Спектрофотометрическое определение a-аминокислот в разных условиях проведения реакции с нингидрином

Удк 543.422

СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕСКОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ a-АМИНОКИСЛОТ В РАЗНЫХ УСЛОВИЯХ ПРОВЕДЕНИЯ РЕАКЦИИ С НИНГИДРИНОМ

,

Кафедра аналитической химии

ГОУ ВПО «Кемеровский государственный университет»

*****@***ru

Аминокислоты в организме человека, животных и растений играют важную роль в биосинтезе ряда других биологически активных соединений, различных пептидов и белков. Современное здравоохранение использует ряд лекарственных средств и препаратов, включающих аминокислоты, в том числе, глазные капли. В качестве лекарственных форм для введения препаратов в орган зрения могут использоваться мягкие контактные линзы (МКЛ). Возможность применения МКЛ на основе разработанного в КемГУ материала “Кемерон-1” в качестве средства для введения аминокислоты таурин и антибиотика ципрофлоксацин показана ранее на основании исследований сорбции веществ материалом линзы и последующей десорбции [1].

Для продолжения исследования обменных свойств МКЛ по отношению к таким аминокислотам, как глицин, лейцин и аланин, необходимы методики их определения. На основании анализа литературных данных нами выбран спектрофотометрический метод с использованием нингидриновой реакции a-аминокислот [2,3], приводящей к образованию красителя фиолетового Руэманна (дикетогидринденкетогидринамина). Для проведения реакции используют условия, различающиеся растворителями, рН среды раствора, температурой реакции, введением стабилизирующих окраску добавок.

Задачей настоящей работы является сравнение на примере глицина двух спектрофотометрических методик количественного определения α-аминокислот, отличающихся условиями проведения нингидриновой реакции.

Спектры поглощения растворов регистрировали на спектрофотометре «Shimadzu UV-1700», измерение оптической плотности проводили на спектрофотометре СФ-26 относительно контрольного раствора в кюветах с l = 10 мм. Исходный раствор глицина (2 мг/мл) готовили растворением навески ~ 0,2 г, взятой с точностью 0,0002 г, в мерной колбе на 100 мл. Рабочие растворы глицина для получения градуировочных зависимостей готовили последовательным разбавлением исходного раствора. Выбранные методики отличаются условиями проведения реакции с нингидрином.

При градуировке и проведении анализа по методике I [2] cмешивают 1 мл раствора, содержащего 0,004 - 0,05 мг глицина, с 0,5 мл ацетатного буферного раствора (рН 5,3-5,4) (без NaCN [2]) и 0,5 мл 3%-ного раствора нингидрина в метилцеллозольве (использован этилцеллозольв). Нагревают 15 минут при 100°С, после чего добавляют 5 мл 50%-ного изопропилового спирта и взбалтывают. Реакцию проводили в мерных колбах на 100 мл, не закрывая их пробками (тогда реакция протекает с наибольшим выходом). После охлаждения до комнатной температуры сине-фиолетовый раствор фотометрируют при 570 нм. По методике II [3] к 1 мл раствора α-аминокислоты добавляют 1,1 мл 0,2 % водного раствора нингидрина и нагревают при температуре 120ºС в течение 20 мин (нами использовался нагрев при 100ºС в течение 15 минут, как и в методике I). После охлаждения раствор разбавляют водой до 100 мл и спустя 1 ч после начала реакции определяют значение оптической плотности при длине волны 400 или 568 нм. Метрологических характеристик методик в работах [2,3] не приводится. Методика II привлекает простотой выполнения и большей экономичностью, отсутствием окраски контрольного раствора.

На рис. 1 представлены спектры поглощения продуктов реакции, полученных в условиях методик I и II. Спектры идентичны приведённым в работе [3]. Длинноволновый максимум вблизи 570 нм соответствует поглощению фиолетового Руэманна [2,3]. Различие в выходе продуктов (чувствительности) реакции также согласуется с литературными данными. Градуировочная зависимость (рис.2, а) при получении красителя в водном растворе по методике II имеет нелинейный характер. Она удовлетворительно (R2 = 0,987) описывается уравнением: y = -3,78x2 + 3,52x - 0,006.

Возможно, что нелинейный характер полученной зависимости (рис.2, а) связан с недостаточным количеством вводимого нингидрина, рекомендованного в работе [3]. Проверка правильности результатов анализа контрольного раствора с концентрацией глицина в конечном растворе 0,153 мМ методом «введено – найдено» показала практическое совпадение средних результатов. Однако повторяемость результатов анализа по методике II неудовлетворительна (sr достигает 9,5% при низких концентрациях). Поэтому требуется доработка методики в направлении стабилизации выхода окрашенного продукта (добавление спирта, регулирование рН и др.).

Градуировочная зависимость (рис.2, б), полученная по методике I, линейна в диапазоне концентраций 1,0×10–5 - 1,0×10–4 М (R2 = 0,999) и описывается уравнением y = (14500 ± 800) x. Метрологические характеристики методики: ymin = 0,023 (при 570 нм); предел обнаружения: сmin= 1,5×10–5 М.

Рис. 2. Зависимость оптической плотности продукта реакции от концентрации глицина в конечном растворе: а - по методике с водным раствором нингидрина; б - по методике с раствором нингидрина в этилцеллозольве при рН 5,4.

Полученное значение ε (по концентрации глицина) близко к 14500 М-1×см–1. Причиной более низкой величины ε по сравнению с литературными данными для фиолетового Руэманна (18000-33000 М-1×см–1) может быть замена растворителя на этилцеллозольв и изменение состава буферного раствора (отсутствие NaCN). Однако стабильность окраски продукта реакции в растворе, воспроизводимость аналитического сигнала в данных условиях свидетельствуют о применимости методики анализа для решения поставленных задач. В работе было установлено, что градуировочный график, полученный для глицина, можно использовать для определения аланина в тех же условиях: при введенной саланина = 2,20×10–4 М найдено (2,11±0,13)×10–4 М (п = 3).

Литература

1. Дикунова, свойства мягких контактных линз на основе материала «Кемерон-1» по отношению к таурину и ципрофлоксацину / , , // Вестник Кемеровского государственного университета: журнал теоретических и прикладных исследований. Серия: Химия. – 2007.- №3(31). - С. 84-87.

2. Коренман, анализ: методы определения органических соединений / . – М.: Химия, 1970. – с. 210-218.

3. Симонян, нингидриновой реакции для количественного определения a-аминокислот в различных объектах: методические рекомендации / , , . – Волгоград. – 2007. - 106 с.

Научные руководители – к. х.н., доцент , к. п.н., доцент