Лабораторная работа № 7
ВИТАМИНЫ
Витамины - низкомолекулярные органические вещества, имеющие разнообразную химическую природу; они относятся к незаменимым факторам питания, поскольку в организме человека и животных не синтезируются. Витамины, присутствуя в небольших количествах в пище, обеспечивают нормальное протекание химических процессов и, таким образом, участвуют в регуляции ряда физиологических функций организма.
Витамины отличаются от всех других органических пищевых веществ двумя признаками; они не входят в состав структуры органов и тканей и не используются организмом в качестве источника энергии.
Отсутствие витаминов или недостаточное их содержание в пище приводит к развитию ряда тяжелых заболеваний. Так, цинга, рахит, бери-бери, пеллагра и др., возникают вследствие полного отсутствия витаминов в пище; такое состояние называют авитаминозом. Недостаточное содержание витаминов в пище приводит к гиповитаминозам. Практически встречается именно эта форма заболевания, если со смешанной пищей человек все же получает витамины, но в не достаточном для удовлетворения потребностей организма количестве. Многие нарушения обмена при авитаминозах и гиповитаминозах рассматриваются как следствие нарушения деятельности или активности ферментных систем, поскольку многие витамины входят в состав простетических групп ферментов. Простейшая классификация витаминов основана на физико-химических свойствах, в частности, на растворимости. Поэтому различают витамины, растворимые в воде, и витамины, растворимые в жирах; к первым относятся витамины группы В, а также витамины С, Р и др. К жирорастворимым витаминам относятся витамины А, D, Е, К и F. Следует указать, что по мере установления химической природы витаминов, многие витамины стали обозначать также наименованием, исходя из некоторых особенностей их химического строения.
Большинство витаминов содержится в достаточных количествах в обычных продуктах питания животного и растительного происхождения, таких, как овощи и фрукты, подсолнечное масло, мясо, печень, почки, мозг, молоко, сливочное масло, яйца, хлеб, крупа и др. Некоторые витамины синтезируются микрофлорой кишечника человека в достаточном количестве.
Для открытия и обнаружения витаминов в пищевых продуктах или других биологических объектах обычно пользуются качественными реакциями, основанными на образовании характерной цветной реакции витамина с каким-либо химическим реактивом. Результаты опытов лучше всего представить в виде приведенной таблицы.
Оборудование:
1. пробирки;
2. автоматические пипетки;
3. ступки фарфоровые;
4. колбы мерные на 50 мл;
5. воронки диаметром 3-5 см;
6. бумажные фильтры;
7. колбочки конические для титрования на 25-50 мл;
8. весы;
9. колбы конические на 100 и 150 мл;
10. бюретки на 10 мл;
11. цилиндры на 100 мл;
12. ФЭК-56 (кюветы с рабочей длиной 10 мм);
13. водяная баня;
14. стеклянные палочки.
Материал исследования и реактивы:
1. никотиновая кислота в порошке;
2. 10% уксусная кислота;
3. 5% медь уксуснокислая;
4. 5% пиридоксин;
5. 1% и 5% железо хлорное;
6. шиповник, экстракт шиповника;
7. 5% калий железосинеродистый;
8. 0,01% метиленовая синяя;
9. 10% натрий кислый углекислый;
10. 0,01% и 0,01 н. 2,6-дихлорфенолиндофенол;
11. 2% соляная кислота;
12. 0,1% йод в 0,2% йодиде калия;
13. чай;
14. 0,1 н. перманганат калия;
15. индигокармин: 1 г индигокармина растирают в фарфоровой ступке и растворяют в 50 мл концентрированной серной кислоты; полученный раствор доводят дистиллированной водой до 1 л в мерной колбе и фильтруют через обычный бумажный фильтр; раствор хранят в склянке из темного стекла 7-10 дней;
16. 0,1 % спиртовый раствор витамина Е;
17. 70% азотная кислота;
18. спирт этиловый;
19. 10% спиртовый α-токоферолацетат (для построения калибровочного графика).
Таблица 1 - Качественные реакции на витамины
Исследуемый материал | Наименование витамина | Химическая структура витамина | Употребляемые реактивы | Получаемое окрашивание | Чем обусловлена реакция |
Выводы |
Водорастворимые витамины
Витамин РР (никотинамид, ниацин, противопелларгический витамин)
При недостаточности витамина РР у человека развивается заболевание, известное под названием пеллагры (шершавая кожа). Пеллагра характеризуется поражением нервной системы в виде невритов и тяжелых нарушений психики, поражением кожи и слизистых оболочек в виде дерматита, стоматита и глоссита, и поражением желудочно-кишечного тракта, проявляющимся диареей. Заболевание более распространено в тех районах, где население питается преимущественно кукурузой, которая отличается низким содержанием триптофана, из последнего в организме может образоваться витамин РР. Противопеллагрической активностью, помимо никотиновой кислоты, обладает и ее амид, который встречается в больших количествах в природе, чем свободная никотиновая кислота. В чистом виде никотинамид - бесцветный кристаллический порошок, хорошо растворимый в воде, спирте и органических растворителях.
Работа 1.Проба с медью на никотиновую кислоту
Никотиновая кислота при нагревании с раствором уксуснокислой меди образует синий осадок плохо растворимой медной соли.
Ход работы. Растворяют 10 мг никотиновой кислоты при нагревании в 20 каплях 10% раствора уксусной кислоты. К нагретому до кипения раствору добавляют равный объем 5% раствора уксуснокислой меди. При постепенном охлаждении раствора выпадает синий осадок медной соли никотиновой кислоты.
Витамин В6 (пиридоксин, адермин)
Недостаточность витамина В6 у человека встречается крайне редко. У животных авитаминоз В6 может проявляться отечной формой дерматита на мордочке, лапках и хвосте, а также гипохромной анемией и поражением нервной системы. Активностью витамина В6 обладает группа веществ, производных пиридина и носящих общее название пиридоксин. К ним относятся отличающиеся только характером замещающего радикала в 4-м положении пиридоксол, пиридоксаль и пиридоксамин (см. далее).
Свободные основания этих соединений и их солянокислые соли представляют кристаллические порошки горьковатого вкуса, хорошо растворимые в воде, хуже - в спирте и нерастворимые в эфире и хлороформе. Лекарственная форма витамина В6 - монохлоргидрат пиридоксола, растворим в воде и спирте, выдерживает нагревание в растворах минеральных кислот и щелочей, в нейтральной и щелочной среде легко разлагается на свету. Сильные окислители разрушают его.
Работа 2. Феррихлоридная проба на витамин В6
Бесцветный раствор витамина В6 приобретает красную окраску в присутствии хлорного железа; реакция обусловлена образованием комплексной соли типа фенолята железа красного цвета.
Ход работы. В пробирке смешивают 5 капель 5% водного раствора витамина В6 и 1 каплю 5% раствора хлорного железа и встряхивают ее. Смесь окрашивается в красный цвет.
Витамин С (аскорбиновая кислота)
Недостаточность аскорбиновой кислоты в пище вызывает у человека заболевание, известное под названием скорбута, или цинги. Клинические симптомы недостаточности сначала проявляются быстрой утомляемостью, анемией, головокружением, затем появляется кровоточивость десен, склонность к кровоизлияниям в подкожную клетчатку, признаки нарушения сердечной деятельности, а также резкое снижение сопротивляемости организма инфекциям. Аскорбиновая кислота является лактоном ненасыщенной гексоновой кислоты. Наличие в ее молекуле двойной С2 - С3 связи делает подвижными протоны гидроксильных групп у тех же атомов, что обусловливает кислый характер соединения с резко выраженной редуцирующей способностью. При окислении аскорбиновая кислота переходит в дегидроаскорбиновую кислоту (см. далее).
В чистом виде аскорбиновая кислота представляет собой бесцветные кристаллы без запаха, кислого вкуса, хорошо растворимые в воде и спирте и нерастворимые в большинстве органических растворителей. В кристаллическом виде аскорбиновая кислота устойчива, но в присутствии окислителей легко разрушается в водных и особенно щелочных растворах, образуя щавелевую и треоновую кислоты (см. далее).
Работа 3. Качественные реакции на витамин С
Восстановление феррицианида калия витамином С. Аскорбиновая кислота, содержащаяся в вытяжке из шиповника, восстанавливает железосинеродистый калий К3Fe(CN)6 в железистосинеродйстый калий K4Fe(CN)6, который образует с хлорным железом плохо растворимую в воде соль трехвалентного железа - берлинскую лазурь, выпадающую в виде темно-синего осадка.
Ход работы. При смешивании в каждую из 2 пробирок вносят по 2 - 3 капли 5% раствора железосинеродистого калия и 1% раствора хлорного железа, жидкость приобретает бурую окраску. После добавления в одну из пробирок 5 - 10 капель 1% вытяжки из шиповника, а в другую такого же количества дистиллированной воды, - в первой пробирке жидкость окрашивается в зеленовато-синий цвет и затем выпадает темно-синий осадок берлинской лазури Fe4[Fe(CN)6]3, который при осторожном наслаивании дистиллированной воды становится более отчетливым. Во второй пробирке жидкость не меняет окраски.
Восстановление метиленовой синей и 2,6-дихлорфенолиндофенола витамином С. Вытяжка шиповника, содержащая витамин С, обесцвечивает растворы метиленовой синей и 2,6-дихлорфенолиндофенола, восстанавливая обе краски в лейкосоединения.
Ход работы. В 2 пробирках смешивают по 1 капле 0,01% раствора метиленовой синей и 10% раствора бикарбоната натрия, добавляя затем в одну из них 5 капель 1% вытяжки из шиповника, а в другую - столько же дистиллированной воды. Нагревание пробирок над пламенем горелки приводит к обесцвечиванию жидкости в пробирке с вытяжкой из шиповника.
В другие две пробирки наливают по 10 капель 0,01% раствора 2,6-дихлорфенолиндофенола, добавляя в одну из пробирок 1 каплю 2% раствора соляной кислоты. В этой пробирке раствор окрашивается в красный цвет. При добавлении в обе пробирки 5 - 10 капель вытяжки из шиповника жидкости обесцвечиваются за счет восстановления аскорбиновой кислоты 2,6-дихлорфенолиндофенолом в лейкосоедннение.
Йодная проба на витамин С. Раствор йода в йодиде калия при добавлении к нему вытяжки из шиповника обесцвечивается за счет восстановления аскорбиновой кислотой молекулярного йода и образования йодистоводородной кислоты (см. далее).
Ход работы. В 2 пробирки наливают по 10 капель дистиллированной воды и по 1 - 2 капли раствора йода в растворе йодида калия. В одну пробирку добавляют 10 капель вытяжки из шиповника, в другую столько же дистиллированной воды. В пробирке с вытяжкой из шиповника раствор йода обесцвечивается.
Работа 4. Количественное определение витамина С 2,6-дихлорфенолиндофенолом
Метод количественного определения аскорбиновой кислоты основан на её способности восстанавливать 2,6-дихлорфенолиндофенол, которым титруют исследуемый раствор в кислой среде, предохраняющей аскорбиновую кислоту от разрушения. Точному количественному определению аскорбиновой кислоты могут мешать другие легко окисляемые вещества, такие, как глютатион, цистеин и др.
Ход работы. 1. Приготовление вытяжки из шиповника. Точную навеску шиповника в количестве 0,5 г тщательно растирают в фарфоровой ступке с 2 мл 2% раствора соляной кислоты, затем без потерь (обмывая ступку и пестик тем же раствором соляной кислоты) переносят содержимое ступки в мерную колбу емкостью 50 мл и доводят дистиллированной водой до метки. Содержимое колбы тщательно перемешивают, фильтруют через бумажный фильтр и фильтрат используют для определения витамина С.
2. Титрование. В 2 конические колбочки отмеривают пипеткой по 1 мл фильтрата, добавляют в каждую колбочку по 4 мл 2% раствора соляной кислоты и титруют из бюретки 0,001 н. 2,6-дихлорфенолиндофенолом до появления розового окрашивания, не исчезающего около 30 с (2,6-дихлорфенолиндофенол в щелочной среде имеет синюю окраску, в кислой - красную, а при восстановлении обесцвечивается.)
Расчет количества аскорбиновой кислоты в пробе производят исходя из того, что 1 мл 0,001 н. 2,6-дихлорфенолиндофенола соответствует 0,088 мг аскорбиновой кислоты (молекулярный вес аскорбиновой кислоты равен 176, а грамм-эквивалент - 88 г). При расчете на 100 г вещества необходимо учитывать также разведение и количество исходного вещества.
Если, например, на титрование 1 мл вытяжки из шиповника пошло 1,25 мл 0,001 н. 2,6-дихлорфенолиндофенола, то в 1 мл вытяжки содержится 0,088x1,25= 0,11 мг аскорбиновой кислоты, а в 100 мл вытяжки будет содержаться соответственно 11 мг. При расчете количества витамина С на 100 г шиповника необходима учесть, что навеска его в 0,5 г была помещена в 50 мл, или 1 г в 100 мл, где количество витамина С нам уже известно, а именно 11 мг. Соответственно 100 г шиповника будут содержать 1100 мг витамина С, или 1,1 г, что составляет 1,1%.
Витамин Р (рутин, цитрин)
Витамин Р содержится в тех же продуктах, которые богаты витамином С. Р-витаминной активностью обладают находящиеся в растениях свыше десятка соединений, близких по структуре, имеющих в своей основе скелет флавона и отличающихся различной степенью гидроксилирования флавонового ядра, а также различными гликозидными группировками у 3-го углеродного атома пиранового цикла (см. далее).
Препаратами витамина Р, имеющими практическое значение, являются: 1) цитрин (геспередин), выделяемый из кожуры цитрусовых, 2) препарат, называемый «витамин Р», выделяемый из листьев чайного дерева, 3) рутин (гликозид кверцетина), получаемый из листьев гречихи. Последний имеет следующую структуру (см. далее):
Недостаток витамина Р в пище приводит к повышенной проницаемости кровеносных капилляров, ломкости кровеносных сосудов. Авитаминоз Р обычно сопутствует авитаминозу С. Таким образом, цинга - полиавитаминоз С и Р, при котором такие клинические симптомы, как кровоизлияния в ткани, боль в конечностях, общая слабость и быстрая утомляемость, есть прежде всего выражение авитаминоза Р. Действие его проявляется лишь в присутствии минимальных количеств витамина С.
Высокое содержание витамина Р обнаружено в лимонах, перце, чае, черной смородине.
Работа 5. Количественное определение витамина Р (катехинов) в препаратах из чайного листа (по Левенталю)
В основу определения катехинов положен метод окисления дубильных веществ перманганатом калия. Катехины экстрагируются из чая дистиллированной водой. Водные растворы титруют 0,1 н. КМпО4 в присутствии индикатора индигокармина. Результаты титрования сравнивают со стандартным пересчетным коэффициентом титрования по Левенталю, равным 6,4, так как экспериментально установлено, что 1 мл 0,1 н. КМпО4 окисляет 6,4 мкг рутина.
Ход работы. Навеску чая в количестве 0,25 г заливают 100 мл нагретой до кипения воды и кипятят в течение 5 мин в колбе с воронкой. Полученный экстракт охлаждают, отбирают 2 мл и переносят в другую колбу, куда наливают еще 50 мл дистиллированной воды и 5 мл раствора индигокармина. После приливания индигокармина содержимое колбы окрашивается в интенсивный синий цвет.
Тщательно перемешивая жидкость в колбе, содержимое титруют раствором 0,1 н. КМпО4 до появления желтой окраски через переходные тона - от синего до зеленого и зеленовато-желтого. Для контроля титруют 52 мл воды с внесением в нее 5 мл раствора индигокармина.
Разница между опытным и контрольным титрованием представляет собой количество миллилитров 0,1 н. КМпО4, идущее на окисление катехинов.
Для вычисления результатов анализа пользуются формулой:
,
где х - содержание витамина Р в препарате, %; а - количество 0,1 н. КМпО4 идущее на титрование опытного раствора препарата, мл; б - количество 0,1 н. КМпО4, идущее на контрольное титрование, мл; 6,4 - стандартный пересчетный коэффициент титрования; V1 - объем, в котором растворена взятая для анализа навеска, мл; V2 - объем раствора, взятого для титрования, мл; Р - навеска, мг.
Жирорастворимые витамины
Витамин Е (токоферол, антистерильный)
Недостаточность витамина Е у животных, например у крыс, приводит к бесплодию, которое у самок характеризуется гибелью плода, а у самцов прогрессирующей дегенерацией семенников и полным угнетением сперматогенеза. У других видов животных, у кроликов например, преимущественно поражается мышечная система и основным симптомом авитаминоза Е является мышечная слабость и параличи конечностей.
Витаминной активностью обладает группа веществ. Наиболее активен и широко распространен в природных источниках, которыми являются многие растительные масла, α-токоферол. Последний в своей молекуле содержит ядро хромана и изопреноидную боковую цепь. (см. далее).
α-Токоферол в виде эфира уксусной кислоты выделен как кристаллическое вещество, растворимое в жирах и органических растворителях. Токоферолы, в том числе и α-токоферол, устойчивы к действию щелочей и кислот, при обычных условиях приготовления пищи не разрушаются, однако сильные окислители превращают их в биологически инертные соединения типа хинонов.
Работа 6.Качественная реакция на витамин Е с азотной кислотой
При действии концентрированной азотной кислоты на спиртовой раствор витамина Е последний окрашивается в красный цвет в результате окисления α-токоферола до окрашенных продуктов хиноидного ряда.
Ход работы. В сухой пробирке смешивают при энергичном встряхивании 5 капель 0,1% спиртового раствора витамина Е и 10 капель концентрированной азотной кислоты. Верхний масляный слой расслоившейся эмульсии окрашивается в красный цвет.
Работа 7. Количественное определение витамина Е
Метод основан на колориметрическом измерении интенсивности окраски, возникающей при окислении токоферолов азотной кислотой.
Ход работы. В 2 мерные пробирки помещают по 2,5 мл спиртового раствора витамина Е, приливают по 0,5 мл 70% азотной кислоты и выдерживают в кипящей водяной бане 3 мин. Затем пробирки охлаждают и ставят в темное место на 15 мин. Объем жидкости в каждой пробирке доводят абсолютным этиловым спиртом до 5 мл и перемешивают. Растворы, окрашенные в результате реакции в розовый цвет, фотометрируют на фотоэлектроколориметре с синим светофильтром (470 нм). Концентрацию витамина Е в исследуемом растворе находят по калибровочному графику, где каждому значению найденной экстинкции соответствует определенное содержание витамина Е в 1 мл раствора.
Для построения калибровочного графика используют спиртовой препарат, содержащий в 1 мл 100 мг α-токоферолацетата. 0,5 мл такого препарата растворяют абсолютным спиртом в мерной колбе на 50 мл. В 4 мерные пробирки отмеривают по 0,5; 1; 1,5; 2 мл этого спиртового раствора, содержащего в 1 мл 1 мг α-токоферолацетата, и добавляют абсолютный спирт по 2; 1,5; 1; 0,5 мл соответственно, чтобы общий объем жидкости составлял 2,5 мл.
В пробирках проводят определение витамина Е, как указано выше, и полученные данные оптической плотности растворов используют для построения калибровочного графика. На ось ординат наносят значение экстинкции, на ось абсцисс - соответствующие концентрации витамина Е в 1 мл.
Вопросы:
1. Что такое витамины и почему они так называются?
2. Как классифицируют витамины?
3. Что такое авитаминозы и гиповитаминозы и каковы причины их возникновения?
4. Каковы специфические признаки авитаминозов, вызванных отсутствием в пище витаминов В1 В2, В6, РР и С?
5. Какие заболевания возникают из-за отсутствия в пище витаминов А, D и К?
6. Какие вы знаете качественные реакции на витамины? Приведите примеры.
7. На чем основаны методы количественного определения витаминов Е, С и Р?
8. Какова связь между витаминами и ферментами?
