокислых заквасок после замораживания и хранения представлена на рис. 2.

Значительное изменение морфологических свойств было отмечено у всех заквасочных культур после замораживания в воздушной среде при всех температурных режимах, а также при температуре -10° С в хладоносителе. Микроорганизмы имели искривлённые клеточные оболочки, располагались в основном поодиночке (рис. 2 а, б).

Таблица 1.

Культурально-морфологические признаки штаммов лактобактерий

Название штамма	Культурально-морфологические признаки штамма
L. delbrueckii subsp. bulgaricus В-3964	Грамположительные неподвижные палочки, располагаются поодиночке и цепочками. Образуют матовые колонии величиной 2-3 мм в диаметре
L. delbrueckii subsp. bulgaricus В-6516	Грамположительные палочки. Образуют гладкие колонии.

а)	б)	в)
Рис. 2. Клетки L. bulgaricus после замораживания и хранения: в воздушной среде: а) БПВ при -10° С; в среде хладоносителя: б) БПНВ при -10° С, в) БПНВ при -45° С

После замораживания в хладоносителе при температуре -25° С и -45° С микроорганизмы с изменением клеточных оболочек встречались редко в основном у вязких заквасок, располагались поодиночке и цепочками, иногда были удлинённые формы палочек (рис. 2 в). Это говорит о том, что были соблюдены щадящие режимы и условия замораживания и низкотемпературного хранения.

Известно, что в процессе лиофилизации, в результате действия низких температур, возможно появление мутаций и нарушение генетической стабильности многих видов микроорганизмов [6, 7]. При холодовом шоке у клеток бактерий индуцируется нуклеаза, что приводит к разрушению ДНК [2, 3]. Меньшее повреждающее действие на культуры микроорганизмов оказывает криоконсервирование, генетические изменения в этом случае довольно редки, а микроорганизмы имеют более высокий уровень жизнеспособности, чем при высушивании и лиофилизации [2, 8]. Поэтому важным этапом исследований было изучение влияния режимов замораживания и низкотемпературного хранения на стабильность ДНК термофильных молочнокислых бактерий.

Стабильность ДНК бактерий вида L. delbrueckii subsp. bulgaricus оценивали по наличию полосы амплификата длиной 675 п. н. при использовании видоспецифичных праймеров (16SbulF и 16SbulR) [4].

Электрофореграмма продуктов амплификации фрагмента ДНК гена 16S рРНК микроорганизмов бактериальных заквасок, замороженных при минус 45° C представлена на рис. 3.

1 2 3 4 5
	700 300
Рис. 3. Электрофореграмма продуктов амплификации фрагмента ДНК гена 16S рРНК L. delbrueckii subsp. bulgaricus: 1 – БПВ; 2 – БПНВ; 3 – В-3964; 4 – В-6516; 5 – маркер молекулярного веса

Полученные экспериментальные данные свидетельствуют о том, что молекулярный вес и число фрагментов ДНК исследуемых бактерий после замораживания и хранения в течение 6 мес. не изменился и, следовательно, бактерии должны сохранить свои морфологические и биохимические свойства.

Анализ полученных данных позволяет сделать вывод, что температурный режим от -25° С до -45° С при замораживании в хладоносителе является наиболее оптимальным для замораживания и хранения исследованных заквасок термофильных молочнокислых бактерий.

Список литературы

1.  Коваленко, ПЦР для идентификации представителей родов Lactobacillus и Streptococcus / , , // Микробиологический журнал. – 2000. – № 62 (6). – С. 7-14.

2.  Актуальные проблемы криобиологии / под ред. , . – Киев: Наук. думка, 1981. – 608 с.

3.  Головкин, технология пищевых продуктов / . – М.: Легкая и пищевая промышленность, 1984. – 240 с.

4.  Беспоместных родоспецифичных и видоспецифичных праймеров для индикации и идентификации штаммов бактерий рода Lactobacillus bulgaricus / , , // Техника и технология пищевых производств. – 2010. – № 1. – С. 64-68.

5.  Холодовой стресс и биологические системы / Под ред. . – Киев: Наук. думка, 1991. – 176 с.

6.  Осадчая, некоторых факторов на криорезистентность и сохранение жизнеспособности при лиофилизации культур Bacillus subtilis / , , // Биотехнология. – 2002. – № 3. – С. 45-54.

7.  Heckly, R. J. Preservation of microorganisms / R. J. Heckly // Advances in Applied Microbiology. – 1978. – Vol. 24. – P. 1-53.

8.  Kolkowski, J. A. Cryopreservation and freeze-drying of fungi / J. A. Kolkowski, D. Smith // Methods Mol. Biol. –1995. – V. 38. – P. 49-61.

УДК 637.146:573

ПРИМЕНЕНИЕ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ ДЛЯ ОЦЕНКИ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ СТАБИЛЬНОСТИ LACTOBACILLUS BULGARICUS ПРИ ЗАМОРАЖИВАНИИ

, д. т.н., , д. т.н.

ФГБОУ ВПО «Кемеровский технологический институт пищевой промышленности», г. Кемерово

Целью данной работы являлось исследование влияния различных температурных режимов и условий замораживания на генетическую стабильность термофильных молочнокислых микроорганизмов вида Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus.

Генетическую стабильность микроорганизмов вида L. bulgaricus, входящих в состав замороженных бактериальных заквасок, оценивали по сохранению культурально-морфологических признаков, а также по наличию в составе ДНК бактерий чужеродной или измененной генетической информации. Для этого проводили избирательную амплификацию определенного участка ДНК при помощи видоспецифичных праймеров (16S for – 16S rev).

В результате проведения исследований установлено, что температурный режим от -25° С до -45° С при замораживании в хладоносителе является наиболее оптимальным для замораживания и хранения исследованных заквасок термофильных молочнокислых бактерий. Молекулярный вес и число фрагментов ДНК исследуемых бактерий после замораживания и хранения в течение 6 мес. не изменился и бактерии сохранили свои основные культурально-морфологические признаки.