Лабораторная работа № 3
Методы количественного определения активности ферментов
Работа 1. Количественное определение активности каталазы крови
(по Баху и Зубковой)
Цель – определить активность каталазы крови (по Баху и Зубковой)
Фермент каталаза (оксидоредуктаза, КФ 1.11.1.6) содержится в большом количестве в эритроцитах и разлагает перекись водорода с образованием кислорода и воды по уравнению:
2Н2О2 → каталаза О2 + 2Н2О
При количественном определении активности каталазы крови измеряют или количество перекиси водорода, разложенной каталазой, или количество кислорода, выделившегося при этой реакции. Активность каталазы выражают с помощью каталазного числа и показателя каталазы.
Каталазным числом называют количество миллиграммов Н2О2, которое разлагается 1 мкл крови согласно следующей реакции:
2КМnO4 + 5H2O2 + 4H2SO4→2KHSO4 + 2MnSO4 + 8H2O + 5O2
О количестве расщепленной перекиси водорода судят по разности количества КМпО4, израсходованного на титрование до и после действия каталазы.
Показателем каталазы называют дробь, в которой числителем является каталазное число, а знаменателем - число миллионов эритроцитов в 1 мкл исследуемой крови.
При количественном определении активности каталазы нужно сравнивать показатели каталазы, а не каталазные числа, так как фермент содержится почти исключительно в эритроцитах и притом не в гемоглобине, а в строме. Содержание каталазы в крови снижается при ряде заболеваний, таких, как рак, анемия, туберкулез и др.
Материалы исследования и реактивы: | Оборудование: |
1. Кровь | 1. Мерная колба на 100 мл |
2. Перекись водорода, 1% раствор | 2. Автоматические пипетки |
3. Серная кислота, 10% раствор | 3. Секундомер |
4. Перманганат калия, 0,1 н. раствор | 4. Конические колбы на 25 мл |
5. Микропипетка на 0,1 мл | |
6. Бюретка для титрования | |
7. Скарификатор |
Ход работы. 1. Приготовление раствора крови. В мерную колбу на 100 мл наливают около 10 мл дистиллированной воды. 0,1 мл крови вносят в колбу с водой. Пипетку промывают несколько раз, набирая жидкость и выпуская её в мерную колбу. Доливают мерную колбу до метки водой, следовательно, кровь развели в 1000 раз и получили основной раствор крови, в 1 мл которого содержится 1 мкл крови. В этом растворе определяют каталазное число.
2. Приготовление опытных и контрольных проб. В две конические колбы на 25 мл (опытную и контрольную) наливают по 7 мл дистиллированной воды и добавляют по 1 мл основного раствора крови. Контрольную колбочку кипятят в течение 2 мин для разрушения каталазы, а опытную оставляют без изменения. После этого обе колбочки оставляют при комнатной температуре на 10 мин. Затем в каждую колбочку вносят точно 2 мл 1% раствора Н2О2 и оставляют при комнатной температуре на 30 мин.
3. Титрование и расчет. В каждую колбочку приливают по 5 мл 10% раствора Н2SO4 и оттитровывают содержимое колбочки 0,1 н. раствором КМпО4 до розового окрашивания.
Рассчитывают активность каталазы, исходя из того, что на титрование контрольной колбочки, где каталаза разрушена, пойдет больше раствора КМпО4, чем на титрование опытной колбочки. Полученную разность умножают на 1,7 и получают каталазное число для исследуемой крови.
Пример расчета. Грамм-эквивалент Н2О2 равен 17 г. Следовательно, в 1 мл 0,1 н. раствора содержится 11,7 мг Н2О2. 1 мл 0,1 н. КМпО4 эквивалентен 1 мл 0,1 н. Н2О2; умножая 1,7 на разность между количеством миллилитров 0,1 н. КМпО4, пошедшего на титрование в контрольной и в опытной колбочках, получают количество миллиграммов Н2О2, которое разлагается 1 мкл исследуемой крови, т. е. получают сразу каталазное число. В норме каталазное число колеблется от 10 до 15 единиц.
Исходя из того, что в 1 мкл крови содержится около 5 млн. эритроцитов, можно рассчитать показатель каталазы:
Вывод
Работа 2. Определение активности каталазы сырого молока
Цель – определить активность каталазы сырого молока; на основании полученных данных отнести исследуемый объект к нормальному или анормальному молоку.
В основу метода положено определение количества разложенного ферментом пероксида водорода. Каталаза - двухкомпонентный фермент, димер, гемопротеид (в активном центре имеет протогематин). Молекулярная масса фермента 225000...230000, оптимум действия находится при рН 7,0...8,0 и температуре 20...40°С (рJ – при рН 5,4...5,7). Действие каталазы проявляется уже при 0°С, нагревание до 75...80°С разрушает её.
Возможный механизм действия каталазы описывается уравнениями:
Каталаза-FеОН + Н2О2 → Каталаза-FеООН + Н2О
Каталаза-FеООН + Н2О2 → Каталаза-FеОН + О2↑ + Н2О
Активность каталазы выражают в стандартных (Е) и международных (нкат) единицах, а также через объём кислорода, выделившегося из определенного объема молока при определенных условиях.
Зависимость между отдельными единицами активности каталазы: 1 Е = 16,67 нкат = 6,25 см3 кислорода.
Нативная каталаза переходит в молоко из клеток молочной железы, содержится в альбуминовой фракции. Бактериальная каталаза накапливается в молоке при развитии микроорганизмов. Молочнокислая микрофлора каталазу не вырабатывает. Этой способностью обладают психротрофные и гнилостные бактерии. Поэтому определение активности каталазы можно использовать для контроля количества последних в молоке (она может составлять выше16,0 Е).
Повышенная активность каталазы в анормальном молоке позволяет также выявлять его примесь в сборном молоке.
Активность каталазы в свежевыдоенном молоке, полученном от здоровых животных, составляет 4,0 - 16,0 Е, в молозиве 50 - 94, в стародойном молоке – 37 - 50, в маститном - 62 Е и более.
Для определения активности каталазы используют полярографический, манометрический и перманганатометрический методы. Последний метод наиболее точен.
Сущность метода состоит в количественном определении пероксида водорода, разложенного каталазой, содержащейся в 1 см3 молока, за 1 мин при 25°С.
Неразложившийся пероксид водорода оттитровывают раствором перманганата калия в кислой среде (см. реакцию выше).
Количество разложившегося пероксида водорода находят по разнице между контрольным и опытным титрованием.
Материалы исследования и реактивы: | Оборудование: |
1. Молоко сырое | 1. Мерная колба на 200 мл |
2. Перекись водорода, 0,3% раствор | 2. Автоматические пипетки |
3. Серная кислота, 10% раствор 4. Перманганат калия, 0,1 н. раствор | 3. Мерный цилиндр 4. Водяная баня |
5. Секундомер | |
6. Бюретка для титрования |
Ход работы. Перед началом работы часть исследуемого молока кипятят для разрушения каталазы.
В две конические колбы вместимостью 200 см3 пипетками вносят в первую - 2 см3 сырого молока (опытная проба), во вторую - 2 см3 кипяченого молока (контрольная проба). Температура молока (20 ± 1)°С. В обе колбы цилиндром добавляют по 98 см3 дистиллированной воды с температурой (20 ± 1)°С, содержимое колб перемешивают, колбы нагревают на водяной бане до температуры (25 ± 1)°С. Затем в обе колбы пипеткой добавляют по 25 см3 0,3%-ного раствора пероксида водорода, колбы закрывают пробками, их содержимое тщательно перемешивают; колбы помещают в термостат при температуре (25 ± 1)°С. Записывают время начала опыта.
Через 30 мин в обе колбы из бюретки вносят по 5 см3 10%-ного раствора серной кислоты и титруют из бюретки раствором перманганата калия (Сэ = 0,1 моль/дм3) до появления розового окрашивания, не исчезающего в течение 1 мин. Исчезновение окрашивания в более поздний срок связано с окислением органических составных частей молока.
Обработка результатов. Активность каталазы в стандартных единицах рассчитывают по формуле:
где Vk - объем раствора перманганата калия, израсходованного на титрование контрольной пробы, см3;
Vo - объем раствора перманганата калия, израсходованного на титрование опытной пробы, см3;
1,7 - масса пероксида водорода, соответствующего 1 см3 раствора перманганата калия с эквивалентной концентрацией 0,1 моль/дм3, мг;
m - объем молока, см3 (m = 2 см3);
t - продолжительность выдержки молока с раствором пероксида водорода, мин (t = 30 мин);
0,034 - масса 1 мкМ пероксида водорода, мг.
После подстановки известных значений формула принимает вид:
АЕ = (Vk - Vo) · 0,83 (Е)
Примечание. 1. Предлагаемая методика измерения активности каталазы рекомендуется для исследования сырого молока с активностью каталазы не выше 20 Е. 2. При исследовании анормального молока следует брать для анализа не все разведение молока (100 см3), а 20 см3. В этом случае расчетная формула будет иметь вид:
АЕ = (Vk - Vo) · 4,15 (Е)
Вывод
Работа 3. Определение активности сукцинатдегидрогеназы мышц
Цель – определить сукцинатдегидрогеназу мышц.
Сукцинатдегидрогеназа (КФ 1.3.99.1) очень распространена в тканях животных, растений и микроорганизмов, катализирует дегидрирование янтарной кислоты, при котором последняя превращается в фумаровую кислоту:
При добавлении в среду окисленной формы метиленовой синей, восстановленная сукцинатдегидрогеназа передает водород на метиленовую синюю, образуя бесцветное лейкосоединение:
Материалы исследования и реактивы: | Оборудование: |
1. Гомогенат мышц (в 1 мл 100 мг ткани) | 1. Пробирки химические |
2. Фосфатный буфер, рН 6,8, 1/15 М | 2. Автоматические пипетки |
а) 9,078 г однозамещенного кислого фосфорнокислого калия растворяют в 1 л прокипяченной и охлажденной дистиллированной воды | 3. Стеклянные палочки |
4. Термостат | |
5. Ледяная баня | |
б) 11,867 г двузамещенного кислого фосфонокислого натрия (Na2HPO4·12H2O) растворяют в 1 л прокипяченной дистиллированной воды в) смешать полученные растворы в соотношении 1:1 | |
3. Янтарная кислота, 0,01 н. нейтрализованный раствор | |
4. Метиленовая синяя, 0,05% раствор | |
5. Агар-агар | |
6. Лед |
Ход работы. В две пробирки (опытную и контрольную) помещают 2 мл гомогената мышц. Содержимое контрольной пробы кипятят и охлаждают.
В обе пробирки наливают по 1 мл фосфатного буфера рН 6,8, по 2 мл 0,01 н. нейтрализованного раствора янтарной кислоты и по 2 капли 0,05% раствора метиленовой синей.
Заливают содержимое обеих пробирок 2 мл подогретого агар-агара и кладут их на лёд для застывания. Пробирки помещают в термостат при 37°С. Опыт считают законченным, когда в опытной пробирке жидкость будет почти бесцветной. В контрольной пробирке жидкость не изменяет окраску, поскольку фермент денатурируется при нагревании.
Критерием активности сукцинатдегидрогеназы является время обесцвечивания метиленовой синей в присутствии янтарной кислоты в анаэробных условиях.
Работа 4. Определение эффективности пастеризации молока пробой на
лактопероксидазу
Цель – определить активность лактопероксидазы, на основании полученных результатов отнести исследуемый объект к пастеризованному, либо непастеризованному молоку.
Способность пероксидазы выдерживать нагревание до 80°С положена в основу метода контроля высокотемпературной пастеризации молока (ГОСТ 3623-73. «Молоко и молочные продукты. Методы определения пастеризации»).
Фермент пероксидаза относится к классу оксидоредуктаз, катализирует окисление различных соединений в присутствии пероксида водорода вследствие выделения активного атомарного кислорода.
Пероксидаза - двухкомпонентный фермент, димер, гликогемопротеид, его молекулярная масса составляет 76000 - 93000, имеет оптимум действия при рН = 6,0 - 7,0 и температуре 20 - 25°С (рJ фермента = 9,6). Фермент термоустойчив, инактивируется при температуре выше 80°С. Возможна его реактивация после нагревания. Механизм действия фермента описывается уравнением:
Н2О2 → О + Н2О
Нативная пероксидаза (лактопероксидаза) синтезируется клетками молочной железы; часть её поступает в молоко с лейкоцитами (миелопероксидаза). Фермент связан с альбуминовой фракцией молока.
В молоке содержится 3 - 10 мг% пероксидазы, в молозиве её содержание выше. Активность пероксидазы в свежевыдоенном молоке также довольно высока и составляет 370 нкат.
Лактопероксидаза вместе с тиоцианатом и пероксидом водорода входит в антибактериальную систему молока. Так, лактопероксидаза катализирует окисление тиоцианата, а образующиеся продукты (гипотиоцианат и др.) подавляют жизнедеятельность микроорганизмов, особенно грамотрицательных, в том числе патогенных.
Как указывалось выше, пероксидаза расщепляет пероксид водорода с образованием активного атомарного кислорода. Активный кислород окисляет йодид калия, при этом восстанавливается йод.
При наличии крахмала в реакционной смеси она принимает сине-фиолетовое окрашивание.
Материалы исследования и реактивы: | Оборудование: |
Молоко | Мерная колба на 200 мл |
Йодкалиевый крахмал | Автоматические пипетки |
Перекись водорода, 0,5% раствор | Пробирки химические |
Секундомер |
Ход работы. В пробирку вместимостью 10 см3 пипеткой вносят 5 см3 исследуемого молока, 5 капель раствора йодкалиевого крахмала и 5 капель 0,5%-ного раствора пероксида водорода. Содержимое пробирки перемешивают после добавления каждого реактива. Через 2 мин анализируют окрашивание содержимого пробирки.
Оценка результатов. Если окрашивание молока в пробирке не изменилось, то фермент, пероксидаза в нем отсутствовал, следовательно, молоко подвергалось пастеризации при температуре не ниже 80°С.
Появление в пробирке сине-фиолетового окрашивания свидетельствует о наличии пероксидазы. Следовательно, молоко не подвергалось пастеризации или температура пастеризации была ниже 80°С, или пастеризованное молоко было смешано с непастеризованным.
Появление окрашивания в пробирках более чем через 2 мин после добавления реактивов, не указывает на отсутствие пастеризации, так как может быть вызвано разложением реактивов.
Чувствительность метода позволяет обнаружить добавление не менее 5% непастеризованного молока к пастеризованному.
Вывод
Вопросы
1. Какие вещества называются ферментами?
2. Каковы их химическая природа и свойства?
3. Что такое специфичность действия ферментов и как она определяется?
4. Как зависит активность ферментов от температуры?
5. Как влияет величина рН среды на ферментативную активность?
6. Какие вещества называются активаторами и ингибиторами ферментов? Приведите примеры
7. Какие качественные и количественные методы используются для изучения действия ферментов?
8. Что представляет собой единица активности ферментов?
9. На чем основан метод определения активности амилазы и каково диагностическое значение этого определения?
10. Как определяют активность каталазы крови?
11. Каковы основные принципы метода определения активности сукцинатдегидрогеназы в мышцах?
